李鑫，劉文,2*，宋信莉，石婭，舒萬芬，張甘純，劉興德

(1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550025；2.貴州醫(yī)科大學(xué)，貴州 貴陽 550025)

0 引言

潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative Colitis，UC)是一種原因不明的慢性結(jié)腸和直腸炎癥性腸病，開始于直腸的黏膜炎癥，并持續(xù)向近端擴展。典型癥狀為帶血腹瀉、腹痛、糞便急迫性和里急后重等[1]。本病可發(fā)生在任何年齡段，病情輕重不一，反復(fù)發(fā)作，難以根除，現(xiàn)在尚無達到根治治療的藥物[2]。因此尋找開發(fā)新的具有治療效果的藥物刻不容緩。

傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)根據(jù)其臨床表現(xiàn)可將其歸屬于“腹痛”“泄瀉”“痢疾”“便血”“腸辟”等范疇。中醫(yī)認為本病的病位在脾胃和大小腸，與肝腎關(guān)系密切，治療上多從調(diào)理脾胃、肝、腎、大小腸等多方面著手[3]。芍藥甘草湯是《傷寒論》中的經(jīng)典方劑，治傷寒傷陰，經(jīng)脈失濡，腿腳攣急，肝脾不和，脘腹疼痛。白芍甘草二藥合用，酸甘化陰，調(diào)和肝脾，緩急止痛，現(xiàn)代藥理研究表明具有解痙、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗炎的作用[4-5]。臨床研究證實具有治療UC的作用，但具體作用機制尚不清楚[6-7]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)通過多學(xué)科將藥物、靶點、疾病之間的相互關(guān)系交叉整合，從而系統(tǒng)的闡明藥物的作用的機制[8]。這與中藥及中藥復(fù)方多成分、多靶點、多途徑治療疾病的思想相吻合，為中藥復(fù)方靶點預(yù)測、作用機制提供了新的研究方法與科學(xué)的技術(shù)支持。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，探索芍藥甘草湯治療UC的物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機制，為藥物的開發(fā)和應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 芍藥甘草湯活性成分及作用靶點收集

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫(http://tcmspw.com/tcmsp.php)獲取芍藥甘草湯中2種藥物的所有成分?；衔镆l(fā)展成為藥物需要具有良好的口服生物利用度(oral bioavailability，OB)和類藥性(druglikeness，DL)，根據(jù)OB≥30%且DL≥0.18的兩個ADME屬性值進行活性成分的篩選以獲得藥物活性成分及相應(yīng)的靶點蛋白。同時，結(jié)合文獻檢索補充OB<30%或<0.18但確實具有藥理活性的成分，最終整合確定芍藥甘草湯主要活性成分。通過Uniprot數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)對靶點蛋白名稱進行標準化，物種選擇 “homo sapiens”，獲得蛋白的基因名稱。

1.2 疾病靶點收集

以“ulcerative colitis”為關(guān)鍵詞，通過Gene Card(https://www.genecards.org/)、OMIM (https://www.omim.org/)和DisGENET(https://www.disgenet.org/)數(shù)據(jù)庫得到與UC相關(guān)的疾病靶點。在GeneCard數(shù)據(jù)庫中，Score值越高則代表該靶點與疾病關(guān)系越密切，靶點過多時設(shè)定Score值大于中位數(shù)的目標靶點為UC的潛在靶點。合并3個數(shù)據(jù)庫檢索的結(jié)果，篩除重復(fù)值后得到UC靶點。

1.3 核心靶點篩選和蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)構(gòu)建

為明晰芍藥甘草湯活性成分相關(guān)靶點與UC靶點之間的相互作用，使用Venny 2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)在線工具繪制二者相交靶點的韋恩圖。將交集靶點提交至STRING(https://stringdb.org/)數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)模型，蛋白種屬設(shè)置為“homo sapiens”，最小互相作用閾值設(shè)定為“highest confidence”(>0.9)，其余設(shè)置均為默認設(shè)置。將結(jié)果通過Cytoscape3.8.2對結(jié)果進一步分析，將Degree值大于2倍中值的節(jié)點確定為核心靶點，構(gòu)建得到PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 基因本體論(GO)和通路富集分析

將芍藥甘草湯治療UC的核心靶點導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫((https://david.ncifcrf. gov/)，選擇生物過程(biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF)和細胞組成(cellular component，CC)選項得到GO 生物功能分析結(jié)果，選擇KEGG pathways選項得到 KEGG 通路富集分析結(jié)果。使用bioinformatics(http://www.bioinformatics.com.cn/)平臺以條形圖與氣泡圖的可視化形式呈現(xiàn)富集結(jié)果。

