楊志城 孫彩虹 房慶偉 吳若銘 李坤 葉冠

（上海醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司中央研究院 上海 201203）

神經(jīng)病理性疼痛（neuropathic pain, NP）是指由機(jī)體感覺(jué)神經(jīng)系統(tǒng)的損傷或疾病引起的疼痛[1]，其全球人口患病率約為3.3% ～ 8.2%[2]，歐洲人群的患病率可能高達(dá)8%[3]，推測(cè)我國(guó)約有9 000萬(wàn)NP患者，占慢性疼痛患者總數(shù)的20% ～ 25%[4]。對(duì)于NP，目前臨床上缺乏根治方法和特效藥物。因此，積極探尋療效確切且不良反應(yīng)小的NP治療藥物具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

瘀血痹膠囊由當(dāng)歸、丹參、炙乳香等11味中藥組成，有活血化瘀、通絡(luò)定痛之功效，現(xiàn)臨床上主要用于緩解某些患者的關(guān)節(jié)疼痛癥狀。目前，關(guān)于瘀血痹膠囊的鎮(zhèn)痛作用雖已見(jiàn)動(dòng)物模型[5]、臨床藥效學(xué)[6]和基于單味藥的鎮(zhèn)痛機(jī)制[7-9]研究報(bào)告，但缺乏整體性研究。本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)探究瘀血痹膠囊可能具有的抗NP活性成分及其作用機(jī)制，為拓展瘀血痹膠囊治療NP新用途提供理論依據(jù)。

1 工具與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫(kù)和軟件

數(shù)據(jù)庫(kù)：TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）；Genecards數(shù) 據(jù) 庫(kù)（http://www.genecards.org）；UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.uniprot.org）；STRING數(shù)據(jù)庫(kù)（https://string-db.org）；DAVID數(shù) 據(jù) 庫(kù)（https://david.ncifcrf.gov/）。

軟件：R3.6.3；Cytoscape 3.7.2；Discovery Studio 2019。

1.2 化學(xué)成分的收集和篩選

在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中，以瘀血痹膠囊所含單味藥的中文名進(jìn)行檢索，收集整理后取口服生物利用度≥30%、類藥性≥0.18的活性成分納入后續(xù)研究。

1.3 作用靶點(diǎn)收集和網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)收集活性成分的作用靶點(diǎn)，然后將作用靶點(diǎn)名輸入U(xiǎn)niProt數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。此外，在Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)中以“neuropathic pain”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，獲得潛在的“疾病靶點(diǎn)”。整合活性成分作用靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)信息，得到交集靶點(diǎn)和瘀血痹膠囊活性成分-NP靶標(biāo)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

1.4 蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction,PPI）分析

在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究中，STRING數(shù)據(jù)庫(kù)通常被用來(lái)構(gòu)建靶標(biāo)蛋白之間的PPI網(wǎng)絡(luò)。將經(jīng)韋恩圖處理后的交集靶點(diǎn)去重后導(dǎo)入到STRING數(shù)據(jù)庫(kù)中，設(shè)置organism為“homo sapines”進(jìn)行搜索，然后將處理好的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件中，利用該軟件自帶的Network Analysis插件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治觯“悬c(diǎn)degree值的中位數(shù)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，并根據(jù)2倍degree值中位數(shù)篩選核心靶點(diǎn)。

1.5 GO（Gene Ontology）和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）富集分析

對(duì)篩選所得交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO和KEGG富集分析，并對(duì)分子功能、生物過(guò)程和細(xì)胞成分3部分進(jìn)行可視化，分析瘀血痹膠囊潛在的抗NP作用，同時(shí)獲知瘀血痹膠囊產(chǎn)生抗NP作用的相關(guān)信號(hào)通路，分析其作用機(jī)制。

1.6 分子對(duì)接驗(yàn)證

將篩選所得核心靶點(diǎn)與瘀血痹膠囊活性成分-NP靶標(biāo)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中排名靠前的化合物進(jìn)行分子對(duì)接。定義靶蛋白為受體分子，根據(jù)PDB數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)該靶蛋白共晶小分子配體的文獻(xiàn)說(shuō)明，選擇該靶蛋白特殊抑制劑（配體）作為活性中心，運(yùn)用配體擴(kuò)張法確定活性位點(diǎn)，即以共晶小分子配體的位置為中心，再向外擴(kuò)增9 ?范圍，這個(gè)范圍的球狀受體殘基就構(gòu)成了相關(guān)的活性位點(diǎn)，然后刪除共晶配體以形成活性空腔。采用Discovery Studio 2019軟件中LibDock模塊進(jìn)行模擬對(duì)接，以LibDockScore來(lái)評(píng)價(jià)化合物與靶蛋白的親和力，其值越大，表明親和力越高。

