李清華 楊志文

1上海市松江區(qū)中心醫(yī)院消化內(nèi)科，上海 201600；2上海市松江區(qū)中心醫(yī)院藥劑科，上海 201600

胰腺癌臨床表現(xiàn)隱匿、病情進(jìn)展迅速、預(yù)后極差，5年生存率小于5%，中位生存期小于6個(gè)月[1]。胰腺腺泡細(xì)胞導(dǎo)管組織轉(zhuǎn)化是胰腺癌的起始事件之一，巨噬細(xì)胞通過(guò)多種途徑在其中起著重要作用[2-4]。胱天蛋白酶募集域蛋白9(caspase recruitment domain protein 9，card9)是巨噬細(xì)胞中一種重要的免疫炎性蛋白，可通過(guò)激活NF-κB等腫瘤炎性微環(huán)境中重要的信號(hào)分子，在胃癌、腎癌、結(jié)腸癌等腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用[5]。然而，card9在胰腺癌中的作用尚不清楚。本研究探討巨噬細(xì)胞card9在胰腺腺泡細(xì)胞導(dǎo)管組織轉(zhuǎn)化中的作用，從而闡明胰腺癌發(fā)生的分子機(jī)制。

材料與方法

一、siRNA-card9序列合成及巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率

根據(jù)Genbank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫(kù)以及小分子干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)設(shè)計(jì)策略，設(shè)計(jì)3條靶向card9的siRNA(siRNA-card9)序列：siRNA-card9-1正向引物序列為5′-GGGUAAGCUAGACAGGAAUTT-3′，反向引物序列為5′-AUUCCUGUCUAGCUUACCCTT-3′；siRNA-card9-2正向引物序列為5′-CCCUCAGUUAUACCGGAAATT-3′，反向引物序列為5′-UUUCCGGUAUAACUGAGGGTT-3′；siRNA-card9-3正向引物序列為5′-GGACAAAGAUAAGCUUCGATT-3′，反向引物序列為5′-UCGAAGCUUAUCUUUGUCCTT-3′。3條siRNA-card9序列由上海吉瑪公司設(shè)計(jì)及合成。

巨噬細(xì)胞株購(gòu)自上海中科院細(xì)胞庫(kù)，常規(guī)復(fù)蘇、培養(yǎng)及傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的巨噬細(xì)胞，以1×105細(xì)胞加入12孔培養(yǎng)板，加入200 nmol/L的綠色熒光素標(biāo)記的siRNA-card9(購(gòu)自上海吉瑪公司)，培養(yǎng)3、6、12、24、48 h后，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染后的熒光強(qiáng)度，確定siRNA-card9轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞的最佳時(shí)間。

取1×105巨噬細(xì)胞加入12孔培養(yǎng)板，按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)步驟，分別用siRNA-card9-1、siRNA-card9-2和siRNA-card9-3轉(zhuǎn)染，每次設(shè)陰性對(duì)照組，每組各設(shè)3個(gè)復(fù)孔。采用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后各組巨噬細(xì)胞card9 mRNA表達(dá)，篩選最佳抑制巨噬細(xì)胞card9的siRNA。card9正向引物序列為5′-CCAGAGCAGCCCTTTATG-3′，反向引物序列為5′-CTCGGTGTCGGTGTTGTC-3′；內(nèi)參GAPDH正向引物序列為5′-GTGTTTCCTCGTCCCGTAG-3′，反向引物序列為5′-TTAGTGGGGTCTCGCTCC-3′。引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)合成。反應(yīng)條件：95℃ 10 min，95℃ 15 s、60℃ 45 s，40個(gè)循環(huán)。通過(guò)儀器自帶軟件獲取Ct值，以公式2-ΔΔCt計(jì)算mRNA表達(dá)量。

將抑制率最高的siRNA-card9，以100、200、300 nmol/L 3個(gè)不同濃度轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞，采用上述實(shí)時(shí)定量PCR法篩選巨噬細(xì)胞最佳抑制濃度。

二、巨噬細(xì)胞card9蛋白表達(dá)量檢測(cè)