1.5 “藥物成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

運用Cytoscape 3.8.2軟件，將活性成分、核心靶點和通路導(dǎo)入，構(gòu)建“藥物成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)。利用Cytoscape 3.8.2內(nèi)置工具分析該網(wǎng)絡(luò)連接度(Degree)、介度(Betweenness)及緊密度(Closenesss)等參數(shù)，判斷關(guān)鍵靶點發(fā)揮藥效的主要活性成分及作用機制。

2 結(jié)果

2.1 芍藥甘草湯活性成分靶點

通過檢索，最終得到白芍活性成分15個，甘草活性成分95個，去除三個重復(fù)值共得到107個活性成分。利用TCMSP數(shù)據(jù)庫查找和文獻補充得到白芍成分作用靶點138個，甘草成分作用靶點1833個，其中有9個化合物未找到相應(yīng)的靶點，合并刪除重復(fù)值得芍藥甘草湯297個靶點。

2.2 疾病靶點的獲取

通過GeneCard獲得UC相關(guān)靶點4623個，通過設(shè)定Score>中位數(shù)(1.5)的靶點為治療UC的潛在靶點，最后獲得相關(guān)靶點2325個，合并DisGENET獲取的1458個和OMIM獲得的110個相關(guān)靶點，刪除重復(fù)靶點，得到疾病靶點2942個。

2.3 核心靶點篩選和PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將芍藥甘草湯中的297個藥物靶點與UC相關(guān)的2942個疾病靶點通過Venny 2.1.0 軟件取交集，繪制韋恩圖，如圖1，獲得190個交集靶點。將交集靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫中，下載得到的結(jié)果數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape軟件中，進行拓撲學(xué)分析，以Degree值≥2倍中值(14)得到43個靶點，見圖2，這些靶點與其他靶點關(guān)聯(lián)度密切，可能在治療UC中占據(jù)重要地位，為治療UC的核心靶點。

圖1 芍藥甘草湯與潰瘍性結(jié)腸炎交集靶點韋恩圖

圖2 核心靶點PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 GO富集分析結(jié)果

將43個核心靶點通過DAVID數(shù)據(jù)庫進行GO富集分析，以P<0.01，F(xiàn)DR<0.05為限定條件，結(jié)果得到247個富集條目，其中BP分析獲得195個條目，主要涉及RNA聚合酶II啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、以DNA為模板的轉(zhuǎn)錄正調(diào)控、凋亡過程的負調(diào)控、一氧化氮生物合成過程的正調(diào)控、凋亡過程、炎癥反應(yīng)等；CC分析獲得13個條目，主要涉及核質(zhì)、胞質(zhì)溶膠、細胞外空間、蛋白質(zhì)復(fù)合物、I-kB/NF-kB復(fù)合體、細胞質(zhì)、線粒體等；MF分析獲得39個條目，主要涉及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、酶結(jié)合、相同的蛋白質(zhì)結(jié)合、蛋白質(zhì)異二聚體活性、蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)合等。富集分析結(jié)果前20的條目，見圖3。

圖3 芍藥甘草湯核心靶點GO條目

2.5 通路富集分析結(jié)果

43個核心靶點通路富集共獲得104條通路(P<0.01，PDR<0.01)，主要涉及TNF信號通路、NOD樣受體信號通路、Toll樣受體信號通路、HIF-1信號通路、MAPK信號通路、炎性腸病(IBD)、PI3KAkt信號通路等。前30條通路相關(guān)信息，見圖4。

圖4 排名前30的通路富集分析結(jié)果氣泡圖

2.6 “藥物成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

將前30條通路以及通路中潛在的靶點與其相關(guān)的藥物成分導(dǎo)入Cytoscape3.8.2軟件中，得到“藥物成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)圖，如圖5。該網(wǎng)絡(luò)共有161個節(jié)點(89個成分、42個靶點、30條通路)和831條邊。

圖5 “藥物成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)圖

3 討論

目前，UC的病因和發(fā)病機制尚不清楚，一般認為是與遺傳、環(huán)境、微生物和免疫等因素復(fù)雜相互作用的結(jié)果，但炎癥和氧化應(yīng)激被認為是UC病理生理的基本機制[9]?，F(xiàn)在研究證明UC治療過程涉及多條通路，且各通路之間相互作用，因此尋找多靶點、多環(huán)節(jié)、多系統(tǒng)的可調(diào)控多條信號通路發(fā)揮療效的中藥復(fù)方成為治療UC的趨勢[10-11]。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)科學(xué)系統(tǒng)的分析芍藥甘草湯對UC的作用機制，為UC的治療提供新的可能。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對于芍藥甘草湯的研究是通過在TCMSP數(shù)據(jù)庫分別以芍藥、甘草為關(guān)鍵詞搜索化學(xué)成分，方中所用的蜜炙甘草與甘草藥材的化學(xué)成分類型沒有明顯變化，但是其中主要化學(xué)成分的含量發(fā)生了變化，其中甘草酸、甘草皂苷 G2、甘草皂苷 E2的含量蜜炙高于生品，這一定程度上可說明白芍、甘草化學(xué)成分可代表全方的化學(xué)成分[12-13]。

