牛華鋒，張成東，楊雪嬌，任戰(zhàn)軍，王淑輝，趙永攀

(1.楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院 動物工程分院，陜西楊 凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物科技學(xué)院，陜西 楊凌 7121000；3.陜西畜牧產(chǎn)業(yè)試驗示范中心，陜西 涇陽 713702)

兔肉被譽為“保健肉”、“美容肉”、“益智肉”，其營養(yǎng)價值愈來愈被消費者認(rèn)可，國內(nèi)外市場需求日益增長。培育生長速度快、肉質(zhì)鮮嫩、屠宰率高的肉兔品種，一直是家兔育種工作關(guān)注的熱點。肌肉生長抑制素(myostation，MSTN)，又稱為轉(zhuǎn)化生長因子8(growth differentiation factor 8,GDF-8)，屬于TGF-β超家族[1]，能夠負(fù)調(diào)控骨骼肌的生長，抑制肌肉的生長[2]。大量的研究表明，MSTN基因在哺乳動物中高度保守，MSTN基因突變或敲除后能產(chǎn)生“雙肌癥狀”[3～7]，過表達(dá)則會減少肌肉生長，是影響畜禽產(chǎn)肉性狀狀的主要功能基因之一。分子輔助育種法對于家兔育種至關(guān)重要，SNP(single nucleotide polymorphism ,SNP)是指基因組水平上由單個核苷酸變異引起的DNA序列的多態(tài)性。喬西波等[8](2010)研究了9個純系肉兔及其37個雜交組合的MSTN基因，發(fā)現(xiàn)MSTN基因重要SNP位點突變有利于家兔體軀發(fā)育。張柯等[9]研究發(fā)現(xiàn)兔MSTN基因外顯子1和外顯子2的2個SNP位點(分別是194bP，445bP)，2個位點堿基突變顯著影響兔135日齡全凈膛重、屠宰率和熟肉率。筆者研究比較分析伊拉肉兔和美系獺兔MSTN基因重要SNP位點的基因型及分布情況，探索其對家兔產(chǎn)肉性狀有益的分子標(biāo)記，以期為家兔分子選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

試驗選取陜西天鑫兔業(yè)有限公司的伊拉肉兔和美系獺兔各70只(公母各35只)。心臟采血10 mL，裝入已添加2.5 mL滅菌ACD抗凝劑的離心管中，用冰盒迅速帶回實驗室，-80℃保存。采用酚-氯仿法提取基因組總DNA，-20℃保存。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計 參考http://asia.ensembl.org/ 基因庫中兔子MSTN基因外顯子Ⅰ、外顯子Ⅱ和外顯子Ⅲ序列，并用Primer5設(shè)計引物，擴增片段長度分別為577bp、749bp和668bp左右。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司設(shè)計并合成。引物序列見表1。

表1 MSTN基因外顯子Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的引物序列信息

1.2.2 基因片段的PCR擴增 PCR擴增總體積為50μL，試驗所用2×Taq Master Mix來自康威世紀(jì)，由Taq DNA polymerase、PCR Buffer、Mg2+、dNTPs、藍(lán)色染料以及PCR穩(wěn)定劑和增強劑組成，引物濃度為10pmol/μL，DNA模板濃度為100 ng/μL，PCR各物質(zhì)添加量及所用擴增程序如表2。

表2 PCR擴增體系及其擴增程序

擴增產(chǎn)物(取5μL)用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)檢測擴增結(jié)果。

1.2.3 PCR擴增產(chǎn)物測序 各樣本均取30μL擴增產(chǎn)物和20μL上下游引物，送往生工生物工程(上海)股份有限公司進行純化、測序。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 采用MegAlign，Chromas Application 2.3.0.0軟件對測序結(jié)果進行序列結(jié)構(gòu)分析，通過序列比對和序列峰值校正，篩選出SNP位點，判斷出突變位點的基因型。用PopGene32軟件進行hardy-weinberg平衡檢驗，以及基因型頻率、等位基因頻率、雜合度和有效等位基因數(shù)等遺傳參數(shù)的計算。用PIC計算軟件計算出多態(tài)信息含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴增結(jié)果

用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測MSTN外顯子Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的PCR擴增產(chǎn)物，結(jié)果顯示擴增產(chǎn)物特異性良好，其片段長度分別為668bp、749bp和577bp，片段長度符合預(yù)期，適合進行測序。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1、圖2和圖3。

