莫紫梅，袁光蔚，王海波，陳寧周，寧 芯，覃 思，何林飛

(1.廣西-東盟食品檢驗檢測中心，廣西 南寧 530022; 2.玉林師范學院化學與食品科學學院，廣西 玉林 537000)

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol, DON)又稱為嘔吐毒素，屬B型單端孢霉烯族化合物，是鐮刀菌屬的菌種引起的谷物赤霉病的重要指示性毒素，會影響免疫細胞因子的分泌、抑制淋巴細胞增殖、具有吞噬作用和巨噬細胞的殺菌作用，有很強的免疫抑制作用，可以誘導免疫細胞凋亡，抑制其增殖[1-3]，人畜如果長期食用被DON污染的食物，會引起細胞毒性和神經(jīng)毒性等，其危害直接影響到了人和家畜的健康安全[1-2]。嘔吐毒素化學性質穩(wěn)定，受熱不易分解，通常存在于全球各地區(qū)的小麥、玉米和大麥等農作物中，是一種嚴重污染谷物的霉菌毒素，在作物加工、儲存及食品烹調過程中不容易被破壞，對人類和動物健康構成很大威脅[3]。

目前測定嘔吐毒素比較常用的檢測方法有薄層色譜法[4-5]、親和高效液相色譜法[6]。但這些分析方法在應用上有一定的局限性，具有耗時長、成本高等缺點，需要大型的儀器設備，無法在現(xiàn)場靈活使用[7-8]。近些年也出現(xiàn)了一些快速簡便的DON檢測方法，如聚合酶鏈反應(PCR)技術[6]、酶聯(lián)免疫分析(ELISA)法[6-7]、光纖生物傳感器技術[5]、膠體金免疫層析法[9-10]及免疫熒光技術[11-13]等。這些技術由于具有現(xiàn)場檢驗快速、簡便的特點，特別適合于廣大基層人員使用和大批量食品檢測以及大面積地區(qū)普查，具有巨大的發(fā)展?jié)摿蛷V闊的市場應用前景[14-15]。

免疫熒光技術是近年發(fā)展起來的新興技術，擁有傳統(tǒng)相關技術不可比擬的優(yōu)勢。但因為傳統(tǒng)的熒光染料如異硫氰酸熒光素的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜互相干擾嚴重，一定程度上限制了免疫熒光技術的應用范圍。而熒光量子點(QDs)作近幾年出現(xiàn)的新型熒光標記材料，因為其具有發(fā)射光譜范圍窄且對稱、Stokes位移大、背景噪聲小等優(yōu)點，致使其靈敏度和分辨率得到顯著提高，并引起了各國研究者的極大關注[16-17]。熒光免疫層析定量檢測技術是在免疫層析技術的基礎上，利用熒光定量分析技術對標記物濃度進行檢測的一種新方法[16]。使用熒光量子點作為熒光標記材料的熒光免疫層析定量檢測技術，通過量子點標記嘔吐毒素抗體與樣品中的嘔吐毒素結合，在毛細作用下向前層析，達到檢測區(qū)后，檢測線T線上固定的嘔吐毒素抗原與剩余未結合的量子點標記嘔吐毒素抗體結合。檢測線T線上結合的量子點標記的嘔吐毒素抗體的量與樣品中嘔吐毒素的濃度成反比，控制線C線結合的量子點熒光標記物與樣品中嘔吐毒素的濃度無關。層析結束后，采用 NepQD-Infinity-V1快速免疫熒光分析儀讀取T線和C線的熒光強度并計算T/C值，通過標準曲線即可計算出樣品中嘔吐毒素的含量。

本試驗采用同位素稀釋液相色譜-串聯(lián)質譜法和NepQD-Infinity-V1快速免疫熒光分析儀快速定量檢測谷物中嘔吐毒素的含量，通過2種方法的比較，確定量子點熒光免疫層析法檢測谷物中嘔吐毒素的可行性和可靠性，且該法操作簡單，檢測時間短，特異性良好，有望用于各地市場現(xiàn)場快速定量檢測嘔吐毒素，在公共食品安全等領域具有重要的實際意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1儀器與設備

