馬光強(qiáng)，劉麗娟，陳國權(quán)，吳良濤，楊 均，劉軍澤，李瀟蒙，潘成文，周碧君

(1.黔南民族職業(yè)技術(shù)學(xué)院，都勻 558000；2.都勻市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，都勻 558000；3.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴陽 550025)

鴨疫里默氏桿菌(Riemerellaanatipestifer，RA)在世界各水禽養(yǎng)殖地區(qū)均有流行，該病原感染引起的雛鴨發(fā)病率和死亡率高，且近年來在中國呈上升趨勢(shì)，防控形勢(shì)愈發(fā)嚴(yán)峻，給中國養(yǎng)鴨業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1-5]。RA易對(duì)多種抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性，臨床治療中抗菌藥物的濫用致使其耐藥性增強(qiáng)，對(duì)人類食品衛(wèi)生安全造成威脅，因此，疫苗免疫被認(rèn)為是防控該病的主要措施。RA血清型復(fù)雜，各血清型之間缺乏有效的交叉免疫保護(hù)，且不同養(yǎng)殖地區(qū)流行的RA血清型相差較大，需根據(jù)各地流行血清型制備滅活疫苗進(jìn)行免疫防控[6-10]。

蜂膠(propolis)是蜜蜂從植物中采集的樹脂與自身分泌物混合而成的一種膠狀固體物，含維生素、脂肪酸、多糖等多種生物活性物質(zhì)，具有抗氧化、抗微生物功能，可激活機(jī)體自身免疫系統(tǒng)，增加免疫細(xì)胞數(shù)量，增強(qiáng)機(jī)體免疫功能[11-14]。郭宇飛[15]研究對(duì)比了蜂膠佐劑、油佐劑和鋁膠佐劑對(duì)RA四價(jià)滅活疫苗的免疫效果，表明蜂膠佐劑疫苗具有保護(hù)力和抗體產(chǎn)生速度快、保護(hù)持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)等優(yōu)勢(shì)。劉帥[16]研究對(duì)比了蜂膠佐劑和弗氏完全佐劑對(duì)殺鮭氣單胞菌滅活疫苗的免疫效果，表明蜂膠佐劑誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的免疫效果更佳且產(chǎn)生的毒副作用更低。以上研究結(jié)果表明,蜂膠佐劑是一種效果良好的免疫佐劑，可用于滅活疫苗制備。本試驗(yàn)用貴州省三穗縣分離的RA貴州流行株(RA-SS-8株)作為試驗(yàn)菌株，以蜂膠為佐劑，進(jìn)行滅活疫苗研制，以期為有效控制該地區(qū)鴨疫里默氏桿菌病奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為蜂膠滅活疫苗制備和動(dòng)物免疫試驗(yàn)提供資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物和菌株 1日齡未經(jīng)免疫的清潔級(jí)麻鴨購自貴州同興農(nóng)牧發(fā)展有限公司。試驗(yàn)RA貴州流行株(RA-SS-8株)，2019年7月分離于貴州省三穗縣某規(guī)?；B(yǎng)鴨場(chǎng)，已鑒定為RA血清2型，由貴州省動(dòng)物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑及儀器 無菌脫纖維綿羊血(南京便診生物科技有限公司)；胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(TSB,杭州微生物試劑有限公司)；新生牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)；酵母粉和胰蛋白胨(OXOID公司)；鴨傳染性漿膜炎二價(jià)滅活疫苗(1型Raf 63株+2型Raf 34株,天津瑞普生物技術(shù)股份有限公司)；蜂膠(黃酮含量為17%,上海源葉生物科技有限公司)；甲醛(含量為38%,西隴科學(xué)股份有限公司)。

