徐婭玲，張霽輝，牛 熙，李 升，黃世會，冉雪琴，王嘉福

(1.貴州大學生命科學學院，貴陽 550025；2.貴州大學農業(yè)生物工程研究院，貴陽 550025；3.貴州大學動物科學學院，貴陽 550025)

非洲豬瘟(African swine fever，ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)引起家豬、疣豬、歐洲野豬和美洲野豬等不同品種豬發(fā)病的急性、烈性傳染病[1],主要癥狀為肺水腫、嚴重抑郁、高熱、發(fā)紺、無食欲、多器官廣泛出血等[2]，對環(huán)境有極強的抵抗能力，在-20 ℃ 112 d后仍具有感染能力[3]，中國動物病原微生物名錄中將其列為一類動物疫病，該病首次發(fā)現于肯尼亞[4]，后傳播到西班牙、意大利、法國、格魯吉亞、俄羅斯等國家[5-6]，2018年初在中國遼寧省沈陽市首次暴發(fā)，由于其高致死性，對中國生豬養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經濟損失[7]，但目前仍無有效疫苗預防，一旦發(fā)現，只能采取捕殺方式，因此對于ASF疫苗的研究尤為重要。

目前，ASF的疫苗研發(fā)中病毒載體疫苗與減毒活疫苗免疫原性較強[8-9]。但病毒載體疫苗安全性尚不能完全確定，易突變?yōu)閺姸局闧10]，減毒活疫苗可能會導致豬產生高熱、食欲不振、輕微神經衰弱癥狀，部分豬甚至因感染而急性死亡[11]。因此，安全性更高的疫苗對于ASF至關重要。以抗原表位為基礎設計的合成肽疫苗能誘導機體產生對特定表位的免疫反應，并避免其他可能導致過敏性反應的無關表位的潛在影響，具有極高的安全性[12]。P72蛋白作為ASFV主要的衣殼蛋白，有較多的抗原表位[13]，2014年 Phillips[14]通過基因定位發(fā)現該蛋白存在多個抗原反應區(qū)域。郭晶等[15]也通過P72多表位融合蛋白誘導機體產生了特異性抗體及其良好的免疫原性。有效的B細胞和T細胞表位可通過免疫信息學分析確定，但表位的免疫原性必須通過試驗驗證。因此，本研究通過生物信息學的方法評估和選擇P72蛋白中能誘導B細胞和T細胞應答的抗原表位，制備合成肽疫苗，免疫小鼠，評估合成肽的免疫效力，以期為ASF合成肽疫苗研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 氨基酸序列、試驗動物

ASFV CAS19-01/2019株(GenBank登錄號：MN172368.1)P72蛋白氨基酸序列(GenBank登錄號：QGJ83444.1)；3～5周齡SPF級雌性健康BALB/c小鼠(許可編號：EAE-GZU-2021-P014)購自重慶騰鑫生物技術有限公司。

1.2 主要試劑

弗氏完全與不完全佐劑(Sigma公司)；牛血清白蛋白(BSA)、ELISA包被液、ELISA終止液、TMB顯色液、紅細胞裂解液、小鼠脾臟細胞分離試劑盒(Solarbio公司)；RPMI-1640細胞培養(yǎng)基、100目與200目細胞篩、PBS、小鼠白細胞介素2(IL-2)ELISA試劑盒、IL-4 ELISA試劑盒、小鼠免疫球蛋白G(IgG)ELISA試劑盒、小鼠γ干擾素(IFN-γ)ELISA試劑盒(湖南艾方生物科技有限公司)；抗體CD3+、CD8+、CD4+(杭州聯科生物技術股份有限公司)；辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗小鼠IgG (Goat Anti-Mouse IgG-HRP)(上海艾比瑪特醫(yī)藥科技有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 抗原表位分析 利用ExPASy在線分析工具ProtParam (https:∥web.expasy.org/protparam/)預測P72蛋白分子質量、等電點、不穩(wěn)定系數和半衰期；利用Netphos在線軟件(https:∥services.healthtech.dtu.dk/service.php NetPhos-3.1)預測其磷酸化位點；SOPMA (https:∥npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)預測其蛋白二級結構；利用IEDB在線軟件(http:∥tools.immuneepitope.org/main/)預測其T細胞抗原表位、表面可及性、可塑性、抗原及親水性；利用ABCpred (https:∥webs.iiitd.edu.in/raghava/abcpred/)、SVMtrip (http:∥sysbio.unl.edu/SVMTriP/)在線軟件預測其B細胞抗原表位。

