陳偉，覃成禹，陳遠明

（1.廣西醫(yī)科大學，廣西 南寧 530021；2.廣西醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530007；3.廣西再生醫(yī)學重點實驗室，廣西 南寧 530021）

0 引言

據(jù)2020年世界衛(wèi)生組織報告，在女性癌癥患者中，乳腺癌已超越肺癌成為發(fā)病率最高的腫瘤[1]。而在乳腺癌晚期患者中，約有65%-75%會發(fā)生骨轉(zhuǎn)移[2]。三陰性乳腺癌是乳腺癌分子分型中的一種，與其它分型的患者相比，其早期遠處復發(fā)率更高，5年預后更差；腫瘤體積更大，等級更高[3]?；熕幬镏虚L期使用及單一使用易產(chǎn)生耐藥[4]，開發(fā)新型抗腫瘤藥物，推動中藥單體抗癌是有必要的。

肉桂醛是一種天然的黃酮類化合物，是藥食同源植物肉桂揮發(fā)油中的最重要的活性成分之一[5]?，F(xiàn)代藥理學研究表明肉桂醛具有抗氧化、抗菌、抗炎及抗腫瘤等作用[6-8]。目前，肉桂醛對三陰性乳腺癌的作用研究鮮有報道。本文探討肉桂醛對三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231生長作用，為臨床抗腫瘤輔助用藥提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞及培養(yǎng)

人乳腺癌細胞MDA-MB-231（購自中國醫(yī)學科學院細胞中心），用含10%胎牛血清、1%青/鏈霉素溶液的DMEM完全培養(yǎng)基接種，于條件為5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑

肉 桂 醛（索 萊 寶，SC8320），胎 牛 血 清（美侖 生 物，PWL001）,CCK-8試 劑 盒（美 侖 生 物，MA0218），0.1%結(jié)晶紫染色液(索萊寶，G1063),逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（ThermoFisher），AKT抗體（CST，4691），p-AKT抗 體（CST，4060），β-actin抗體（CST，4970），熒光二抗（invitrogen，sa535571）。

1.1.3 主要儀器

二氧化碳培養(yǎng)箱（ThermoFisher，美國），Tri Star2 多功能酶標儀（Berthold，德國），Cytation 5成像儀（BioTek，美國），NanoDrop超微量分光光度 計(ThermoFisher，美 國），ProFlex PCR儀(Life technologies，美 國)，LightCycler實 時 熒 光 定 量PCR儀（Roche，瑞士），PowerPac電泳系統(tǒng)(BIORAD，美國)，雙色紅外激光成像系統(tǒng)（基因有限公司，中國香港）。

1.2 方法

1.2.1 CCK-8藥物毒性實驗

取生長狀態(tài)良好的MDA-MB-231細胞，以每孔5×103個細胞、100μL完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清及1%青、鏈霉素雙抗）接種于96孔板中，置于37℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中孵育過夜。第二天見板內(nèi)細胞貼壁生長，狀態(tài)良好，更換培養(yǎng)基為含不同濃度肉桂醛（0、6.25、12.5、25、50、100、200 μmoL/L）的完全培養(yǎng)基后，分別于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時、48小時后加入CCK-8試劑，培養(yǎng)箱恒溫孵育2小時后上酶標儀機器檢測450nm處吸光度。

1.2.2 克隆形成實驗

將MDA-MB-231細胞以1 000/孔接種于六孔板內(nèi)，待細胞貼壁狀態(tài)穩(wěn)定后，改培養(yǎng)基為分別含0、6.25、12.5、25、50、100 μmoL/L肉桂醛的30%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱孵育7天或鏡下觀察見對照孔中大多數(shù)單個克隆中細胞數(shù)大于50為止，4%多聚甲醛固定細胞， 0.1%結(jié)晶紫染色液染色，成像儀拍照。

