申國霞，宋 麗，常 鑫

(1.蘭州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.青島銘家尚品餐飲管理有限公司，山東 青島 266000)

沙門氏菌屬屬于常見食品污染菌，主要包含：鼠傷寒沙門氏菌(S.typhimurium)，豬霍亂沙門氏菌(S.choleraesuis)，腸炎沙門氏菌(S.enteritidis)等十余種。且人工食品檢疫過程對沙門氏菌有生態(tài)優(yōu)選定向進化作用，導(dǎo)致沙門氏菌偏向不耐常規(guī)培養(yǎng)基的定向變異進化。即常規(guī)食品檢測用培養(yǎng)基被大量使用后，沙門氏菌會對培養(yǎng)基產(chǎn)生不耐性，所以必須及時調(diào)整培養(yǎng)基組分，對抗沙門氏菌定向變異進化中對培養(yǎng)基產(chǎn)生的不耐性。

較長時間以來，瓊脂培養(yǎng)基多作為沙門氏菌的檢測用培養(yǎng)基。該研究測試包含木糖醇、賴氨酸、脫氧膽酸鈉等組分的瓊脂培養(yǎng)基，對比其與其他組分培養(yǎng)基的沙門氏菌不耐性表達。由于生物技術(shù)的不斷發(fā)展，沙門氏菌的檢測和鑒定技術(shù)也在不斷地完善，常用的方法為：常規(guī)生化鑒定方法、免疫學(xué)方法和分子生物學(xué)方法。

沙門氏菌屬專對性致病菌，有的沙門氏菌只對動物致病，也有的沙門氏菌對人和動物都致病。平時認為的沙門氏菌病就是指由各種類型的沙門氏菌所引起的對人類、家畜以及野生禽獸引發(fā)不同形式病菌的總稱。被感染沙門氏菌的人或帶菌者的糞便污染過食品，也可使人發(fā)生食物中毒現(xiàn)象。據(jù)相關(guān)統(tǒng)計，在全球的種類細菌性食物中毒中，因此需要我們根據(jù)沙門氏菌的形態(tài)學(xué)特征、培養(yǎng)特征、生理生化特征、抗原特征、噬菌體特征等相關(guān)特征，進行沙門氏菌培養(yǎng)對食用檢測用木糖醇氨酸脫氧膽鹽瓊脂培養(yǎng)基敏感度與特異性實驗研究。

1 研制過程與實驗方法

1.1 試劑的選擇與制備

麥芽浸粉瓊脂，上海阿拉丁生化；木糖醇，山東歐恩科化學(xué)；L-賴氨酸，上海國藥；脫氧膽酸鈉，上海尚寶生物；均為分析純。

配方為(質(zhì)量比)：麥芽浸粉瓊脂48%，木糖醇42%，L-賴氨酸8%，脫氧膽酸鈉2%；制劑儲備含水量≤5%，實驗含水量150%～165%；制備環(huán)境為三級生化無菌環(huán)境。

實驗所有的水為軟水或蒸餾水，符合GB/6682標(biāo)準(zhǔn)三級以上用水。蒸餾法是目前實驗室中廣泛采用的制備實驗室用水的方法，將原料水加熱蒸餾就得到蒸餾水。用離子交換樹脂制備純水的方法，有單床法、復(fù)床法及混合床法三種。單床法是只通過一種樹脂，除去一種離子。如為了某種特殊用途，將蒸餾水通過陽離子交換樹脂，即可得到不含金屬陽離子的水。復(fù)床法是將陰離子與陽離子交換樹脂串聯(lián)起來，水中的陰、陽離子先后都被除去，得到高純度的去離子水。

1.2 目標(biāo)菌群的選擇

該試劑設(shè)計目標(biāo)菌群為：傷寒桿菌；甲型副傷寒桿菌；乙型副傷寒桿菌；丙型副傷寒桿菌；鼠傷寒桿菌；豬霍亂桿菌；腸炎桿菌；對上述7種常見沙門氏菌在該培養(yǎng)基中的不耐性表現(xiàn)，對比2個參照組培養(yǎng)基的不耐性表現(xiàn)，探討該研究設(shè)計培養(yǎng)基敏感度與特異性的特征。