1.3.2 合成肽疫苗的構建 根據預測的結果，將篩選的T細胞抗原表位與B細胞抗原表位以隨機組合的方式進行整合，整合的肽段由南京金斯瑞生物科技有限公司偶聯KLH蛋白合成多肽P72-1與P72-2。

1.3.3 小鼠免疫 3～5周齡SPF級BALB/c雌性小鼠30只，隨機分為3組：P72-1、P72-2和PBS組每組10只。P72-1和P72-2組分別腹腔注射免疫合成肽疫苗P72-1和P72-2，PBS組腹腔注射免疫PBS作為陰性對照，共免疫3次，每隔14 d免疫一次，劑量50 μg/只，首免佐劑為弗氏完全佐劑，二、三免佐劑為弗氏不完全佐劑。

1.4 免疫效果評估

1.4.1 特異性抗體檢測 采用ELISA方法檢測免疫后P72-1與P72-2特異性抗體，分別用10 μg/mL的P72-1與P72-2蛋白包被ELISA板，經封閉液封閉后，加入以1∶10稀釋于PBS中的免疫動物血清，37 ℃孵育1 h，PBST洗3次，加入100 μL HRP標記的山羊抗小鼠IgG(1∶10 000)37 ℃孵育1 h，PBST洗3次，加入TMB顯色液常溫避光反應15 min，加入100 μL ELISA終止液，酶標儀測定D450 nm值，根據P/N(陽性D450 nm值/陰性D450 nm值)計算是否產生特異性抗體及其抗體效價,免疫組(P)/PBS組(N)>2.1即視為檢測到特異性抗體。

1.4.2 脾臟淋巴細胞增殖試驗 每組隨機取3只小鼠，斷頸處死后浸泡于75%乙醇中10 min，于超凈工作臺分離淋巴細胞，100 μL/孔加到96孔細胞板中，用終濃度為10 μg/mL的P72-1、P72-2刺激淋巴細胞，無抗原組為對照，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)68 h后每孔添加10 μL CCK-8，37 ℃放置1 h，測定D490 nm值，根據測量的吸光度，按照下式計算刺激指數(SI)：SI=(特異性抗原刺激孔平均D490 nm值-本底D490 nm值)/(無抗原刺激孔平均D490 nm值-本底D490 nm值)。

1.4.3 流式細胞術檢測T淋巴細胞亞群 抽取首免56 d后小鼠外周血于抗凝管內，加入20 μL熒光標記流式抗體CD3+、CD4+、CD8+，混勻，室溫避光放置20 min后加入450 μL溶血素，混勻，室溫避光放置20 min，流式細胞術檢測外周血淋巴細胞亞群精準計數。

1.4.4 細胞因子檢測 采集P72-1、P72-2及PBS組小鼠首免后14、28和42 d的血清100 μL，根據試劑盒說明書檢測細胞因子IL-2、IL-4和IFN-γ含量。

1.4.5 統計分析 試驗數據均用 GraphPad Prism 8.0軟件進行分析，所有試驗設置 3 個重復樣品，用t檢驗進行差異顯著性分析。試驗結果以平均值±標準差表示。P<0.05表示差異顯著；P<0.01表示差異極顯著。

2 結 果

2.1 抗原表位分析結果

P72蛋白的分子式為C3303H5036N904O948S18，分子質量為73 154.89 u，由646個氨基酸組成，平均親水系數為-0.392，不穩(wěn)定系數為38.30，是穩(wěn)定性親水蛋白，在哺乳動物中的半衰期為30 h；其蛋白結構中含有88個磷酸化位點：31個絲氨酸(Ser)位點、7個蘇氨酸(Thr)位點、50個酪氨酸(Tyr)位點；二級結構中α-螺旋、β-轉角、延伸鏈和無規(guī)則卷曲分別占19.35%、5.42%、25.08%和50.15%。通過IEDB、ABCpred、SVMtrip在線軟件預測B細胞與T細胞抗原表位，結果見表1、2，綜合各項分析結果，最終確定P72-1由4條多肽組成，多肽序列位置587-606、520-528、203-211、39-58位氨基酸處；P72-2由4條多肽組成，多肽序列位置為626-634、298-306、232-251、110-129位氨基酸處。

