張亦琳，延 永，張 琴

(商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院，陜西 商洛 726000)

絞股藍(lán)[Gynostemmapentaphyllum(Thunb.)Makino]為葫蘆科植物的全草，又名小苦葉、七葉膽等，味苦、微甘，性涼，具有清熱、補(bǔ)虛、解毒的功效，有“第二人參”和“南方人參”之稱，對(duì)治療病毒性肝炎、慢性支氣管炎、體虛乏力等癥有確切的療效[1,2]。衛(wèi)健委(原衛(wèi)計(jì)委)將其列為保健食品的中藥，常被制成保健茶、飲料、食品添加劑等功能性食品[3]。絞股藍(lán)在陜西商南地區(qū)廣泛種植，陜西省政府在《陜西省道地中藥材志》中將絞股藍(lán)確定為重點(diǎn)中藥材品種[4]。絞股藍(lán)總提取物成分復(fù)雜，包含多糖、皂苷[5, 6]、黃酮[7]等，其中總黃酮含量約3%～5%[8]，主要有商陸素、蘆丁、槲皮素及蕓香苷等十余種[9]。提取方法有常規(guī)溶劑回流法、超聲輔助提取、微波輔助提取等[10]，很少有人考慮浸泡對(duì)提取效果的影響。研究表明，植物浸泡后有助于提取有效成分，提高提取得率[11]。

為提升絞股藍(lán)藥材資源利用率，提高產(chǎn)品效價(jià)，以陜西道地藥食兩用的中藥材絞股藍(lán)為研究對(duì)象，在回流提取絞股藍(lán)中總黃酮的工藝的基礎(chǔ)上，增加溶劑浸泡，通過(guò)單因素試驗(yàn)和Box-Behnken響應(yīng)面法，優(yōu)化絞股藍(lán)總黃酮的提取工藝，并對(duì)絞股藍(lán)總黃酮提取物的抑菌活性進(jìn)行研究，為絞股藍(lán)總黃酮提取工藝開(kāi)發(fā)提供新的思路，對(duì)絞股藍(lán)功能產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供了理論基礎(chǔ)。

1 儀器與試劑

UV-255型紫外分光光度計(jì)(大連市儀器制造公司)、ZYMICRO-I-10T型超純水機(jī)(成都鼎越水處理設(shè)備有限公司)、DHG-9123A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海齊欣科學(xué)儀器有限公司)

絞股藍(lán)(商洛本地產(chǎn)，購(gòu)于商洛市怡康大藥房)、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(南京道斯夫生物科技有限公司)；氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、乙醇均購(gòu)自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備參考文獻(xiàn)方法[12]：配置質(zhì)量濃度分別為0、0.0040、0.0080、0.0120、0.0160、0.0200、0.0240 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，測(cè)定吸光度值(A)。以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程為Y=9.9431X+0.00231(R2=0.99718)。

2.2 總黃酮含量的測(cè)定

取一定量的提取液，按蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液的方法處理后于510 nm處測(cè)定吸光度(A)，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算絞股藍(lán)總黃酮濃度，由下式計(jì)算提取率Y(%)。

其中，C(g/mL)為提取液質(zhì)量濃度；N為稀釋倍數(shù)；V為提取液體積(mL)；W為藥材總質(zhì)量(g)。

2.3 單因素試驗(yàn)

稱取絞股藍(lán)5 g，以乙醇濃度為70%，溶劑體積50 mL，浸泡時(shí)間30 min，提取溫度70℃，提取時(shí)間120 min為基礎(chǔ)提取條件，調(diào)整乙醇濃度分別為50%、60%、70%、80%、90%，考察乙醇濃度對(duì)提取的影響；調(diào)整溶液體積分別為12.5 mL、25 mL、50 mL、75 mL和100 mL，考察料液比對(duì)提取的影響；調(diào)整浸泡時(shí)間分別為10 min、20 min、30 min、40 min、50 min，考察浸泡時(shí)間對(duì)提取的影響；調(diào)整提取溫度分別為50℃、60℃、70℃、80℃、90℃，考察提取溫度對(duì)提取的影響；調(diào)整提取時(shí)間分別為60 min、90 min、120 min、150 min、180 min考察提取時(shí)間對(duì)提取的影響。

2.4 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

基于單因素試驗(yàn)結(jié)果，以乙醇濃度(A)、提取溫度(B)、料液比(C)為自變量，用-1、0、1分別表示自變量的高低水平，以總黃酮提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，設(shè)計(jì)三因素響應(yīng)曲面試驗(yàn)，因素與水平如表1所示。

表1 因素和水平

2.5 驗(yàn)證性試驗(yàn)

為了驗(yàn)證響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果的可靠性，對(duì)預(yù)測(cè)的最佳提取條件進(jìn)行驗(yàn)證，確定與預(yù)測(cè)值的吻合程度。如果與預(yù)測(cè)值基本吻合，說(shuō)明預(yù)測(cè)模型與實(shí)際情況擬合較好，反之則擬合失敗。

