李 靜 程 蕾 李瑞英 宋安娜 孔俏俏 劉 濤

1. 泰安市中心醫(yī)院生殖遺傳科，山東 泰安 271000；2. 山東大學(xué)附屬生殖醫(yī)院生殖實驗室，山東 濟南 250000

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（recurrent spontaneous abortion，RSA）指的是妊娠20周前與同一性伴侶連續(xù)發(fā)生2次及2次以上的自然流產(chǎn)［1-2］，可引起各種并發(fā)癥甚至不孕［3］。RSA的危險因素有很多，如遺傳、免疫、感染、解剖、內(nèi)分泌、環(huán)境及精神心理因素等，但仍有40%～60%的患者病因不明，歸為不明原因的復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA）［3-6］。

YAP（Yes-associated protein）是Hippo 信號通路下游的主要效應(yīng)分子，Hippo 信號通路是參與胚胎正常發(fā)育、控制器官大小、維持干細(xì)胞全能性的信號傳導(dǎo)通路［6-9］，推測YAP 可能與URSA 的發(fā)生相關(guān)。正常妊娠是由胚胎或胎兒與母體之間相互調(diào)節(jié)的結(jié)果，由多種因子介導(dǎo)，如細(xì)胞因子、組織相容性抗原、激素和血管生成因子［10-12］，這些因子的遺傳多態(tài)性可能與RSA 發(fā)生風(fēng)險有關(guān)。本研究通過Sanger 雙脫氧終止測序法，檢測URSA 患者與可孕婦女YAP基因的外顯子序列，旨在探討YAP基因外顯子基因多態(tài)性與URSA的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2016年1月—2019年12月在泰安市中心醫(yī)院就診的72 例URSA 患者為URSA 組，年齡為19～40歲，平均（30.0±5.8）歲，妊娠20周前發(fā)生自然流產(chǎn)2 次以上，其中流產(chǎn)2、3、4、5、6、7 次的分別有19、28、14、6、1、1 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）夫婦雙方均為漢族人，既往體健，無家族遺傳病史；（2）女性為生育期婦女，常規(guī)行超聲、內(nèi)分泌、抗卵磷脂抗體、抗子宮內(nèi)膜抗體、染色體、傳染病檢査結(jié)果均正常，符合URSA 診斷標(biāo)準(zhǔn)；（3）男性行精液常規(guī)、精液DNA碎片分析、傳染病檢查結(jié)果均正常。對照組為同期于泰安市中心醫(yī)院正常分娩的產(chǎn)婦，共20 例，年齡為20 ～40 歲，平均（28.0±3.2）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）夫婦雙方均為漢族人，既往體健，無家族遺傳病史；（2）女性為生育期婦女，成功分娩1 胎以上，無自然流產(chǎn)史，常規(guī)行超聲、內(nèi)分泌、抗卵磷脂抗體、抗子宮內(nèi)膜抗體、染色體、傳染病檢查結(jié)果均正常；（3）男性無傳染性疾病。研究對象均簽署知情同意書。本研究經(jīng)泰安市中心醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 研究方法

1.2.1 外周血和胎盤絨毛組織DNA抽提 使用核酸提取試劑［安諾優(yōu)達基因科技（北京）有限公司］提取外周血和絨毛組織樣本中的DNA，之后使用分光光度計定量，瓊脂糖凝膠電泳質(zhì)檢，質(zhì)檢合格的DNA調(diào)濃度至50 mg/L，-80 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計合成及PCR擴增 通過Genebank查找人YAP1 基因全外顯子區(qū)域序列，設(shè)計引物并合成備用，各引物序列詳見表1。PCR反應(yīng)體系：2×Phata Max Buffer 25 μL，dNTP Mix 1 μL，10 mmol/L dNTP Mix 1 μL，10 μmol/L 上下游引物各2 μL，50 mg/L DNA 1 μL，2.5 × 106U/L Taq DNA Polymerase 0.5 μL，用去離子三蒸水補齊至50 μL。PCR 反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃3 min，94 ℃變性15 s，56 ℃退火15 s，72 ℃延伸60 s，35 個循環(huán)后72 ℃延伸5 min。反應(yīng)條件因引物、擴增片段長度不同，退火溫度及延伸時間等有差別。每對引物均要摸索最佳反應(yīng)條件。取PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳確定目的片段，PCR 產(chǎn)物純化備用，送樣品至安諾優(yōu)達基因科技（北京）有限公司進行雙脫氧終止測序。測序結(jié)果用DNAMAN軟件與標(biāo)準(zhǔn)序列進行比對，篩查與標(biāo)準(zhǔn)序列不一致的核苷酸位點，獲得SNP位點。

表1 外顯子擴增引物序列

2 結(jié) 果

2.1 引物設(shè)計和PCR擴增

Genebank 數(shù)據(jù)庫查到人類編碼YAP 蛋白的基因為YAP1，共有9 個外顯子區(qū)，總共5 401 bp，分別設(shè)計9 對引物，擴增產(chǎn)物純化后用于測序，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，顯示所有引物均得到了有效目的片段（圖1）。

圖1 不同外顯子PCR產(chǎn)物電泳圖

2.2 SNP分析與確定

所有測序結(jié)果用DNAMAN軟件與標(biāo)準(zhǔn)序列進行比對，URSA組72例和對照組20例中，外周血和絨毛組織YAP1基因的9個外顯子均未檢測到位點突變。

圖2分別為URSA組和對照組第三外顯子測序結(jié)果的序列對比圖，由圖可知，條帶清晰明顯，各個峰型良好，沒有重疊峰，測序結(jié)果可靠，兩組測序得出的序列無差異，均與Genebank中標(biāo)準(zhǔn)序列一致。