1.3 參照組設(shè)計

本次參照組A和參照組B的設(shè)計按照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 沙門氏菌檢驗》GB/T 4789.4—2016標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行，具體設(shè)計如下：

參照組A：牛肉膏瓊脂培養(yǎng)基，配方為：牛肉膏0.3 g(分析純，北京紅潤寶順科技)，蛋白胨1.6 g(分析純，北京紅潤寶順科技)，氯化鈉0.5 g(微米分析純，西安錦源生物)，麥芽浸粉瓊脂15.2 g(分析純，上海阿拉丁生化)，水100 ml(電解分析純，實驗室自行提取)。

參照組B：乳糖膽鹽瓊脂培養(yǎng)基，配方為：乳糖1.3 g(分析純，天津金玻化生物)，麥芽浸粉瓊脂17.2 g(分析純，上海阿拉丁生化)，氯化鈉0.6 g(微米分析純，西安錦源生物)，脫氧膽酸鈉1.2 g(分析純，上海尚寶生物)，水100 ml(電解分析純，實驗室自行提取)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

上述7種菌群，混合食用蛋白粉、食用淀粉等分別制成150、75、25、5 mg/kg濃湯混濁液，共28種，每種制備600份，每200份使用觀察組(該研究設(shè)計的木糖醇氨酸脫氧膽鹽瓊脂培養(yǎng)基)、參照組A(牛肉膏瓊脂培養(yǎng)基)、參照組B(乳糖膽鹽瓊脂培養(yǎng)基)進行24 h體溫恒溫培養(yǎng)，使用850倍光學(xué)電鏡考察。

培養(yǎng)后，光學(xué)電鏡下不可見標(biāo)記培養(yǎng)皿為“-”，光學(xué)電鏡下可見但肉眼不可見標(biāo)記培養(yǎng)皿為“+”，肉眼可見但培養(yǎng)皿內(nèi)覆蓋面不高于20%標(biāo)記培養(yǎng)皿為“++”，肉眼可見且培養(yǎng)皿內(nèi)覆蓋面高于20%標(biāo)記培養(yǎng)皿為“+++”。統(tǒng)計上述28種各3組，共84組培養(yǎng)皿中“-/+/++/+++”標(biāo)記產(chǎn)生的數(shù)量占比。

另外對3種培養(yǎng)基各設(shè)置200份無菌參照組，作為特異性觀察依據(jù)。并使用SPSS大數(shù)據(jù)分析軟件展開線性回歸對二組數(shù)據(jù)進行分析，P<0.05具有一定的統(tǒng)計學(xué)意義。

2 培養(yǎng)基不耐性及特異性試驗結(jié)果

根據(jù)上述實驗設(shè)計進行相關(guān)培養(yǎng)實驗，觀察組、參照組A、參照組B在不同濃度不同人工培養(yǎng)含菌培養(yǎng)環(huán)境中的表現(xiàn)如表1所示。

由表1可見，7種含菌培養(yǎng)液致病菌種類分別為：第1類傷寒桿菌；傷寒桿菌是一種致病菌，主要存在于腸道當(dāng)中，通過傷寒病人的排泄物傳播，是較為嚴(yán)重的腸道傳染病。第2類甲型副傷寒桿菌；屬于腸道桿菌，一般可以通過日常的用水、食物、蒼蠅、接觸等進行傳播，具有一定的傳染性。第3類乙型副傷寒桿菌；是一種腸道的乙類傳染性疾病，多發(fā)生在兒童。第4類丙型副傷寒桿菌；在自然條件下，副傷寒桿菌一般只能感染人類，僅偶而感染動物。第5類鼠傷寒桿菌；屬多價O抗血清的B群，是一種臨床較常見的沙門菌，鼠傷寒沙門菌是一種重要的人畜共患病原菌，其感染發(fā)病率居沙門菌感染的首位，多見于嬰幼兒，可導(dǎo)致醫(yī)院感染和暴發(fā)性食物中毒，病死率較高。第6類豬霍亂桿菌；豬霍亂沙門氏菌是非傷寒沙門菌的一種，是引起仔豬副傷寒的主要病原菌。第7類腸炎桿菌；是一種細菌，能引起腸道的炎癥和其他病變，一般在臨床常常出現(xiàn)惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉、稀水便或粘液膿血便等癥狀。按統(tǒng)計目標(biāo)，所有含菌培養(yǎng)液混合培養(yǎng)基后，出現(xiàn)的“-”標(biāo)記均為假陰性標(biāo)記，觀察組在5 mg/kg條件下的假陰性率為16.5%，在25 mg/kg條件下的假陰性率為5.5%，在75 mg/kg條件下的假陰性率為1.5%，在150 mg/kg條件下的假陰性率為0，2個參照組的假陰性率均顯著高于觀察組。為了比較二者的假陽性率，對比分析3種培養(yǎng)基在空白培養(yǎng)皿中上述7種致病菌的檢出率，得到表2。