QUINTIX313-ICEU電子天平,德國賽多利斯公司；RDTANA460R離心機,美國Thermo Fisher Scientific公司；Multi Reax多管式渦旋振蕩器,德國海道夫公司；NepQD-Infinity-V1快速免疫熒光分析儀,江蘇量點科技有限公司；Milli-Q 超純水系統(tǒng),美國Milli-pore 公司；EBA 270離心機,德國Hettich科學儀器公司；Shimadzu DGU-20A超高效液相色譜儀,日本島津公司；AB QTRAP 4500 MS四極桿質譜儀(配電噴霧離子源),美國AB SCIEX公司。

1.1.2材料與試劑

DON稀釋液B(20210101)；實驗室用水為Milli-Q超純水。甲醇、甲酸、乙酸、乙酸銨(色譜純),默克股份公司；嘔吐毒素標準溶液(100.10 μg/ml)、嘔吐毒素免疫親和柱，ROMER LABS有限公司。

1.2 方法

1.2.1量子點熒光免疫層析法

(1)樣品前處理

玉米前處理：取20～30 g玉米樣品于粉碎機中進行充分粉碎，可反復2～3次。將粉碎過的樣品過20目(孔徑0.85 mm)篩，收集過篩樣品備用。稱取過篩樣品5 g置50 ml離心管中，加入55%甲醇溶液25 ml，混勻，旋渦震蕩10 min，6 000 g離心3 min，收集上清液。取上清液100 μl，與稀釋液B 400 μl振蕩混勻，待上樣檢測。(注：個別檢測樣品如噴漿玉米皮、噴漿玉米胚芽粨、DDGS等呈酸性時，請微調pH值至6～8，調節(jié)pH值時注意總體積變化不要超過1%)。

小麥前處理：取20～30 g小麥樣品于粉碎機中，進行充分粉碎，可反復2～3次。將粉碎過的樣品過20目篩，收集過篩樣品備用。稱取過篩樣品5 g置離心管中，加入純水25 ml，混勻，旋渦震蕩10 min，6 000 g離心5 min，收集上清液。取100 μl上清液，加入300 μl稀釋液A，充分震蕩2 min，待檢。

(2)樣品檢測

將檢測卡及待檢樣本取出，平衡至室溫，開啟NepQD-Infinity-V1快速免疫熒光分析儀。將檢測卡加樣孔朝上平放，移取的待檢樣本75 μl垂直緩慢滴入檢測卡的加樣孔中，反應15 min，將檢測卡插入 NepQD-Infinity-V1/P1快速熒光分析儀，并進行檢測。

1.2.2高效液相-串聯(lián)質譜法

(1)樣品前處理

按GB 5009.111-2016[18]操作。稱取 2 g(準確至 0.01 g)粉碎試樣于50 ml離心管中，加入400 μl混合同位素內標工作液振蕩混合后靜置30 min。加入20.0 ml乙腈-水溶液(84+16)，置于渦旋振蕩器振蕩20 min，以10 000 r/min 離心5 min，收集上清液 于干凈的容器中備用。

取 5 ml 上清液置于40～50 ℃下氮氣吹干,加入2 ml 水充分溶解殘渣，待嘔吐毒素免疫親和柱內原有液體流盡后，將上述樣液移至玻璃注射器筒中。將空氣壓力泵與玻璃注射器相連接，調節(jié)下滴速度，控制樣液以每秒 1 滴的流速通過免疫親和柱，直至空氣進入親和柱中。用5 ml PBS 緩沖鹽溶液和5 ml水先后淋洗免疫親和柱，流速約為每秒1～2滴，直至空氣進入親和柱中，棄去全部流出液，抽干小柱。準確加入 2 ml 甲醇洗脫親和柱，控制每秒1滴的下滴速度，收集全部洗脫液至試管中，在50℃下用氮氣緩緩地將洗脫液吹至近干，加入 1.0 ml 初始流動相,渦旋 30 s 溶解殘留物，0.22 μ m 濾膜過濾，收集濾液于進樣瓶中以備進樣。