2 結(jié)果與分析

2.1 瘀血痹膠囊潛在的抗NP活性成分及其作用靶點(diǎn)篩選

檢索、篩選后共得瘀血痹膠囊潛在的抗NP活性成分128個(gè)，作用靶點(diǎn)11 504個(gè)，去重后獲得124個(gè)不重復(fù)作用靶點(diǎn)。與1 434個(gè)NP疾病靶點(diǎn)進(jìn)行交集，得到43個(gè)交集靶點(diǎn)。

2.2 瘀血痹膠囊活性成分-NP疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

采用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建瘀血痹膠囊活性成分-潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖（圖1，其中外圈為瘀血痹膠囊活性成分，中圈為瘀血痹膠囊作用靶點(diǎn)與NP疾病靶點(diǎn)的交集靶點(diǎn)，內(nèi)圈為瘀血痹膠囊所含藥味）。由圖1可知，瘀血痹膠囊通過(guò)多活性成分、多作用靶點(diǎn)產(chǎn)生抗NP協(xié)同作用。對(duì)該網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行進(jìn)一步的Network Analyze分析，以活性成分的作用靶點(diǎn)個(gè)數(shù)為指標(biāo)排序，獲知槲皮素、山奈酚、木犀草素和4-亞甲基丹參新酮等可能為瘀血痹膠囊之所以具有抗NP作用的主要活性成分。

圖1 瘀血痹膠囊活性成分-潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果

運(yùn)用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)繪制交集靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)圖（圖2），然后采用Cytoscape 3.7.2軟件篩選作用靶點(diǎn)，獲知核心作用靶點(diǎn)為白介素-6、白蛋白、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A、胱天蛋白酶-3、絲裂原激活的蛋白激酶8、雌激素受體-1和β-淀粉樣蛋白前體蛋白，主要集中于表皮/血管內(nèi)皮細(xì)胞功能調(diào)節(jié)、炎癥調(diào)控、白蛋白表達(dá)、細(xì)胞增殖/凋亡/分化、糖脂代謝和神經(jīng)生長(zhǎng)等方面。

圖2 瘀血痹膠囊抗NP作用的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 瘀血痹膠囊抗NP作用靶點(diǎn)的GO富集分析

對(duì)交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集-有向無(wú)環(huán)圖分析，結(jié)果如圖3所示，瘀血痹膠囊抗NP作用主要與核酸轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合活性、跨膜受體活性、細(xì)胞分子功能、受體活性4大生物模塊相關(guān)，通過(guò)調(diào)節(jié)腎上腺素受體活性、G蛋白偶聯(lián)受體活性、甾體激素受體活性、神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、蛋白異二聚化活性和銨離子結(jié)合、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、甾體激素結(jié)合過(guò)程，最終產(chǎn)生抗NP作用。

圖3 瘀血痹膠囊抗NP作用靶點(diǎn)的GO富集條目有向無(wú)環(huán)圖

2.5 瘀血痹膠囊抗NP作用的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路KEGG富集分析

以P值為標(biāo)準(zhǔn)選取與炎癥、免疫、激素和中樞神經(jīng)相關(guān)的20條信號(hào)通路進(jìn)行可視化分析，其中與免疫和中樞神經(jīng)相關(guān)的信號(hào)通路數(shù)較多，如神經(jīng)活性配體-受體相互作用信號(hào)通路、神經(jīng)退行性疾病途徑-多種疾病信號(hào)通路、阿爾茨海默病信號(hào)通路、腫瘤壞死因子信號(hào)通路、白介素-17信號(hào)通路、T細(xì)胞受體信號(hào)通路等；細(xì)胞的重要信號(hào)通路數(shù)也較多，如絲裂原激活的蛋白激酶8信號(hào)通路、環(huán)磷酸腺苷信號(hào)通路、鈣信號(hào)通路等。KEGG富集分析顯示，瘀血痹膠囊的活性成分可能是通過(guò)作用于上述諸信號(hào)通路而最終產(chǎn)生抗NP作用的（圖4）。

圖4 瘀血痹膠囊抗NP作用靶點(diǎn)的KEGG富集分析

2.6 分子對(duì)接驗(yàn)證

選取PPI網(wǎng)絡(luò)圖中大于2倍degree值中位數(shù)的核心作用靶點(diǎn)作為分子對(duì)接受體，同時(shí)選取瘀血痹膠囊活性成分-NP疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中排名前10位的化合物作為配體，進(jìn)行分子對(duì)接。結(jié)果顯示，這些化合物與白介素-6的對(duì)接活性最好，其次為白蛋白、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A、胱天蛋白酶-3、絲裂原激活的蛋白激酶8等作用靶點(diǎn)；木犀草素、異鼠李素、山奈酚等化合物與各核心作用靶點(diǎn)的分子對(duì)接得分均較高（平均值均＞100，表1）。此外，丹參中所含異隱丹參酮、丹參酮ⅡA、丹參酚醌Ⅰ、二氫丹參內(nèi)酯等化合物均較好地結(jié)合在核心作用靶點(diǎn)的活性空腔內(nèi)。