2.6 絞股藍(lán)總黃酮提取物抑菌活性測(cè)定

在滅菌環(huán)境下，將100.0 μL菌種種植在瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)，密封，搖勻，置于培養(yǎng)箱中18 h(37℃)。取濾紙片(滅菌，d=7.00 nm)蘸取高、中、低劑量物溶液和安息香酸鈉溶液后(濃度見(jiàn)表4)，將其密封在涂有菌懸液的培養(yǎng)基，在37℃條件下培養(yǎng)18 h，計(jì)算抑菌率W(%)。

其中：A為測(cè)試液抑菌圈直徑/mm；B為安息香酸鈉抑菌圈直徑/mm；d為濾紙片直徑/mm。

3 結(jié)果與討論

3.1 單因素試驗(yàn)

3.1.1 乙醇濃度對(duì)絞股藍(lán)總黃酮提取的影響 由圖1可知，因乙醇滲透能力較強(qiáng)，提高乙醇濃度能加速目標(biāo)成分在提取液和細(xì)胞基質(zhì)之間的溶解平衡，所以隨乙醇濃度的增大，絞股藍(lán)總黃酮含量逐漸上升；當(dāng)乙醇濃度達(dá)到80%時(shí)，總黃酮的含量達(dá)到最大值。但是，由于黃酮類化合物極性較大，根據(jù)相似相溶原理，繼續(xù)升高乙醇濃度，總黃酮溶解度降低。因此，選用乙醇濃度在60%、70%、80%三個(gè)水平進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

圖1 乙醇濃度對(duì)絞股藍(lán)總黃酮提取的影響

3.1.2 料液比對(duì)絞股藍(lán)總黃酮提取的影響 由圖2可知，隨著料液比的增大，絞股藍(lán)總黃酮的提取率也逐漸減大，當(dāng)料液比為1∶10時(shí)，總黃酮提取率達(dá)到3.47%。繼續(xù)增大料液比，絞股藍(lán)總黃酮提取率逐漸減小，可能是由于隨著液料比減小，絞股藍(lán)樣品的其他成分也隨之溶出，影響了黃酮類化合物的溶解度。因此，選擇料液比1∶5、1∶10、1∶15三個(gè)水平進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

圖2 料液比對(duì)絞股藍(lán)總黃酮提取率的影響

3.1.3 浸泡時(shí)間對(duì)絞股藍(lán)總黃酮提取的影響 如圖3所示，溶劑浸泡有利于中藥活性成分的析出，隨著浸泡時(shí)間的增長(zhǎng)，絞股藍(lán)總黃酮提取率有明顯增加，當(dāng)浸泡時(shí)間達(dá)到30 min時(shí)，提取率達(dá)到最大值3.23%，繼續(xù)增加浸泡時(shí)間，提取率基本不再增加，從時(shí)間成本和提取效率上考慮，選擇浸泡時(shí)間為30 min，不做響應(yīng)面研究。

3.1.4 提取溫度對(duì)絞股藍(lán)總黃酮提取的影響 由圖4可知，當(dāng)提取溫度不斷升高時(shí)，絞股藍(lán)總黃酮的含量也隨著升高，當(dāng)提取溫度達(dá)到60℃時(shí)，總黃酮提取率最大值為3.31%。繼續(xù)升高提取溫度，總黃酮提取率出現(xiàn)下降趨勢(shì)，可能由于隨著提取溫度的升高，絞股藍(lán)中的氨基酸、多糖等的溶出影響了黃酮類化合物的析出(提取液變黑，有少量黑色沉淀出現(xiàn))。因此，選擇提取溫度為50℃、60℃、70℃三個(gè)水平進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。

圖3 浸泡時(shí)間對(duì)絞股藍(lán)總黃酮提取率的影響

圖4 提取溫度對(duì)絞股藍(lán)總黃酮提取率的影響

3.1.5 提取時(shí)間對(duì)絞股藍(lán)總黃酮提取的影響 由圖5可知，在提取時(shí)間少于120 min時(shí)，總黃酮提取率隨著提取時(shí)間的增加而增大，且增大的趨勢(shì)增強(qiáng)，當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到120 min時(shí)，絞股藍(lán)總黃酮提取率達(dá)到最大值，繼續(xù)延長(zhǎng)提取時(shí)間，提取率變化不大。因此，選擇120 min作為絞股藍(lán)總黃酮的提取時(shí)間，不做響應(yīng)面優(yōu)化。

圖5 提取時(shí)間對(duì)絞股藍(lán)總黃酮提取的影響

3.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

3.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)方案及試驗(yàn)結(jié)果 以A(乙醇濃度)、B(料液比)、C(提取溫度)作為考察因素，絞股藍(lán)總黃酮的提取率為響應(yīng)值，利用Design-Expert8.0.6Trial 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析，結(jié)果見(jiàn)表2，并建立參數(shù)回歸模型。