紫外可見分光光度計(jì)(尤尼柯(上海)儀器有限公司)；恒溫水浴振蕩器(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)；漩渦混勻器(SCILOGEX公司)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；全溫培養(yǎng)搖床(上海新苗醫(yī)療器械制備有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 RA貴州流行株的復(fù)蘇及生長(zhǎng)曲線測(cè)定 取凍存的RA貴州流行株(RA-SS-8株)，無菌操作下用接種環(huán)蘸菌液接種于巧克力瓊脂培養(yǎng)基上，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)16～24 h，復(fù)蘇后觀察菌落特征做初步鑒定。挑取菌落形態(tài)典型的單個(gè)菌落接種于TSB培養(yǎng)基(含5%新生牛血清)進(jìn)行增菌培養(yǎng)，經(jīng)純化擴(kuò)繁后作為種子菌液置于4 ℃保存。

分光光度法測(cè)定細(xì)菌生長(zhǎng)曲線：將種子菌液按1∶100比例接種于LB培養(yǎng)基(含5%新生牛血清)，置于37 ℃、180 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)。初期每隔1 h在超凈工作臺(tái)中無菌取樣，在波長(zhǎng)600 nm處測(cè)定光密度值(D600 nm值)，當(dāng)D600 nm值呈明顯上升后改為每0.5 h測(cè)定1次，在D600 nm值趨于穩(wěn)定后改為每1 h測(cè)定1次，連續(xù)測(cè)定16 h，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)重復(fù)測(cè)量3次后取平均值，每次取樣應(yīng)留樣做好標(biāo)記用于細(xì)菌平板計(jì)數(shù)，根據(jù)D600 nm值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

平板計(jì)數(shù)法測(cè)定細(xì)菌生長(zhǎng)曲線：取不同時(shí)間段已測(cè)D600 nm值的備用菌液，混勻后用無菌PBS依次做10倍倍比稀釋(即100 μL待測(cè)菌液+900 μL無菌PBS)，選取10-5、10-6、10-7和10-84個(gè)稀釋度，各取菌液100 μL涂布于巧克力瓊脂培養(yǎng)基上。每個(gè)梯度重復(fù)3次，待菌液完全吸收后于37 ℃、5% CO2恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)16 h。記錄每個(gè)平板上的菌落數(shù)，菌落數(shù)在30～300的平板計(jì)數(shù)有效，取有效計(jì)數(shù)值的平均值，根據(jù)相應(yīng)的D600 nm值計(jì)算與活菌數(shù)的相關(guān)關(guān)系。

1.2.2 RA菌液制備 一級(jí)種子的增殖及鑒定：取鴨疫里默氏桿菌候選菌株，接種于含 5%新生牛血清的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng) 16～22 h，劃線接種于含 5%新生牛血清的TSB培養(yǎng)基上，在含 5% CO2條件下，37 ℃培養(yǎng) 24～48 h，選 5～10 個(gè)圓形、凸起、透明、呈露珠樣的典型菌落，分別劃線接種于含 5%新生牛血清的TSB營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面若干，37 ℃培養(yǎng) 24～48 h，作為一級(jí)種子，置 2～8 ℃保存，使用期不超過 7 d。二級(jí)種子的增殖及鑒定：取一級(jí)種子接種于含5%新生牛血清的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng) 18～22 h，取樣用含 5 %新生牛血清的TSB營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板做純粹檢驗(yàn)和活菌計(jì)數(shù)。置 2～8 ℃保存，使用期不超過 2 d。

1.2.3 RA貴州流行株蜂膠滅活疫苗的制備

1.2.3.1 滅活條件篩選 以濃度為38%的甲醛溶液作為滅活劑，采用化學(xué)滅活法對(duì)RA-SS-8株進(jìn)行滅活處理。試驗(yàn)分5個(gè)組，每個(gè)組4支試管，每支試管含5 mL菌液。各組分別用終濃度為0、0.1%、0.2%、0.3%和0.4%的甲醛溶液進(jìn)行處理，分別于處理后6、12、18和24 h時(shí)各取100 μL涂布于巧克力瓊脂培養(yǎng)基上，于37 ℃、5% CO2的恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，根據(jù)結(jié)果確定最終的甲醛使用濃度。