表1 不同菌群濃度在不同培養(yǎng)基中的表現(xiàn)

表2中，顯示出空白培養(yǎng)皿中常見致病菌檢測敏感度和特異性與對照組的相關(guān)差異，7種含菌培養(yǎng)液致病菌種類同表1，200份空白培養(yǎng)皿的合計結(jié)果中，觀察組檢出假陽性8個，占比為4.0%，參照組A檢出假陽性52個，占比為26.0%，參照組B檢出假陽性36個，占比為18.0%。其中觀察組僅有標(biāo)記為“+”的弱假陽性培養(yǎng)皿，而標(biāo)記為“++”或“+++”的強假陽性培養(yǎng)皿中，參照組A為3.0%，參照組B為1.0%。

表2 空白培養(yǎng)皿中常見致病菌檢出情況

3 培養(yǎng)基制備實驗結(jié)果與結(jié)論

培養(yǎng)基是人工配制的適合微生物生長繁殖或積累代謝產(chǎn)物的營養(yǎng)基質(zhì)，用以培養(yǎng)、分離、鑒定、保存各種微生物或積累代謝產(chǎn)物。

該實驗制備的觀察組培養(yǎng)基為木糖醇氨酸脫氧膽鹽瓊脂培養(yǎng)基，參照組A為牛肉膏瓊脂培養(yǎng)基，參照組B為乳糖膽鹽瓊脂培養(yǎng)基。2個參照組培養(yǎng)基均為在食品沙門氏菌檢測中的常用培養(yǎng)基。實驗中重點分析了這3種培養(yǎng)基在不同致病菌濃度條件下的假陽性率和假陰性率，證實觀察組培養(yǎng)基的假陽性率和假陰性率均顯著低于2個參照組培養(yǎng)基。根據(jù)生物醫(yī)學(xué)統(tǒng)計學(xué)范例，敏感度為真陽性率，即100%減去假陽性率，特異性為真陰性率，即100%減去假陰性率，所以，觀察組培養(yǎng)基的敏感度和特異性均顯著高于2個參照組。在150 mg/kg的人造污染食品混濁液的檢測中，觀察組培養(yǎng)基可以實現(xiàn)100%敏感度，其他2個參照組在此濃度條件下的敏感度分別為98.0%和98.5%。在5 mg/kg的人造污染食品混濁液的檢測中，觀察組培養(yǎng)基可以實現(xiàn)83.5%的敏感度，其他2個參照組在此濃度條件下的敏感度分別為51.5%和73.5%。上述2個參照組培養(yǎng)基在相關(guān)文獻中表明，其最早推廣應(yīng)用時的敏感度和特異性遠高于該實驗實測值，即根據(jù)前文假設(shè)的定向變異進化體質(zhì)，上述兩種培養(yǎng)基有被新培養(yǎng)基取代的技術(shù)必要性。實驗中配制培養(yǎng)基時，都要根據(jù)不同微生物的要求將培養(yǎng)基的pH值調(diào)到合適的范圍。此外，由于配制培養(yǎng)的各類營養(yǎng)物質(zhì)和容器等含有各種微生物，因此，已配制好的培養(yǎng)基必須立即滅菌.如果來不及滅菌，應(yīng)暫存冰箱內(nèi)，以防止其中的微生物生長繁殖而消耗養(yǎng)分和改變培養(yǎng)的酸堿度所帶來不利的影響。木糖醇氨酸脫氧膽鹽瓊脂培養(yǎng)基具有作為新型沙門氏菌培養(yǎng)基的技術(shù)可行性，不僅為免疫學(xué)中致病菌的快速檢測提供了新方法，同時還大大提高了致病菌檢測的靈敏性和特異性。