圖2 第三外顯子部分測序結(jié)果

3 討論

隨著生殖醫(yī)學(xué)的發(fā)展，URSA 受到越來越多的關(guān)注。研究表明，免疫系統(tǒng)功能異常［13］、胎盤血供異常［14］及精子異常因素［15］等是引起URSA 的重要因素，但對其發(fā)病機制尚未完全闡明。妊娠的成功離不開母胎間免疫平衡的存在和維持，決定妊娠成功與否的免疫學(xué)機制主要取決于胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞與蛻膜層免疫微環(huán)境的相互作用，Th1/Th2平衡向Th1 偏移，Th17/Treg 平衡異常［16］，蛻膜組織中CD56+、CD16+亞型表達升高［17］與URSA 的發(fā)生有一定相關(guān)性。研究發(fā)現(xiàn)，相當(dāng)一部分URSA 的發(fā)生與胎盤中血管增生平衡紊亂、內(nèi)皮細(xì)胞增殖和胎兒血液供應(yīng)不足等密切相關(guān)［18］。VEGF 介導(dǎo)血管生成和調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，因此，子宮內(nèi)膜VEGF 及其受體基因表達的改變和血清VEGF 的變化可能在URSA 的發(fā)病中起重要作用［19］。一項Meta 分析研究表明，RSA 組男性的精子形態(tài)和DNA 碎片指數(shù)與RSA 相關(guān)［15，22］。

Hippo-YAP信號通路中YAP/TAZ-TEAD介導(dǎo)的接觸抑制對胚胎發(fā)育至關(guān)重要，YAP/TAZ介導(dǎo)的細(xì)胞信號在血管生成［20-21］和內(nèi)穩(wěn)態(tài)［22-23］中發(fā)揮重要作用，YAP/TAZ 缺失會導(dǎo)致血管功能受損和胚胎死亡［24］。此外，YAP 缺失會阻礙小鼠心肌細(xì)胞的增殖，導(dǎo)致心肌發(fā)育不良和胚胎死亡［25］。研究發(fā)現(xiàn)，YAP 全身性敲除的小鼠在胚胎發(fā)育第8.5 天死亡［9］。YAP 直接與許多干細(xì)胞相關(guān)基因的啟動子結(jié)合并促進其表達，YAP 敲除可導(dǎo)致胚胎干細(xì)胞多能性喪失［26］。Hippo/YAP 級聯(lián)信號在滋養(yǎng)層和內(nèi)細(xì)胞團細(xì)胞系特異性中起著關(guān)鍵作用，特別是對于滋養(yǎng)層細(xì)胞特異性基因表達，如Cdx2［27］。此外，本團隊證明人巨細(xì)胞病毒通過抑制YAP 的表達降低滋養(yǎng)細(xì)胞（EVTs）的侵襲和增殖（待發(fā)表），表明YAP 在滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲和增殖中也發(fā)揮關(guān)鍵作用。以上研究證明了YAP 在胚胎發(fā)育中的關(guān)鍵性調(diào)控作用，YAP 可能與URSA 的發(fā)生存在聯(lián)系，因此，本研究從YAP 基因多態(tài)性入手，研究與其URSA 的相關(guān)性，旨在為URSA 提供一項新的潛在遺傳標(biāo)志物。

目前基因多態(tài)性在URSA發(fā)病機制中的作用已被深入研究，涉及免疫應(yīng)答、血栓形成、胎盤功能以及性激素受體相關(guān)的基因［28］。免疫應(yīng)答相關(guān)基因TNF rs1800629的A等位基因和IL-6 rs1800795的C 等位基因與URSA發(fā)生有關(guān)［29-30］。血栓形成有關(guān)的基因多態(tài)性也參與RSA發(fā)生，包括PAI-1 rs1799889［31-32］以及MTHFR 的rs1801131 和rs1801133［28］。VEGFA、NOS3和Tp53 的某些遺傳變異都通過調(diào)節(jié)胎盤功能與RSA 顯 著 相 關(guān)［28］。CYP17 rs743542、CYP1A1 rs1048943 和CYP2D6 rs3892097 可 作為RSA 的 潛在生物標(biāo)志物，CYP17 可調(diào)控雄激素和雌激素水平［33］，CYP1A1和CYPA2D6可以保護子宮胎盤環(huán)境免受過度氧化應(yīng)激的影響［34-35］。

本研究對URSA 患者和可孕婦女YAP1 基因9 個外顯子進行SNP 篩查，并分析這些位點突變與URSA的相關(guān)性。通過對YAP基因全部9個外顯子進行測序比對后，URSA 組和對照組的外周血和絨毛組織YAP 基因的9 個外顯子均沒有檢測到位點突變，初步判斷YAP 基因外顯子突變與URSA 發(fā)生無直接關(guān)系。但是并不排除在基因外顯子以外的功能區(qū)存在變異位點并參與URSA發(fā)生，如啟動子、內(nèi)含子及UTR等。一項Meta分析發(fā)現(xiàn)，ACE基因第16 內(nèi)含子的插入或缺失突變與RSA 有關(guān)［36］，NOS3基因第4 內(nèi)含子的27 bp VNTR 多態(tài)性與RSA 的相關(guān)性成為研究熱點［28］。另外，樣本量小或者研究人群的差異也可能造成目前的結(jié)果。研究表明，針對不同人群進行的基因多態(tài)性研究結(jié)果通常不一致［28］。此外，URSA與YAP基因在分子及蛋白水平的相關(guān)性研究也在進行中，相信分子和蛋白水平的研究將取得非常有效的結(jié)果。為更好的了解URSA的致病機制，未來還需要探討YAP基因其他非外顯子功能區(qū)SNP以及分子和蛋白水平與URSA發(fā)生的關(guān)系。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突