1.2.3.2 蜂膠佐劑制備 將蜂膠置于-20 ℃冰箱冷凍24 h以上，取1 g蜂膠使其充分粉碎，溶于4 mL、95%乙醇中，于25 ℃恒溫水浴振蕩器中浸提72 h，期間漩渦振蕩數(shù)次。以5 000 r/min離心10 min，取上清過濾，用無菌PBS調(diào)整使其干物質(zhì)含量為20 mg/mL，密封保存于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.3 蜂膠疫苗制備 將滅活檢驗(yàn)合格的菌液用無菌PBS重懸洗滌3次，并用無菌PBS調(diào)整菌液濃度為7.6×109CFU/mL。取制備的滅活菌液與蜂膠乙醇浸提液按1∶1(V/V)混合，攪拌至黃褐色混懸液獲得蜂膠滅活疫苗，無菌分裝于玻璃瓶?jī)?nèi)，經(jīng)無菌檢驗(yàn)合格后密封保存于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 RA貴州流行株蜂膠滅活疫苗的檢驗(yàn)

1.2.4.1 疫苗無菌檢驗(yàn) 取制備好的蜂膠滅活疫苗100 μL涂布于巧克力瓊脂培養(yǎng)基上，于37 ℃、5% CO2恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，設(shè)置3個(gè)重復(fù)，觀察培養(yǎng)基中有無菌落生長(zhǎng)，并做好記錄。

1.2.4.2 疫苗安全性檢驗(yàn) 取菌液濃度為3.8×109CFU/mL的滅活疫苗，以2倍免疫劑量采用頸部皮下接種方式免疫10只雛鴨，記錄2周內(nèi)免疫雛鴨的健康狀況及存活情況，在觀察期結(jié)束后隨機(jī)剖解免疫鴨進(jìn)行大體病變觀察。

1.2.5 免疫鴨攻毒保護(hù)性試驗(yàn) 將140只1日齡健康雛鴨飼養(yǎng)至7日齡以適應(yīng)環(huán)境，將其隨機(jī)分成4組，35只/組。分別設(shè)為蜂膠滅活疫苗組、二價(jià)滅活疫苗組、PBS對(duì)照組和空白對(duì)照組，試驗(yàn)動(dòng)物分組與免疫見表1。對(duì)飼養(yǎng)至7日齡的健康雛鴨進(jìn)行初免，2周后(即21日齡)對(duì)雛鴨進(jìn)行二次免疫。各組接種量均為0.3 mL/只。將RA貴州流行株(RA-SS-8株)采用腿部肌內(nèi)注射方法接種二免后14 d(35日齡)的試驗(yàn)鴨，進(jìn)行攻毒保護(hù)試驗(yàn)(2×108CFU/(0.5 mL·只))，10只/組，隔離飼養(yǎng)，連續(xù)觀察7 d，記錄各組試驗(yàn)鴨攻毒后的發(fā)病和死亡情況。取各組攻毒7 d后的試驗(yàn)鴨心臟和肝臟組織，按常規(guī)方法制作組織切片進(jìn)行組織病理學(xué)分析，對(duì)比各組免疫保護(hù)效果與其病理變化關(guān)系。