將5×105巨噬細(xì)胞和100 μg/ml β葡聚糖分別加入6孔板，常規(guī)培養(yǎng)12、24 h后分成陽(yáng)性細(xì)胞組(巨噬細(xì)胞)、β葡聚糖刺激陽(yáng)性細(xì)胞組、陰性細(xì)胞組(card9-/-巨噬細(xì)胞)、β葡聚糖刺激陰性細(xì)胞組。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。取各組細(xì)胞加入RIPA裂解液，常規(guī)蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)巨噬細(xì)胞 card9蛋白表達(dá)量?？筩ard9一抗(美國(guó)proteintech公司)1∶1 000稀釋，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗1∶200稀釋，反應(yīng)后ECL發(fā)光，X片曝光、顯影、定影，Image J 軟件計(jì)算各條帶灰度值，以目的條帶與內(nèi)參條帶的灰度值比表示各組巨噬細(xì)胞card9蛋白相對(duì)表達(dá)量。

三、腺泡細(xì)胞導(dǎo)管組織轉(zhuǎn)化標(biāo)志蛋白CK19表達(dá)檢測(cè)

分別取1×105巨噬細(xì)胞、1×105胰腺腺泡細(xì)胞(北京北納生物公司)加入Transwell小室上層和下層共培養(yǎng)，小室濾膜孔徑0.4 μm，100或500 μg/ml β葡聚糖加入上層巨噬細(xì)胞，分為以下6組：(1)陽(yáng)性細(xì)胞組(巨噬細(xì)胞+腺泡細(xì)胞)；(2)陰性細(xì)胞組(card9-/-巨噬細(xì)胞+腺泡細(xì)胞)；(3)100 μg/ml β葡聚糖刺激陽(yáng)性細(xì)胞組；(4)100 μg/ml β葡聚糖刺激陰性細(xì)胞組；(5)500 μg/ml β葡聚糖刺激陽(yáng)性細(xì)胞組)；(6)500 μg/ml β葡聚糖刺激陰性細(xì)胞組。每組設(shè)3個(gè)Transwell小室，常規(guī)培養(yǎng)120 h。取各組下室胰腺腺泡細(xì)胞加入RIPA裂解液，免疫熒光化學(xué)染色法檢測(cè)腺泡細(xì)胞導(dǎo)管組織轉(zhuǎn)化標(biāo)志物CK19蛋白表達(dá)?？笴K19單克隆抗體(英國(guó)abcam公司)1∶1 000稀釋，綠色熒光標(biāo)記二抗1∶200稀釋，用PBS溶液清洗后加入100μl 0.5g/ml的DAPI核染液，4℃過(guò)夜，顯微鏡下觀察并拍照。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、siRNA-card9轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞的效率

倒置熒光顯微鏡下見(jiàn)綠色熒光素標(biāo)記的siRNA-card9轉(zhuǎn)染3、6、12、24、48 h后，巨噬細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度隨著轉(zhuǎn)染時(shí)間延長(zhǎng)而增加，24 h熒光強(qiáng)度明顯增加(圖1)，時(shí)間延長(zhǎng)至48 h，熒光強(qiáng)度增加趨勢(shì)明顯變緩，故選擇24 h為siRNA-card9轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞的最佳時(shí)間。

圖1 3(1A)、6(1B)、12(1C)、24(1D)、48 h組(1E)綠色熒光素標(biāo)記的siRNA-card9轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞的熒光強(qiáng)度

siRNA-card9-1、siRNA-card9-2和siRNA-card9-3均可成功轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞(圖2)。陰性對(duì)照組及siRNA-card9-1、siRNA-card9-2、siRNA-card9-3轉(zhuǎn)染組巨噬細(xì)胞的card9 mRNA表達(dá)量分別為1.16±0.16、0.16±0.07、0.57±0.12、0.23±0.04。與陰性對(duì)照比較，siRNA-card9-1的沉默效率為83.9%(t=7.77，P=0.002)，siRNA-card9-2為43.4%(t=7.75，P=0.024)，siRNA-card9-3為76.8%(t=6.98，P=0.002)，提示siRNA-card9-1轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞的抑制效率最高。