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果

模擬回歸方程為：總黃酮提取率= 0.37-7.125×10-3A-0.012B+0.013C-0.019AB +1.200×10-3AC+7.825×10-3BC-0.053A2-0.13B2-0.099C2

3.2.3 響應(yīng)面各因素交互作用分析 使用Design-Expert8.0.6Trial 軟件對(duì)絞股藍(lán)總黃酮的提取工藝的相關(guān)因素做出響應(yīng)面曲線圖。如圖6a、6b、6c可見(jiàn)，AB、AC、BC三個(gè)3D相應(yīng)曲面曲線陡峭，說(shuō)明各因素對(duì)總黃酮含量影響較顯著，當(dāng)變量發(fā)生變化時(shí)能對(duì)絞股藍(lán)總的提取影響明顯如圖6d、6e、6f可見(jiàn)，AB、AC、BC三個(gè)等高線圖呈現(xiàn)明顯的橢圓形，尤其是乙醇濃度和提取溫度、乙醇濃度和料液比交互作用較強(qiáng)。

表3 方差分析

圖6 兩因素交互作用對(duì)總黃酮得率的響應(yīng)面圖和等高線

3.2.4 最佳提取條件的確定 根據(jù)Design-Expert8.0.6Trial 軟件模擬模型，分析最佳的提取工藝為：乙醇濃度79.75%，提取溫度59.40℃，料液比1∶10.13，預(yù)測(cè)最佳工藝的總黃酮的提取率為3.71%。

3.2.5 總黃酮驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn) 充分考慮實(shí)驗(yàn)的可行性，將預(yù)測(cè)的最佳工藝調(diào)整為乙醇濃度80.0%，提取溫度59.40℃，料液比1∶10.10，浸泡時(shí)間30 min，回流時(shí)間120 min。平行3次驗(yàn)證，總黃酮提取率分別為3.84%、3.77%、3.79%，平均值為3.80%(RSD=94.88%)，與預(yù)測(cè)值相符。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)證明該工藝具有穩(wěn)定性。

3.3 絞股藍(lán)總黃酮提取物體外抑菌活性測(cè)試結(jié)果

絞股藍(lán)總黃酮提取物對(duì)8種測(cè)試菌均有抑菌效果，如表4所示：

表4 不同濃度絞股藍(lán)提取物對(duì)不同菌種的抑菌作用

結(jié)果表明，絞股藍(lán)總黃酮提取物對(duì)8種測(cè)試菌的抑菌活性與提取物濃度關(guān)系密切，隨著總黃酮的濃度增加，抑菌圈直徑變大。高劑量時(shí)對(duì)金黃色葡萄球菌和白色念珠菌的抑制率可媲美安息香酸鈉(3.28 mg/mL)，抑制率分別增加103.30%和98.61%；對(duì)肺炎克雷伯菌、傷寒桿菌、黑曲霉、銅綠假單胞菌的抑制效果相對(duì)較差，抑制率不超過(guò)50%。

4 結(jié)論與討論

本工藝新增考慮溶劑浸泡對(duì)絞股藍(lán)總黃酮提取的影響，通過(guò)Box-Behnken設(shè)計(jì)中的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，成功優(yōu)化得到絞股藍(lán)總黃酮提取的最佳工藝為：乙醇濃度80.0%，提取溫度59.40℃，料液比1∶10.10，浸泡時(shí)間30 min，回流時(shí)間120 min，絞股藍(lán)總黃酮的提取率的平均值為3.80%(RSD=94.88%)。絞股藍(lán)提取過(guò)程中，乙醇濃度對(duì)提取的影響較為顯著，與之前文獻(xiàn)報(bào)道一致，這也是絞股藍(lán)提取物大部分為醇提物的原因，經(jīng)驗(yàn)證，總黃酮提取物的成分較為復(fù)雜，另一種有效成分的絞股藍(lán)皂苷的含量達(dá)到2.6123 mg/mL，后續(xù)研究重點(diǎn)應(yīng)該在提取物有效成分的分離和純化，相關(guān)研究工作已經(jīng)啟動(dòng)。

抑菌實(shí)驗(yàn)表明：絞股藍(lán)總黃酮提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、傷寒桿菌、黑曲霉、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌8種測(cè)試菌均有抑制活性，尤其是高劑量提取物對(duì)金黃色葡萄球菌和白色念珠菌的抑制率可媲美安息香酸鈉(3.28 mg/mL)，抑制率分別增加103.30%和98.61%；因此，我們有理由認(rèn)為絞股藍(lán)的總黃酮提取物具有較好的實(shí)用價(jià)值，開(kāi)發(fā)提取工藝和研究提取物的生物活性具有一定的實(shí)際意義。