表1 試驗(yàn)動(dòng)物分組與免疫

2 結(jié) 果

2.1 RA貴州流行株生長(zhǎng)曲線

2.1.1 RA貴州流行株生長(zhǎng)曲線 通過分光光度法測(cè)定RA-SS-8株菌液隨培養(yǎng)時(shí)間變化的D600 nm值，由圖1可知，0～3 h時(shí)，細(xì)菌增殖緩慢，表明細(xì)菌生長(zhǎng)處于遲緩期；3～10 h時(shí)，細(xì)菌增殖趨勢(shì)明顯增大，提示此時(shí)段細(xì)菌處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；10 h以后，細(xì)菌增殖逐漸趨于平緩，表明細(xì)菌在向平穩(wěn)期發(fā)展，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)菌最終進(jìn)入衰亡期。通過分析細(xì)菌D600 nm值與培養(yǎng)時(shí)間的相關(guān)性可知，D600 nm值與時(shí)間的回歸方程在3～6 h時(shí)為y=0.085 6x-0.024 7(R2=0.994)；3.5～6 h時(shí)為y=0.089 6x+0.043 4(R2=0.997)；3.5～5.5 h時(shí)為y=0.093 5x+0.034 3(R2=0.9995)。其中以3.5～5.5 h時(shí)D600 nm值與時(shí)間的回歸方程的斜率最大，D600 nm值增長(zhǎng)趨勢(shì)最明顯，相關(guān)系數(shù)R2最大，準(zhǔn)確度最高(圖2)。

圖1 分光光度法測(cè)定RA生長(zhǎng)曲線Fig.1 RA growth curve determined by spectrophotometry

圖2 RA在3.5～5.5 h內(nèi)D600 nm值與培養(yǎng)時(shí)間的線性關(guān)系Fig.2 The linear relationship between the D600 nm value of RA and the culture time in 3.5-5.5 h

2.1.2 RA貴州流行株D600 nm值與活菌數(shù)的相關(guān)性分析 通過平板計(jì)數(shù)法測(cè)定上述D600 nm值所對(duì)應(yīng)的RA活菌數(shù)，建立RA在無菌PBS溶液中的D600 nm值與其活菌數(shù)的相關(guān)性曲線。結(jié)果顯示，RA菌液D600 nm值在0.1～0.8之間，D600 nm值與活菌數(shù)呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，其回歸方程為y=490.26x-12.319(R2=0.997)(圖3)。在此區(qū)間，RA處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，且D600 nm值與活菌數(shù)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，是用作滅活疫苗制備的最佳時(shí)期。

圖3 D600 nm值與RA活菌數(shù)相關(guān)性曲線Fig.3 Correlation curve between D600 nm value and number of RA viable bacteria

2.2 RA菌液制備

在實(shí)驗(yàn)室條件下分別制備 3 批疫苗用菌液，純粹檢驗(yàn)均合格，活菌計(jì)數(shù)結(jié)果顯示 3 批鴨疫里默氏桿菌貴州流行株(RA-SS-8株)菌液濃度分別為1.25×1010、1.27×1010和1.29×1010CFU/mL。

2.3 RA貴州流行株蜂膠滅活疫苗的制備

2.3.1 RA貴州流行株滅活條件篩選 由表2可知，未加甲醛處理組在各檢測(cè)時(shí)間段都有大量細(xì)菌生長(zhǎng)；使用甲醛的各處理組在6 h后均未在巧克力瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)出細(xì)菌，表明RA滅活完全。為確保RA滅活完全，最終使用滅活條件為：甲醛終濃度0.2%，37 ℃、160 r/min滅活12 h。

表2 疫苗滅活條件篩選結(jié)果

2.4 RA貴州流行株蜂膠滅活疫苗的檢驗(yàn)

將制備的滅活疫苗接種至巧克力瓊脂培養(yǎng)基上，于37 ℃、5% CO2的恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，觀察到所接種培養(yǎng)基上均無菌落生長(zhǎng)，表明疫苗無菌檢驗(yàn)合格。疫苗安全性檢驗(yàn)中使用制備好的RA滅活疫苗通過2倍免疫劑量接種雛鴨，在隨后的2周觀察期中，接種鴨均未表現(xiàn)出不良反應(yīng)，其攝食和運(yùn)動(dòng)功能無異常，且精神狀態(tài)良好；大體病變觀察未見明顯病變，表明所制備的疫苗安全性檢驗(yàn)合格。