圖1 外顯子ⅠPCR擴增產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果

圖2 外顯子ⅡPCR擴增產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果

圖3 外顯子ⅢPCR擴增產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果

2.2 PCR產(chǎn)物測序結(jié)果

將樣本PCR擴增產(chǎn)物送往生工生物工程(上海)股份有限公司進行純化、測序。結(jié)果顯示在70只伊拉肉兔和70只美系獺兔MSTN基因中共發(fā)現(xiàn)4個SNP位點，分別位于MSTN基因序列外顯子Ⅰ的111bp處，內(nèi)含子Ⅰ的234bp處，外顯子Ⅱ的338bp處和內(nèi)含子Ⅱ的34bp處。外顯子Ⅲ中則未發(fā)現(xiàn)多態(tài)位點。

2.2.1 MSTN外顯子Ⅰ和內(nèi)含子Ⅰ的測序結(jié)果 測序結(jié)果顯示，MSTN外顯子Ⅰ的SNP位于111bp處，發(fā)生C-T轉(zhuǎn)換，共發(fā)現(xiàn)CC基因型、CT基因型和TT基因型3種基因型(見圖4)。

圖4 MSTN外顯子Ⅰ的3種基因型

內(nèi)含子Ⅰ在的234bp發(fā)現(xiàn)1個SNP位點，發(fā)生G-A轉(zhuǎn)換，共發(fā)現(xiàn)GG基因型、AA基因型和AG基因型3種基因型(見圖5)。

2.2.2 MSTN外顯子Ⅱ和內(nèi)含子Ⅱ的測序結(jié)果 MSTN外顯子Ⅱ在338bp處發(fā)現(xiàn)1個SNP，發(fā)生T-A顛換，共發(fā)現(xiàn)TT基因型、AT基因型和AA基因型3種基因型(見圖6)。

測序結(jié)果顯示，MSTN內(nèi)含子Ⅱ在34bp處發(fā)現(xiàn)1個SNP，發(fā)生C-T轉(zhuǎn)換，共發(fā)現(xiàn)型CC基因型、TT基因型和CT基因型3種基因(如圖7)。

圖5 MSTN內(nèi)含子Ⅰ的3種基因型

圖6 MSTN內(nèi)含子Ⅱ的3種基因型

圖7 MSTN內(nèi)含子Ⅲ的3種基因型

2.3 遺傳多態(tài)性分析

2.3.1 MSTN基因4個SNP位點基因型頻率、等位基因頻率分析 筆者研究對伊拉肉兔和美系獺兔MSTN基因4個SNP位點進行了基因型頻率、等位基因頻率分別進行了分析，結(jié)果見表3～表6。

表3 MSTN外顯子Ⅰ的111bp處基因型頻率和等位基因頻率

由表3可知，伊拉肉兔和美系獺兔的MSTN基因外顯子Ⅰ的111bp處CC基因型頻率顯著高于CT基因型和TT基因型；C等位基因頻率明顯高于T等位基因頻率，是兩兔群體的優(yōu)勢基因。通過Chi-square適合性檢驗，該位點各基因型頻率分布在伊拉肉兔群體中不符合hardy-weinberg平衡(P<0.05)，而在美系獺兔群體中則符合hardy-weinberg平衡(P>0.05)。

表4 內(nèi)含子Ⅰ的234bp處基因型頻率和等位基因頻率

由表4可知，伊拉肉兔和美系獺兔的MSTN基因中內(nèi)含子Ⅰ的234bp處雜合子GA基因型頻率在中最高；G等位基因在伊拉肉兔群體中為優(yōu)勢基因，占0.55；A等位基因在美系獺兔群體為優(yōu)勢基因，占0.5143。通過Chi-square適合性檢驗，該位點各基因型頻率分布在伊拉肉兔群體和美系獺兔群體中均符合hardy-weinberg平衡(P>0.05)。

表5 外顯子Ⅱ的338bp處基因型頻率和等位基因頻率

由表5可知，伊拉肉兔和美系獺兔的MSTN基因中外顯子Ⅱ的338 bp處雜合子TA基因型頻率最高；T等位基因頻率均略高于A等位基因頻率，為優(yōu)勢等位基因。通過Chi-square適合性檢驗，該位點各基因型頻率分布在伊拉肉兔群體和在美系獺兔群體中都符合hardy-weinberg平衡(P>0.05)。