1.2.3 劃痕愈合實驗

取生長狀態(tài)良好的MDA-MB-231細胞，以每孔5×105個細胞、2mL完全培養(yǎng)基接種于6孔板中，待細胞貼壁鋪滿孔底后，吸頭劃痕后用PBS輕微清洗，分別加入含0、25、50、100μmoL/L肉桂醛的無血清培養(yǎng)基放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別于加藥后0、24、48 h顯微鏡下拍照記錄劃痕愈合情況。劃痕愈合率=（0h劃痕面積-該時段劃痕面積）/（0h劃痕面積）。

1.2.4 聚合酶鏈式反應

將MDA-MB-231細 胞 以1.5×105/孔 接 種 于六孔板內(nèi),不同濃度肉桂醛處理24 h后，TRIZOL法提取總RNA，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。美國國家生物信息中心（NCBI）網(wǎng)站Gene模塊設(shè)計以下引物：CASP3，上游引物5’-CATGGAAGCGAATCAATGGACT-3’，下 游 引 物5’-CTGTACCAGACCGAGATGTCA-3’；CASP9，上 游引物5’-CTCAGACCAGAGATTCGCAAAC-3’，下游引物5’-GCATTTCCCCTCAAACTCTCAA-3’；BCL2，上游引物5’-GTCATGTGTGTGGAGAGCGT-3’;下游引物5’-AGTTCCACAAAGGCATCCCAG-3’；BAX，上游引物5’-GGAGCTGCAGAGGATGATTG-3’，下游引物5’-GGAGACAGGGACATCAGTCG-3’;GAPDH，上 游引物5’-GGACCTGACCTGCCGTCTAG-3’，下游引物5’-GTAGCCCAGGATGCCCTTGA-3’。qPCR反 應 條件為95℃ 60 s孵育，40個擴增循環(huán)（95℃ 15 s，60℃ 60 s），熔解冷卻。以GAPDH作為管家基因，實驗所得Cq值按照2-△△cq計算出各目的基因的相對表達量。

1.2.5 蛋白質(zhì)免疫印跡實驗

將MDA-MB-231細胞以2×105/孔接種于六孔板內(nèi)，分別以0、6.25、12.5、25、50、100 μmoL/L濃度的肉桂醛處理細胞24h后,加入RIPA裂解液（含1%蛋白酶抑制劑、PMSF、磷酸酶抑制劑）提取蛋白。1.0 mm玻璃板制10%分離膠， 120 V，80 min條件下電泳，300 mA，90 min參數(shù)將蛋白轉(zhuǎn)印至0.45 μm硝酸纖維素膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1h，一抗（p-AKT、AKT、β-actin）4℃孵育過夜，熒光二抗室溫孵育1 h后上機掃描成像。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

克隆形成、劃痕、蛋白質(zhì)免疫印跡實驗所得原始圖使用ImageJ軟件進行量化，實驗數(shù)據(jù)均以GraphPad Prism8統(tǒng)計軟件處理，以0μmoL/L組（不含肉桂醛的完全培養(yǎng)基組）作為對照組，組間比較使用單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 肉桂醛對乳腺癌細胞的增殖/毒性影響

通過CCK-8細胞增殖毒性實驗，我們發(fā)現(xiàn)肉桂醛濃度在50 μmoL/L以上時對乳腺癌MDAMB-231細胞具有毒性作用（P＜0.05），且隨著濃度升高，其毒性越強（圖1）。計算肉桂醛處理MDAMB-231細胞48 h時的半數(shù)致死量IC50值為103.6 μmoL/L，取100 μmoL/L為肉桂醛后續(xù)實驗的最能和用藥終濃度。

圖1 肉桂醛對乳腺癌細胞增殖毒性的影響（＊＊表示P＜0.01,＊＊表示P＜0.001）

2.2 肉桂醛對乳腺癌細胞克隆形成能力的影響

我們發(fā)現(xiàn)在6.25-100 μmoL/L范圍內(nèi)，隨著肉桂醛濃度增加，MDA-MB-231細胞克隆形成數(shù)目遞減（圖2）,表示肉桂醛能夠抑制乳腺癌細胞克隆形成能力。