表1 P72蛋白B細胞表位分析

表2 P72蛋白T細胞表位分析

2.2 特異性抗體水平檢測

采用ELISA方法分析每次免疫后小鼠血清中特異性抗體效價，合成肽疫苗免疫組小鼠接種后分別能檢測到針對P72-1與P72-2的特異性抗體反應，且抗體水平明顯高于PBS組，最高抗體水平出現在一免后28 d，P72-1最高效價為1∶25 600，P72-2最高效價為1∶12 800，PBS組小鼠血清中未檢測到特異性抗體(圖1)。

圖1 免疫小鼠特異性抗體檢測Fig.1 Detection of specific antibodies in immunized mice

2.3 脾臟淋巴細胞增殖試驗

由圖2可知，合成肽疫苗免疫組的刺激指數均極顯著高于PBS組(P<0.01)；P72-1組高于P72-2組，但無顯著性差異(P>0.05)，表明P72-1、P72-2合成肽疫苗能誘導機體的特異性脾臟淋巴細胞增殖。

*，差異顯著(P<0.05)；**，差異極顯著(P<0.01)；無*，差異不顯著(P>0.05)。下同*,Significant difference (P<0.05);**,Extremely significant difference (P<0.01);No *,No significant difference (P>0.05).The same as blow圖2 合成肽引起的脾臟淋巴細胞增殖Fig.2 Spleen lymphocyte proliferation induced by synthetic peptides

2.4 T細胞亞群檢測

小鼠分別免疫P72-1、P72-2、PBS制備的合成肽疫苗56 d后，取外周血對T淋巴細胞亞群表達水平情況進行比較，結果見圖3。由圖3可知，P72-2組的CD4+T淋巴細胞的比例最高，達到77.0%，其次是P72-1組占比75.9%，PBS組為70.6%。CD8+T淋巴細胞的比例最高的是PBS組,為27.8%，P72-1與P72-2占比分別為22.6%和21.6%。將合成肽疫苗組與PBS組的CD4+/CD8+比值進行分析，結果見圖4。由圖4可知，合成肽疫苗組的CD4+/CD8+比值顯著高于PBS組(P<0.05)，且P72-2顯著高于P72-1(P<0.05),表明P72-1、P72-2能顯著誘導體液免疫與細胞免疫，P72-2誘導能力更強。

圖3 T細胞亞群檢測結果Fig.3 Detection results of T cell subsets

圖4 T細胞亞群CD4+/CD8+比值Fig.4 CD4+/CD8+ ratio of T cell subsets

2.5 細胞因子檢測

取免疫后42 d小鼠血清，通過ELISA方法檢測小鼠外周血中細胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4的含量。由圖5可知，與PBS組相比，P72-1和P72-2組的IFN-γ、IL-2、IL-4含量均升高，其中P72-1和P72-2組的IL-4、IL-2含量在免疫后42 d時極顯著升高(P<0.01)，在免疫后28 d時，除P72-1組IL-2含量顯著升高外(P<0.05)，其合成肽疫苗組檢測值均極顯著升高(P<0.01)；在免疫后14 d時，P72-2組IFN-γ與IL-4含量均顯著升高(P<0.05)，P72-1組IL-4含量極顯著升高(P<0.01)；P72-1與P72-2組細胞因子IL-4、IL-2、IFN-γ各個檢測值之間均存在差異，但只在IL-2上存在顯著性差異，表現為P72-2組顯著或極顯著高于P72-1組(P<0.05；P<0.01)。

A,IL-2;B,IFN-γ;C,IL-4圖5 合成肽引起的細胞因子變化Fig.5 Cytokine changes induced by synthetic peptides