圖2 陰性對(duì)照組(2A)及siRNA-card9-1(2B)、siRNA-card9-2(2C)、siRNA-card9-3(2D)轉(zhuǎn)染組巨噬細(xì)胞的熒光強(qiáng)度

100、200、300 nmol/L濃度的siRNA-card9-1均可成功轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞(圖3)。陰性對(duì)照組和100、200、300 nmol/L siRNA1-card9-1轉(zhuǎn)染組巨噬細(xì)胞的card9 mRNA表達(dá)量分別為1.01±0.18、0.40±0.06、0.15±0.02、0.27±0.0.4。與陰性對(duì)照組比較，100、200、300 nmol/L siRNA-card9-1的沉默效率分別為60.3%、84.4%、72.7%(t值分別為5.57、8.13、6.89，P值分別為0.005、0.001、0.002)。表明200 nmol/L為最佳抑制濃度，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用200 nmol/L siRNA-card9-1轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞。

圖3 陰性對(duì)照組(3A)及100(3B)、200(3C)、300 nmol/L(3D)siRNA-card9-1轉(zhuǎn)染組巨噬細(xì)胞的熒光強(qiáng)度

二、β-葡聚糖刺激巨噬細(xì)胞上調(diào)card9蛋白的表達(dá)

陽(yáng)性細(xì)胞組、β葡聚糖刺激陽(yáng)性細(xì)胞組、陰性細(xì)胞組、β葡聚糖刺激陰性細(xì)胞組體外培養(yǎng)12 h，巨噬細(xì)胞card9蛋白表達(dá)量分別為0.86±0.05、1.03±0.05、0.59±0.03、0.52±0.16；體外培養(yǎng)24 h，巨噬細(xì)胞card9蛋白表達(dá)量分別為0.81±0.05、1.46±0.05、0.42±0.06、0.46±0.06。與陽(yáng)性細(xì)胞組比較，β-葡聚糖刺激陽(yáng)性細(xì)胞組巨噬細(xì)胞card9蛋白水平均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.88，P=0.018；t=15.90，P<0.001)；與陰性細(xì)胞組比較，β-葡聚糖刺激陰性細(xì)胞組巨噬細(xì)胞card9蛋白水平未見(jiàn)明顯升高(t=0.70，P=0.525；t=0.78，P=0.475)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4)，表明β-葡聚糖刺激可上調(diào)巨噬細(xì)胞card 9蛋白表達(dá)水平。

圖3 陰性對(duì)照組(3A)及100(3B)、200(3C)、300 nmol/L(3D)siRNA-card9-1轉(zhuǎn)染組巨噬細(xì)胞的熒光強(qiáng)度

注：card9為巨噬細(xì)胞胱天蛋白酶募集域蛋白9圖4 陽(yáng)性細(xì)胞組(1)、β葡聚糖刺激陽(yáng)性細(xì)胞組(2)、陰性細(xì)胞組(3)、β葡聚糖刺激陰性細(xì)胞組(4)培養(yǎng)12 h(4A)和24 h(4B)的巨噬細(xì)胞card9蛋白表達(dá)量

三、巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)腺泡細(xì)胞導(dǎo)管組織轉(zhuǎn)化

陽(yáng)性細(xì)胞組，陰性細(xì)胞組，100、500 μg/ml β葡聚糖刺激陽(yáng)性細(xì)胞組，100、500 μg/ml β葡聚糖刺激陰性細(xì)胞組體外培養(yǎng)120 h，陽(yáng)性細(xì)胞組CK19蛋白綠色熒光強(qiáng)度較弱；100、500 μg/ml β葡聚糖刺激陽(yáng)性細(xì)胞組和腺泡細(xì)胞內(nèi)CK19綠色熒光強(qiáng)度較陽(yáng)性細(xì)胞組明顯增強(qiáng)，且呈現(xiàn)β葡聚糖劑量依賴性；而陰性細(xì)胞組及100、500 μg/ml β葡聚糖刺激陰性細(xì)胞組，腺泡細(xì)胞內(nèi)CK19綠色熒光強(qiáng)度均較陽(yáng)性細(xì)胞組顯著降低(圖5)，表明巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)腺泡細(xì)胞導(dǎo)管組織轉(zhuǎn)化存在card9基因依賴性。