篩選得到6個白芍成分為β-谷甾醇、兒茶素、芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、沒食子酸、山奈酚和甘草排名靠前的成分為槲皮素、甘草查而酮A、芒柄花黃素、甘草次酸、異甘草素、甘草酸。目前研究發(fā)現(xiàn)芍藥苷具有顯著的抗炎、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、解痙的作用[14]，在UC治療方面，芍藥苷可以抑制腸系膜和結(jié)腸組織中NLRP3蛋白并抑制細胞因子IL-1β的釋放[15]，也可通過抑制TLR5的表達以及T細胞活化，減輕小鼠潰瘍性結(jié)腸炎。抑制小鼠MAPK/NF-κB途徑和細胞凋亡來預(yù)防結(jié)腸炎，在此過程中芍藥苷不止體現(xiàn)抗炎作用，很可能其抗氧化、鎮(zhèn)痛等效果同時作用于NF-κB信號通路發(fā)揮治療作用[16-18]。方新華等[19]研究芍藥內(nèi)酯苷對UC的治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)芍藥內(nèi)酯苷可顯著降低TNF-α、IL-1β、IL-10、5-HT水平，TLR4、MyD 88和NF-κB p65的蛋白表達也顯著降低，Tollip的表達上調(diào)，證明其發(fā)揮治療作用。沒食子酸具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤的作用，在治療UC方面，沒食子酸顯著增加IL-4和IL-10的表達，下調(diào)了IL-1β、IL-6、TNF-α等表達，有效抑制TNBS誘導(dǎo)的NF-κB信號傳導(dǎo)通路[20]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，甘草查而酮A具有顯著的抗炎抗氧化等活性，并且能夠顯著的抗DSS誘導(dǎo)的UC，作用機制很可能通過抑制NF-KB信號通路發(fā)揮抗炎和和激活Nrf2信號通路發(fā)揮抗氧化作用[21]。甘草酸具有抗炎、抗變態(tài)反應(yīng)、抗?jié)冃越Y(jié)腸炎、抗病毒、抗腫瘤等作用，羅琪明[22]經(jīng)直腸及口服途徑給藥甘草酸苷治療UC大鼠后，結(jié)腸組織中髓過氧化物酶(MPO)活性降低，超氧化物歧化酶(SOD)活性增加、丙二醛(MDA)含量降低，顯示甘草酸苷對炎癥性腸病有明顯治療作用。甘草次酸能夠調(diào)節(jié)NF-κB和IκB等轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化，對潰瘍性小鼠顯現(xiàn)較好的治療效果[23]。異甘草素能夠抑制巨噬細胞向M2型轉(zhuǎn)化及下調(diào)COX-2和iNOS表達和ERK1/2和p38的磷酸化，以及NK-κB的激活，從而改善潰瘍性結(jié)腸炎癥反應(yīng)[24-25]。槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇、兒茶素等成分具有抗炎、抗氧化等作用，可以在未來繼續(xù)深入研究其在UC治療中的作用。以上結(jié)果表明，芍藥甘草湯在對UC的治療可能是通過多種成分的協(xié)同達到治療效果。

本研究預(yù)測得到STAT3、JUN、MAPK14、RELA、TNF、IL-6、AKT1、IL-1β、NFKB1等為芍藥甘草湯治療UC的核心靶點。TNF-α、IL-6、IL-1β為典型的促炎細胞因子，促炎細胞因子的過度產(chǎn)生和抑炎因子的生成不足是促使UC發(fā)生的重要環(huán)節(jié)[26-27]。STAT3與增殖、凋亡、細胞周期調(diào)控等過程有關(guān)，在UC病變腸粘膜中，STAT3及其活化形式磷酸化STAT3水平均升高，參與各種細胞因子和生長因子包括干擾素(IFN)、表皮生長因子(EGF)、IL-5、IL-6等的反應(yīng)[28]。MAPK14 (p38α)在UC疾病進程中發(fā)揮著重要的作用，通過復(fù)雜的信號途徑調(diào)控TNF-α、IL-1β的等促炎因子的釋放[29]。NFKB1是核因子κB(NF-κB)家族一組關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，參與多種調(diào)節(jié)過程，包括先天和適應(yīng)性免疫反應(yīng)、細胞生長、凋亡和組織分化，UC等慢性炎癥的發(fā)生與其關(guān)系密切[30]。芍藥甘草湯可能通過作用于以上這些靶點發(fā)揮治療UC的作用。