(2)標準溶液的配制

嘔吐毒素標準儲備溶液(100 μ g/ml):分別稱取 DON 1 mg(準確至 0.01 mg)，分別用乙腈溶解并定容至 10 ml。將溶液轉移至試劑瓶中,在-20℃ 下密封保存，有效期 1 年。

標準工作溶液(10 μg/ml):準確吸取100 μg/ml DON標準儲備液1.0 ml 于10 ml 容量瓶中,加乙腈定容至刻度。在-20 ℃ 下密封保存，有效期半年。

同 位 素 內 標 工 作 液(1 μg/ml):準 確 吸 取13C15-DON同 位 素 內 標(25 μg/ml)1 ml于25 ml容量瓶中，加乙腈定容至刻度。在-20 ℃下密封保存,有效期半年。

標準曲線溶液的配制：準確移取適量標準工作溶液和同位素內標工作液，用初始流動相配制成 10、20、40、80、160、320、640 ng/ml的混合標準系列,其中同位素內標濃度為100 ng/ml。標準系列溶液于4 ℃保存，有效期7 d。

(3)色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLCRBEH C18柱(150 mm×2.1 mm，1.7 μm)；柱溫：40℃；流速：0.3 ml/min；進樣量：10 μl；流動相：A 為水，B 為乙腈；采用梯度洗脫程序，見表1。

表1 流動相梯度洗脫條件

(4)質譜條件

離子源：電噴霧離子源；掃描模式：負離子掃描(ESI+)；檢測方式：多反應監(jiān)測模式(MRM)；電噴霧電壓(IS)：5 500 V；離子源溫度：550 ℃；curtain gas(氣簾氣)為35.0 psi；gas 1(霧化氣)、gas2(輔助氣)分別為50，50 psi。MRM相關參數(shù)設定見表2。

表2 嘔吐毒素及其內標物的保留時間、定性離子、定量離子與內標物等MRM相關參數(shù)

2 結果

2.1 線性范圍、檢出限、回收率及精密度

同位素稀釋高效液相色譜-串聯(lián)質譜的標準工作曲線為：Y=3 064.7X+4 811.2，相關系數(shù)r=0.998 6，表明在濃度10～640 ng/ml時線性關系良好，檢出限10.0 μg/kg。

量子點熒光免疫層析法采用NepQD-Infinity-V1快速免疫熒光分析儀內置曲線，其線性方程為：Y2.020 2X+5.016 7，相關系數(shù)R2=0.999 7，其中Y=ln(p/q)，p=OD/OD0，q=1-p，式中X為ln(目標物濃度)，OD為目標物反應值，OD0為目標物濃度為0的反應值均值。量子點熒光免疫層析檢測谷物中嘔吐毒素的線性范圍為25～5 000 μg/kg，檢出限為25 μg/kg。

取陰性樣品進行加標回收試驗，設計3個不同水平，將嘔吐毒素標準溶液添加到空白玉米粉樣品中，混合均勻，按照1.2方法進行試驗，同位素稀釋高效液相色譜-串聯(lián)質譜和量子點熒光免疫層析法的回收率分別為92.9%～98.0%和85.5%～101.1%，精密度為1.3%～3.4%及0.4%～3.0%，見表3。根據(jù) GB/T 27404—2008附錄F[19]中的要求，回收率參考范圍被測組分含量<0.1 mg/kg時，回收率范圍在60%～120%；0.1～1 mg/kg時，回收率范圍在80%～110%；1～100 mg/kg時，回收率范圍在90%～110%；>100 mg/kg時，回收率范圍在95%～105%，符合國標要求。

表3 2種檢測方法線性方程、回收率、檢出限比較

2.2 質控樣及其精密度

采用2種方法對購買具有標準物質證書的質控樣(特性值1 082.5 μg/kg，特性值區(qū)間1 029.2～1 135.8 μg/kg)進行測定。結果表明，同位素稀釋高效液相-串聯(lián)質譜法和量子點熒光免疫層次法的結果分別為1 106.7 μg/kg及1 048.2 μg/kg，均在特性值區(qū)間范圍內，符合要求。且對樣品進行6次獨立重復測試，其相對標準偏差分別為1.9%和2.3%，精密度均符合定量分析的要求。見表4。