3 討 論

非洲豬瘟是一種高度傳染的出血性疾病，病死率接近100%[16]，近年來在非洲、歐洲、亞洲等地頻繁暴發(fā)，嚴重影響了區(qū)域間的生豬及豬肉副產品的貿易流通，對全球養(yǎng)豬業(yè)造成災難性的打擊[17]，但其病原體ASFV結構復雜且缺乏負責誘導保護性免疫抗原的知識，尚未研發(fā)出有效的非洲豬瘟疫苗。

P72是ASFV的主要結構蛋白，基因序列高度保守，在病毒感染后期表達，對病毒衣殼的形成具有重要意義[18]，已有許多研究利用P72蛋白作為候選抗原研制疫苗。謝靈志[19]利用P72蛋白制備重組腺病毒載體疫苗注射小鼠后，引起了小鼠淋巴細胞的增殖及細胞因子分泌，顯著增強了機體的細胞免疫應答水平；Chen等[20]通過反向遺傳學方法表達P72蛋白構建的新城疫病毒rNDV/P72，不僅在小鼠模型中產生了高水平的特異性IgG抗體，還促進了T淋巴細胞的增殖，提升了機體的免疫應答水平；但目前對于P72蛋白優(yōu)勢抗原表位的免疫效力研究還鮮有報道，因此，本研究利用P72蛋白的優(yōu)勢抗原表位制備了合成肽疫苗P72-1與P72-2，并對其免疫效力進行評估。

利用生物信息學方法預測、篩選蛋白抗原表位已成為表位疫苗研究的首選方法，不僅能提升疫苗的安全性，同時能保留較強的抗原性[21]。本試驗利用生物信息學方法對P72蛋白抗原表位進行分析預測，經篩選得到8個優(yōu)勢抗原表位，與傳統表位篩選過程比，此方法有工作量小、準確性高等優(yōu)點，并已成功應用在豬O型口蹄疫病毒合成肽疫苗的研究中[22]。本研究制備的合成肽疫苗P72-1與P72-2包含的優(yōu)勢B細胞與T細胞抗原表位在機體內引起了良好的免疫反應，間接ELISA結果表明，免疫小鼠在首免14 d后就產生了高效價特異性抗體，這與EV-D68病毒的合成肽疫苗引起的特異性抗體效果一致[23]，證明篩選的抗原表位具有良好的免疫原性。本研究通過對免疫組小鼠外周血及血清檢測發(fā)現免疫組小鼠的T細胞亞群指數與細胞因子增殖情況顯著高于對照組，表明疫苗顯著提高了機體的免疫應答水平。此外，淋巴細胞的增殖試驗作為反映機體淋巴細胞增殖的一種方法，能有效評價機體的免疫功能[24]，本試驗結果顯示免疫后脾臟淋巴細胞顯著增殖情況，表明疫苗顯著提高了機體的細胞免疫應答水平。唐華[22]構建的A型口蹄疫病毒合成肽疫苗在小鼠體內導致T細胞亞群顯著變化；孟媛等[25]制備的塞尼卡病毒VP1蛋白的亞單位疫苗在小鼠模型中引發(fā)了顯著的細胞因子變化；魏冰[26]在研究Th表位合成肽對O型口蹄疫病毒合成肽疫苗的增效作用中發(fā)現小鼠T淋巴細胞的轉化率顯著上升。這些研究都表明了具有良好免疫效力的疫苗能顯著激活機體的免疫應答，本研究基于優(yōu)勢抗原表位設計的合成肽疫苗P72-1與P72-2具有良好的免疫效力。

盡管本試驗制備的合成肽疫苗免疫小鼠后在小鼠體內有較好的免疫反應，但ASFV的感染機制尚未完全明確，且未進行豬的免疫效力評價及攻毒保護試驗，后續(xù)研究中還需繼續(xù)篩選更多抗原的優(yōu)勢表位來優(yōu)化疫苗的設計，以期能獲得更好的免疫保護效果。

4 結 論

本研究初步探索了ASFV P72蛋白合成肽疫苗的免疫效力，通過分析P72蛋白的結構和預測其抗原表位，成功構建了多肽疫苗P72-1與P72-2，通過免疫小鼠，表明該疫苗具有良好的免疫原性，為ASFV多肽疫苗的研制奠定技術基礎。