GO功能分析結(jié)果表明，芍藥甘草湯中的活性成分可能是核質(zhì)、胞質(zhì)溶膠、細胞外空間、蛋白質(zhì)復(fù)合物、I-kB/NF-kB復(fù)合體、細胞質(zhì)、線粒體等細胞組分參與RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、以DNA為模板的轉(zhuǎn)錄正調(diào)控、凋亡過程的負調(diào)控、一氧化氮生物合成過程的正調(diào)控、凋亡過程、炎癥反應(yīng)等生物學(xué)過程。這些結(jié)果提示了芍藥甘草湯可能通過多組分參與多個生物過程從而協(xié)同發(fā)揮了對UC的治療。

KEGG功能分析結(jié)果表明，芍藥甘草湯治療UC可能與參與干預(yù)TNF信號通路、NOD樣受體信號通路、Toll樣受體信號通路、HIF-1信號通路、MAPK信號通路、炎性腸病(IBD)、PI3K-Akt信號通路等有關(guān)。TNF-α為TNF核心家族成員之一，其在UC中發(fā)揮的作用主要有TNF-α促進NF-κB進一步活化、增加上皮細胞通透性、刺激基質(zhì)金屬蛋白酶MMPs產(chǎn)生、刺激促炎因子IL-1β、IL-6、IL-8、MMP-1、MMP-3等的合成與分泌，使炎性反應(yīng)不斷擴大和持續(xù)[31]。研究顯示，芍藥甘草湯中的活性成分還可能通過作用于TNF信號通路中JUN、FOS、MAPK14、TNF、NFKB1、IL-6、IL-1β等靶點，達到對UC的治療。MAPK通路在細胞的生長、生化、應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等方面發(fā)揮調(diào)控作用，MAPK信號通路，通過ERK、JNK和p38三條級聯(lián)反應(yīng)途徑，調(diào)控IL-1β、TNF-α、IL-6等炎性因子的轉(zhuǎn)錄，從而導(dǎo)致腸道黏膜炎癥的發(fā)生[32]。另外研究結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，芍藥甘草湯中的活性成分可能作用于TNF、NFKB1、IL1B、AKT1、JUN、TGFB1、FOS等關(guān)鍵靶點，達到對MAPK信號通路的調(diào)控，從而降低UC炎癥反應(yīng)。Toll樣受體信號通路參與了免疫系統(tǒng)的應(yīng)答，能夠激活NF-κB引起促炎細胞因子IL-1β、IL-6、TNF等的基因轉(zhuǎn)錄，進而使一系列炎癥反應(yīng)發(fā)生[33]。研究發(fā)現(xiàn)芍藥甘草湯活性成分可能作用于JUN、CXCL8、STAT1、FOS、MAPK14、TNF、NFKB1、IL-6、IL1B、AKT1、MAPK1、MAPK3等靶點，調(diào)節(jié)Toll信號通路的免疫應(yīng)答，降低炎癥反應(yīng)。PI3K-Akt信號通路在腸道炎癥中發(fā)揮重要作用，AKT是PI3K下游的直接靶蛋白，AKT活化后啟動下游信號通路，釋放IL-6、TNF-α、IL-1β、干擾素-1(IFN-1)等炎癥因子和Fas/FasL、Caspase9等促調(diào)亡蛋白，從而維持腸道炎癥、促進腸上皮細胞調(diào)亡，導(dǎo)致疾病遷延難愈，癌變率增高[34]。以上的通路與UC的發(fā)生發(fā)展有著密切關(guān)系，通路上存在著許多芍藥甘草湯活性成分可以作用的靶點，芍藥甘草湯對UC的治療可能是對多條通路的協(xié)同調(diào)控達到治療。

4 結(jié)論

芍藥甘草湯可能是通過調(diào)控STAT3、JUN、MAPK14、RELA、TNF、IL-6、AKT1、IL-1β、NFKB1等靶點和TNF信號通路、NOD樣受體信號通路、Toll樣受體信號通路、HIF-1信號通路、MAPK信號通路、炎性腸病(IBD)、PI3KAkt等信號通路發(fā)揮抗炎、抗氧化應(yīng)激等功能達到抗UC的作用。為揭示芍藥甘草湯在治療UC上是多成分、多靶點、多通路協(xié)同作用的結(jié)果，為中藥的開發(fā)與疾病的治療提供了新的思路與參考。