圖2 肉桂醛對乳腺癌細胞克隆形成能力的影響

2.3 桂醛對乳腺癌細胞遷移能力的影響

通過劃痕愈合實驗，我們發(fā)現(xiàn)肉桂醛濃度在100 μmoL/L時，抑制MDA-MB-231細胞的遷移能力（P＜0.001）（圖3）。

圖3 肉桂醛對乳腺癌細胞遷移能力的影響(＊＊＊表示P＜0.001)

2.4 肉桂醛對乳腺癌細胞mRNA表達水平的影響

經(jīng)肉桂醛處理后，乳腺癌細胞中的CASP3、BCl2表達水平下降（P＜0.001或P＜0.01）、CASP9和BAX表達水平增高(P＜0.01或P＜0.05)(圖4)，表明肉桂醛可能通過誘導凋亡來抑制乳腺癌細胞的生長。

圖4 肉桂醛對乳腺癌細胞凋亡相關(guān)基因表達的影響(＊表示P＜0.05,＊＊表示P＜0.01,＊＊＊表示P＜0.001)

2.5 肉桂醛對AKT蛋白磷酸化情況的影響

通過蛋白質(zhì)免疫印跡實驗，我們發(fā)現(xiàn)肉桂醛能夠激活AKT通路，并且隨著藥物濃度增加，p-AKT蛋白占總AKT蛋白的比例增加（圖5）。

圖5 肉桂醛對AKT信號通路的影響

3 討論

我們在該實驗研究中，通過CCK-8法探究了肉桂醛對乳腺癌細胞的增殖毒性，克隆形成實驗及劃痕實驗探究肉桂醛對乳腺癌細胞克隆形成和遷移能力的影響，采用qPCR分析凋亡相關(guān)基因（CASP3、CASP9、BCL2和BAX）的表達，以及WB實驗探究肉桂醛對AKT通路激活的影響。研究結(jié)果表明，肉桂醛降低了人乳腺癌細胞MDAMB-231增殖、克隆形成、以及遷移能力。經(jīng)肉桂醛處理后，乳腺癌細胞中的BAX表達水平上升，BCL2表達水平下降，可能是BCL2與BAX基因協(xié)同誘導線粒體依賴性凋亡[9]；CASP3表達水平下降而CASP9表達水平升高，可能是抑制乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的機制[10]。肉桂醛作用于乳腺癌細胞后，AKT通路激活。

抑制PI3K-AKT信號通路起抗腫瘤作用得到廣泛驗證[11-12]，但我們實驗中發(fā)現(xiàn)肉桂醛能夠抑制乳腺癌細胞的生長，且在測定范圍內(nèi)抑制作用與濃度呈正相關(guān)，然而肉桂醛對AKT蛋白的磷酸化也隨著濃度而增多。不同細胞之間，不同藥物發(fā)揮作用所激活的通路不盡相同[13]； LI L等發(fā)現(xiàn)，欖香烯誘導腫瘤凋亡，卻也在短時間內(nèi)使AKT和ERK通路激活[14]。由于信號通路串擾的存在[15]，探明藥物發(fā)揮作用的分子機制需要進一步實驗探究，如增加不同時段AKT激活情況及ERK1/2通路的激活情況等。

在本研究中，只探討了肉桂醛對乳腺癌細胞MDA-MB-231的抑制作用，并未對其侵襲能力及骨轉(zhuǎn)移。進一步明確肉桂醛體外抑制乳腺癌細胞分子機制后，可以探究對轉(zhuǎn)移相關(guān)基因表達以及體內(nèi)實驗驗證。

4 結(jié)論

在體外實驗中，肉桂醛能夠抑制乳腺癌細胞MDA-MB-231的增殖活性、克隆形成能力以及細胞遷移能力，以及誘導細胞凋亡。