2.5 免疫鴨攻毒保護(hù)性試驗(yàn)

2.5.1 攻毒保護(hù)率分析 免疫鴨攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果顯示，PBS對(duì)照組鴨從攻毒后第1天最先出現(xiàn)死亡，在攻毒后第3天全部死亡；蜂膠滅活疫苗組鴨從攻毒后第2天開始出現(xiàn)死亡，攻毒后第2～3天為死亡高峰期，耐受至攻毒后第4天后各試驗(yàn)鴨均未再出現(xiàn)死亡；二價(jià)滅活疫苗組鴨未出現(xiàn)死亡。蜂膠滅活疫苗組和二價(jià)滅活疫苗組對(duì)RA-SS-8株的攻擊都具有良好的免疫保護(hù)作用，其中蜂膠滅活疫苗組保護(hù)率為70%，二價(jià)滅活疫苗組保護(hù)效果最佳，保護(hù)率可達(dá)100%(表3)。

表3 免疫鴨攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果

2.5.2 組織病理學(xué)分析結(jié)果 對(duì)攻毒后第7天各組試驗(yàn)鴨病變較為嚴(yán)重的心臟和肝臟進(jìn)行組織切片制作。心臟組織病理學(xué)觀察顯示，在免疫組中，纖維素性滲出物明顯減少，其中蜂膠滅活疫苗組與二價(jià)滅活疫苗組相比，前者除有極少量纖維素性滲出外，其余形態(tài)結(jié)構(gòu)與后者相似，未見明顯病理變化(圖4A、4B)；PBS對(duì)照組試驗(yàn)鴨心外膜增厚，表面附有大量的纖維素性滲出物，有大量異嗜性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞彌漫性浸潤(rùn)(圖4C)；空白對(duì)照組未見明顯病理變化(圖4D)。肝臟組織病理學(xué)觀察表明，在免疫組中，纖維素性滲出物明顯減少，其中蜂膠滅活疫苗組與二價(jià)滅活疫苗組相比，前者除有極少量纖維素性滲出外，其余形態(tài)結(jié)構(gòu)與后者相似，未見明顯病理變化(圖4E、4F)；PBS對(duì)照組試驗(yàn)鴨肝臟被膜增厚，表面附有大量粉紅色網(wǎng)狀纖維素滲出，其間混有大量的淋巴細(xì)胞和異嗜性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，肝索結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞腫脹變性(圖4G)；空白對(duì)照組未見明顯病理變化(圖4H)。結(jié)果表明，蜂膠滅活疫苗和二價(jià)滅活疫苗對(duì)試驗(yàn)鴨心臟和肝臟組織均具有良好的保護(hù)效果。

A～D，分別為蜂膠滅活疫苗組、二價(jià)滅活疫苗組、PBS對(duì)照組和空白對(duì)照組心臟；E～H，分別為蜂膠滅活疫苗組、二價(jià)滅活疫苗組、PBS對(duì)照組和空白對(duì)照組肝臟A-D，Heart of propolis inactivated vaccine,bivalent inactivated vaccine,PBS control and blank control groups,respectively；E-H，Liver of propolis inactivated vaccine，bivalent inactivated vaccine,PBS control and blank control groups,respectively圖4 試驗(yàn)鴨心臟、肝臟組織病理變化(HE，200×)Fig.4 Histopathological changes in heart and liver of the test ducks (HE，200×)