表4 2種檢測方法質控樣測定結果

2.3 靈敏度、假陰性率

靈敏度是指方法在實驗條件下達到的實際最低檢出水平時，檢出陽性結果的陽性樣品數(shù)占總陽性樣品數(shù)的百分比。假陰性率是指方法在實驗條件下達到的實際最低檢出水平時，陽性樣品中檢出陰性結果的最大概率(以百分比計)。根據(jù)食藥監(jiān)辦科〔2017〕43號《食品快速檢測方法評價技術規(guī)范》中計算公式，見表5。

表5 熒光量子點免疫層析法靈敏度及假陰性率

在參比方法檢測的所有陽性樣本中：

參比方法的陽性樣本數(shù)量(N1)=快檢陽性數(shù)量(N11)+快檢陰性數(shù)量(N12)

靈敏度(p+，%)=快檢陽性數(shù)量(N11)/(參比方法的陽性數(shù)量(N1))×100(其中參比方法的陽性數(shù)量=快檢陽性數(shù)量+快檢陰性數(shù)量)。

假陰性率(pf-，%)=快檢陰性數(shù)量(N12)/參比方法的陽性數(shù)量(N1)×100

本試驗中，同位素稀釋法高效液相-串聯(lián)質譜法為參比方法，量子點熒光免疫層析為快檢方法。由表6可知，在試驗的193批樣本中，參比方法測定的陽性樣本數(shù)為53批，未檢出的視為陰性樣本共140批。量子點熒光免疫層析法檢測的陽性樣本數(shù)為52批，陰性樣本數(shù)為1批，故熒光量子點免疫層析檢測技術的靈敏度為98.1%，假陰性率為1.9%。

2.4 2種方法一致性的比較

同位素稀釋法高效液相-串聯(lián)質譜法和量子點熒光免疫層析法檢測的193批玉米和小麥粉樣品中，有140批樣本采用2種方法均未檢出嘔吐毒素，其余53批樣本中采用2種方法均檢出嘔吐毒素，2種方法測得結果見表6，其相對偏差為0.16%～4.75%。對2種方法嘔吐毒素檢測結果進行T檢驗，t=0.506 2，t雙衛(wèi)臨尾(0.025,53)=2.311，t

表6 2種方法檢測樣品DON含量的比較

3 結論與討論

量子點熒光免疫層析法檢測糧食中嘔吐毒素的檢出限、回收率、精密度均良好，且和國標檢測方法同位素稀釋高效液相-串聯(lián)質譜法數(shù)據(jù)對比無顯著性差異，符合國標要求。因此，可以認為對熒光量子點免疫層析法快速定量檢測食品中嘔吐毒素的評價良好，該檢測方法可以用于各地市場現(xiàn)場快速定量檢測食品中的嘔吐毒素含量，并將會在公共食品安全等領域具有重要的實際應用意義。

近年來，食品安全問題引起了全世界的普遍關注，尤其是真菌毒素超標問題。嘔吐毒素在自然界中分布廣泛，目前是玉米、小麥等糧食作物污染較嚴重并且毒性最強的天然污染物之一。量子點作為一類理想的熒光探針，不僅是傳統(tǒng)熒光染料的補充，而且在熒光性能方面更優(yōu)越，在免疫分析中的應用是一個值得引起重視的新領域。本試驗利用熒光量子點免疫層析技術檢測玉米及其制品中的嘔吐毒素，空白玉米粉中嘔吐毒素的加標回收實驗取得了較好的結果，其回收率范圍在85.5%～101.1%，精密度在0.4%～3.0%，與 GB 5009.111—2016《食品安全國家標準 食品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其乙?；苌锏臏y定》方法相比，該方法具有分析時間短、步驟簡單、結果可靠等優(yōu)點，且靈敏度、特異性均很好，可在基層快檢中推廣應用，同時也為該方法用于其他真菌毒素的定量熒光免疫檢測提供了參考。