表1 瘀血痹膠囊主要活性成分與核心作用靶點(diǎn)的分子對(duì)接得分平均值

3 討論

瘀血痹膠囊在治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎時(shí)表現(xiàn)出有顯著的鎮(zhèn)痛作用，這可能與其含有乳香、沒(méi)藥、紅花、丹參等鎮(zhèn)痛藥味有關(guān)。疼痛可分為傷害感受性疼痛和NP兩類[10]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示，瘀血痹膠囊中的活性成分丹參酮ⅡA、迷迭香酸等對(duì)NP均有良好鎮(zhèn)痛活性[11-12]。因此，運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究瘀血痹膠囊是否也具有抗NP作用是有一定理由的。

本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，瘀血痹膠囊的主要作用靶點(diǎn)包括細(xì)胞因子（血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A、白介素-6）、細(xì)胞核受體（雌激素受體-1、雄激素受體、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體）、功能調(diào)節(jié)蛋白（白蛋白、c-Fos蛋白、β-淀粉樣蛋白前體蛋白）和酶（絲裂原激活的蛋白激酶8）等，這些作用靶點(diǎn)與神經(jīng)活性、炎癥和免疫功能等密切相關(guān)。GO和KEGG富集分析結(jié)果顯示，瘀血痹膠囊系經(jīng)影響神經(jīng)活性配體-受體相互作用、腫瘤壞死因子、白介素-17、T細(xì)胞受體、絲裂原激活的蛋白激酶8、環(huán)磷酸腺苷、鈣等信號(hào)通路而調(diào)節(jié)炎癥、細(xì)胞增殖/分化/代謝和甾體激素、前列腺素等的受體活性，以及核酸復(fù)制、轉(zhuǎn)錄因子生成，最終產(chǎn)生抗NP作用的。

如前所述，丹參酚醌Ⅰ、二氫丹參內(nèi)酯、丹參酮ⅡA和異隱丹參酮等均具有抗NP活性。分子對(duì)接結(jié)果也顯示，這些化合物是瘀血痹膠囊之所以具有抗NP作用的重要活性成分?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示，丹參中的活性成分丹酚酸B、丹參酚醌Ⅰ、丹參素、二氫丹參內(nèi)酯、異隱丹參酮和丹參酮ⅡA等能通過(guò)可逆性地阻斷神經(jīng)干動(dòng)作電位的沖動(dòng)傳導(dǎo)而產(chǎn)生抗NP作用[13]，沒(méi)藥、紅花和川牛膝等中共有的活性成分槲皮素可通過(guò)顯著降低腫瘤壞死因子-α、白介素-1β、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶和環(huán)氧化酶-2等的表達(dá)水平而有效減輕NP[14]。此外，紅花、香附和黃芪中共有的活性成分山奈酚能通過(guò)抑制Toll樣受體4-核因子-κB信號(hào)通路，減弱caspase-8、caspase-3和NLRP1/NLRP3炎性小體的活性，減少或阻止炎癥因子的產(chǎn)生，進(jìn)而減輕腦神經(jīng)細(xì)胞損傷，最終產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用[15]。香附、黃芪等中共有的活性成分異鼠李素可通過(guò)抑制核因子-κB信號(hào)通路，降低腫瘤壞死因子-α、白介素-6和白介素-1β的表達(dá)水平，最終產(chǎn)生抗炎鎮(zhèn)痛作用[16]；咖啡酸亦可通過(guò)抑制核因子-κB和5-脂氧合酶的活性，下調(diào)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶的表達(dá)水平，減少一氧化氮合成，抑制炎癥引起的髓過(guò)氧化物酶、丙二醛和亞硝酸鹽水平的升高，抑制多種炎性介質(zhì)的合成和釋放，進(jìn)而有效減輕炎癥造成的神經(jīng)元氧化損傷，最終產(chǎn)生炎性疼痛減輕作用[16-17]。

總之，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析顯示，瘀血痹膠囊具有多成分、多靶點(diǎn)、多途徑治療NP的潛力，其主要通過(guò)影響甾體激素受體活性、轉(zhuǎn)錄因子生成、炎癥過(guò)程、神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)/修復(fù)等而產(chǎn)生抗NP作用。本研究結(jié)果為瘀血痹膠囊用于NP治療提供了理論依據(jù)。