3 討 論

目前，世界上已報(bào)道的RA血清型有20多種，而國內(nèi)證實(shí)已存在的RA血清型共有18種，其中血清1型、2型、3型、4型在全國范圍內(nèi)均有分布，其他血清型主要分布在西南和東北地區(qū)。近年來，貴州省除三穗縣外其他地區(qū)對(duì)RA血清型鮮有報(bào)道，傅心亮等[17]對(duì)貴州地區(qū)RA分離株進(jìn)行血清型鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以血清2型RA為主要流行菌株。吳征卓等[7]對(duì)貴州省三穗縣RA進(jìn)行分離鑒定，結(jié)果證實(shí)6株RA分離株中4株為血清2型，2株為血清11型。雷云等[18-19]對(duì)分離自貴州省三穗地區(qū)某鴨場(chǎng)25日齡左右病死鴨的18株RA進(jìn)行血清型鑒定，結(jié)果證實(shí)其中有11株鑒定為血清2型，4株鑒定為血清1型，1株血清6型和2株未定型。以上文獻(xiàn)資料證實(shí)血清2型RA為貴州地區(qū)主要流行菌株，鑒于此，本試驗(yàn)選取血清2型RA分離株為試驗(yàn)菌株，以蜂膠為佐劑成功研制滅活疫苗，為有效防控該病奠定基礎(chǔ)，同時(shí)對(duì)促進(jìn)貴州省三穗麻鴨的健康養(yǎng)殖具有重要意義。

常用于研制RA滅活疫苗的免疫佐劑主要有油乳佐劑、鋁鹽佐劑和蜂膠佐劑。油乳佐劑能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生有效的體液免疫和細(xì)胞免疫，但對(duì)機(jī)體的毒副作用較強(qiáng)；鋁鹽佐劑作為人類疫苗唯一使用的免疫佐劑，其毒副作用小，但佐劑活性較油乳佐劑低。蜂膠佐劑能增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能且具有藥用價(jià)值。2008年，李淑娜[20]研制的RA、大腸桿菌二聯(lián)多價(jià)蜂膠疫苗安全性好、無副作用，二免后7 d進(jìn)行RA攻毒保護(hù)試驗(yàn)，其保護(hù)率可達(dá)90%。本試驗(yàn)選用蜂膠作為RA貴州流行血清2型菌株佐劑研制蜂膠滅活疫苗，同時(shí)，將制備的RA蜂膠滅活疫苗以2倍免疫劑量采用頸部皮下接種方式免疫雛鴨并觀察2周，結(jié)果顯示，接種鴨均未表現(xiàn)出不良反應(yīng)，同時(shí)，本試驗(yàn)將制備的蜂膠滅活疫苗和商品化的二價(jià)油乳劑滅活疫苗分別免疫雛鴨，商品化疫苗組在注射部位發(fā)生局部炎癥反應(yīng)，而蜂膠組無明顯異?，F(xiàn)象，表明蜂膠滅活疫苗安全性更好，這與劉帥[16]研究結(jié)果相符。

本試驗(yàn)還通過攻毒保護(hù)試驗(yàn)評(píng)價(jià)蜂膠滅活疫苗組對(duì)RA人工感染的保護(hù)力，結(jié)果顯示，其免疫保護(hù)率為70%，較商品化疫苗組(100%)偏低，這與郭宇飛[15]和劉帥[16]的研究結(jié)果不符，原因可能是蜂膠滅活疫苗中抗原含量較商品化疫苗低從而誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答較差；其次是蜂膠滅活疫苗制備過程中乳化不完全，導(dǎo)致蜂膠顆粒與抗原粒子未能較好的相互交聯(lián)形成類免疫刺激復(fù)合物結(jié)構(gòu)，從而影響免疫效果。但組織病理變化分析結(jié)果顯示，蜂膠滅活疫苗組和商品化疫苗組免疫鴨心臟、肝臟組織均未出現(xiàn)明顯病變，表明蜂膠滅活疫苗能為免疫鴨提供較為有效的保護(hù)力。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)選取RA血清2型貴州流行株(RA-SS-8株)為基礎(chǔ)菌株，以蜂膠為佐劑制備滅活疫苗，成功制備了RA貴州流行株蜂膠滅活疫苗，可為蜂膠滅活疫苗制備和動(dòng)物免疫試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。