圖5 陽(yáng)性細(xì)胞組(5A)、陰性細(xì)胞組(5B)、100 μg/ml β葡聚糖刺激陽(yáng)性細(xì)胞組(5C)、100 μg/ml β葡聚糖刺激陰性細(xì)胞組(5D)、500 μg/ml β葡聚糖刺激陽(yáng)性細(xì)胞組(5E)、500 μg/ml β葡聚糖刺激陰性細(xì)胞組(5F)腺泡細(xì)胞CK19蛋白表達(dá)

討 論

大量文獻(xiàn)報(bào)道，真菌細(xì)胞壁的β葡聚糖與巨噬細(xì)胞膜表面C型植物凝集素受體-1特異性結(jié)合，誘導(dǎo)下游Sky活化，隨后card9招募bcl10、malt1，形成card9/bcl10/malt1復(fù)合體，進(jìn)而激活NF-κB、p38等炎癥信號(hào)，釋放大量炎癥因子[6]。鑒于前期[7-8]大量可重復(fù)的β-葡聚糖活化巨噬細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，本研究?jī)H檢測(cè)巨噬細(xì)胞card9表達(dá)水平，用于驗(yàn)證后續(xù)實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞模型。與先前報(bào)道[6-8]一致，本研究結(jié)果也顯示，β-葡聚糖刺激小鼠單核巨噬細(xì)胞系RAW264.7后可上調(diào)card9的表達(dá)。

眾所周知，巨噬細(xì)胞對(duì)胰腺癌的腺泡細(xì)胞導(dǎo)管組織轉(zhuǎn)化起著關(guān)鍵作用[2-4]。巨噬細(xì)胞內(nèi)的半胱氨酸蛋白酶，以及其分泌炎癥因子RANTES和TNF-α，作用于相關(guān)信號(hào)分子，促使腺泡導(dǎo)管組織轉(zhuǎn)化[2-3]；單克隆ICAM-1抗體[4]、氯化釓抑制劑[2]可阻遏巨噬細(xì)胞胰腺組織浸潤(rùn)，抑制腺泡導(dǎo)管組織轉(zhuǎn)化。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，急性胰腺炎患者外周血巨噬細(xì)胞card9表達(dá)水平明顯升高[9]；沉默巨噬細(xì)胞card9可減輕急性胰腺炎大鼠胰腺的炎癥損傷[10]；存在巨噬細(xì)胞card9依賴性的NF-κB、038分子機(jī)制[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，β葡聚糖活化巨噬細(xì)胞，上調(diào)card9蛋白水平，誘導(dǎo)腺泡細(xì)胞導(dǎo)管組織轉(zhuǎn)化，且呈現(xiàn)劑量依賴性；巨噬細(xì)胞card9基因敲除后，則抑制腺泡細(xì)胞導(dǎo)管組織轉(zhuǎn)化。

巨噬細(xì)胞card9可通過(guò)多種途徑參與腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖。card9通過(guò)釋放IL-18炎癥因子[12]或者抑制骨髓源性抑制細(xì)胞[13]，調(diào)節(jié)輔助T細(xì)胞功能； card9調(diào)控固有淋巴細(xì)胞的免疫應(yīng)答，激活腫瘤細(xì)胞STAT3信號(hào)途徑[14]； card9激活NF-κB信號(hào)分子，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2極化[15]。本研究結(jié)果表明，巨噬細(xì)胞與腺泡細(xì)胞共孵育后，巨噬細(xì)胞card9表達(dá)水平與腺泡細(xì)胞導(dǎo)管組織轉(zhuǎn)化標(biāo)志蛋白CK19正相關(guān)，提示巨噬細(xì)胞card9可誘導(dǎo)腺泡細(xì)胞導(dǎo)管組織轉(zhuǎn)化。更深入的分子機(jī)制研究尚需在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步闡明。

利益沖突所有作者聲明無(wú)利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明李清華：實(shí)驗(yàn)操作、論文撰寫、數(shù)據(jù)整理、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；楊志文：研究指導(dǎo)、論文修改、經(jīng)費(fèi)支持