表6 內(nèi)含子Ⅱ的34 bp處基因型頻率和等位基因頻率

由表6可知，伊拉肉兔和美系獺兔的MSTN基因內(nèi)含子Ⅱ的34 bp處雜合子CT基因型頻率最高；T等位基因頻率均略高于C等位基因頻率，為優(yōu)勢等位基因。通過Chi-square適合性檢驗，該位點各基因型頻率分布在伊拉肉兔群體和在美系獺兔群體中均符合hardy-weinberg平衡(P>0.05)。

2.3.2 MSTN基因4個SNP位點遺傳參數(shù)分析 本研究分析了伊拉肉兔和美系獺兔MSTN基因4個SNP位點遺傳參數(shù)，將MSTN基因外顯子Ⅰ的SNP位點記作A，內(nèi)含子Ⅰ的SNP位點記作B，外顯子Ⅱ的SNP位點記作C，內(nèi)含子Ⅱ的SNP位點記作D。由表7可以看出，伊拉肉兔中A位點的雜合度(0.171 4)和期望雜合度(0.286 1)最低，A位點有效等位基因數(shù)在這兩個家兔品種中相對較低(分別為1.396 8和1.618 2)，其他三個多態(tài)位點有效等位基因數(shù)都在1.9以上。在伊拉肉兔和美系獺兔群體MSTN的4個SNP位點(A、B、C、D)均表現(xiàn)為中度多態(tài)(0.25

表7 伊拉肉兔和美系獺兔MSTN基因各多態(tài)位點的遺傳參數(shù)

3 討論與結(jié)論

MSTN基因參與骨骼肌的分化，MSTN基因突變的動物骨骼肌肌群分布廣泛且肉質(zhì)優(yōu)良[10]。筆者研究在70只伊拉肉兔和70只美系獺兔MSTN基因中共發(fā)現(xiàn)4個SNP位點，其中外顯子Ⅰ和外顯子Ⅱ中的多態(tài)位點，與張柯等[9]的研究結(jié)果一致；外顯子Ⅲ未發(fā)現(xiàn)多態(tài)位點，與喬西波等[8]的研究結(jié)果一致；內(nèi)含子Ⅰ和內(nèi)含子Ⅱ的多態(tài)位點在家兔中首次發(fā)現(xiàn)，與其家兔的生長發(fā)育是否有關(guān)還需要進一步的研究。

在伊拉肉兔群體中外顯子Ⅰ的SNP位，三種基因型頻率不符合hardy-weinberg平衡(P<0.05)，其CC基因型為優(yōu)勢基因型，C等位基因為優(yōu)勢基因，這可能是由于C等位基因影響家兔肌肉生長。俞成浩等[10]研究發(fā)現(xiàn)在MSTN基因擴增片段中發(fā)現(xiàn)SNP位點，27只齊興肉兔和伊拉肉兔均為CC型。結(jié)合已有報道，推斷伊拉肉兔較美系獺兔生長速度快或許與此有關(guān)，即可認(rèn)為伊拉肉兔在人工選育的過程中突出肉用性能的選育，強化了C等位基因的選擇，導(dǎo)致了該位點不符合hardy-weinberg平衡。

筆者研究在伊拉肉兔和美系獺兔MSTN基因除了伊拉肉兔群體中外顯子Ⅰ的SNP位點各基因型頻率不符合hardy-weinberg平衡(P<0.05)，內(nèi)含子Ⅰ、外顯子Ⅱ和內(nèi)含子Ⅱ的3個SNP位點各基因型頻率均符合hardy-weinberg平衡(P>0.05)。至于MSTN基因在動物體內(nèi)發(fā)揮作用的分子機制尚不明確，但相關(guān)的研究表明，MSTN基因影響畜禽生長發(fā)育與肌肉生長。趙振華等[11]發(fā)現(xiàn)MSTN基因突變顯著影響優(yōu)質(zhì)雞肌肉生長，是雞肌肉生長主效基因之一。張柯等[9]研究發(fā)現(xiàn)MSTN基因SNP位點顯著影響了6個肉兔品種135日齡全凈膛重、屠宰率等。結(jié)合已有的研究，這3個SNP位點基因型頻率、等位基因頻率分布相似，是由于伊拉肉兔和美系獺兔在品種選育過程對生長速度、屠宰率等肉用指標(biāo)都作為重用經(jīng)濟指標(biāo)。

筆者研究表明，伊拉肉兔和美系獺兔MSTN基因各多態(tài)位點的遺傳參數(shù)中，遺傳信息含量較高(0.25