彭 凱，陳 冰，趙紅霞，王麗娟，朱喜鋒，黃 文

(廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所，廣東省畜禽育種與營(yíng)養(yǎng)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華南動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510640)

海鱸(Lateolabtaxmaculatus)，又稱花鱸、七星鱸，是中國(guó)海水養(yǎng)殖鱸魚的主要優(yōu)質(zhì)品種之一，主要分布于中國(guó)東南沿海地區(qū)，如廣東、福建、山東。海鱸肉質(zhì)細(xì)嫩、味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富，一直備受市場(chǎng)和消費(fèi)者青睞。根據(jù)中國(guó)漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒數(shù)據(jù)顯示，2020年中國(guó)海鱸產(chǎn)量近20萬(wàn)t，年總產(chǎn)值超過(guò)30億元，市場(chǎng)前景廣闊[1]。然而，隨著集約化高密度養(yǎng)殖模式的迅猛發(fā)展，海鱸養(yǎng)殖暴露出來(lái)的氧化應(yīng)激、病害、免疫力低等問題逐漸加劇，已成為制約產(chǎn)業(yè)發(fā)展亟待解決的問題。另一方面，自2021年進(jìn)入“無(wú)抗時(shí)代”后，水產(chǎn)生產(chǎn)面臨的挑戰(zhàn)有增無(wú)減，抗生素優(yōu)勢(shì)的空缺亟待填補(bǔ)，迫切需要尋求新的抗生素替代品，維持水產(chǎn)養(yǎng)殖朝向綠色、安全、可持續(xù)的方向發(fā)展。

植物提取物來(lái)源于大自然，相比抗生素及化學(xué)藥物，具有高效、綠色、安全的優(yōu)勢(shì)，是抗生素替代品的理想選擇。在眾多植物提取物中，縮合單寧是一類由黃烷-3-醇單體組成的聚合物，屬于多酚類化合物，具有較強(qiáng)的抗菌、消炎、抗氧化等生物活性[2-3]。長(zhǎng)期以來(lái)，縮合單寧被視為飼料抗?fàn)I養(yǎng)因子，主要?dú)w因于縮合單寧對(duì)動(dòng)物采食量、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化率及生長(zhǎng)的不利影響。然而，有關(guān)縮合單寧對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物生長(zhǎng)和健康的研究報(bào)道很少，相關(guān)作用機(jī)理仍不完全清楚。黎梅[4]研究表明，飼料中縮合單寧(純度78%)的添加量超過(guò)30 g/kg可降低草魚的采食量和生長(zhǎng)性能，破壞腸道組織結(jié)構(gòu)，削弱腸道健康。近年來(lái)研究表明，低劑量縮合單寧不僅不影響動(dòng)物的生長(zhǎng)，還能通過(guò)調(diào)節(jié)動(dòng)物腸道菌群的途徑增強(qiáng)機(jī)體健康[5-6]。Peng等[7-8]報(bào)道，當(dāng)飼料中縮合單寧的添加量<1 g/kg時(shí)，不僅不影響海鱸的生長(zhǎng)性能和消化功能，還能提高海鱸血清和肝臟的抗氧化能力，增強(qiáng)魚體抵抗環(huán)境應(yīng)激的能力。飼料中添加0.5 g/kg縮合單寧對(duì)凡納濱對(duì)蝦具有促生長(zhǎng)作用[9]。這說(shuō)明縮合單寧對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物生長(zhǎng)和健康的影響與其濃度直接相關(guān)。然而高劑量(>1 g/kg)縮合單寧對(duì)海鱸影響如何仍不清楚。本試驗(yàn)通過(guò)研究縮合單寧對(duì)海鱸生長(zhǎng)性能、體成分、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率及腸道組織結(jié)構(gòu)的影響，旨為飼用縮合單寧的資源開發(fā)及其在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)飼料

3種試驗(yàn)飼料(T1、T2和T3)組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。T1為基礎(chǔ)飼料，T2和T3分別在T1的基礎(chǔ)上添加1和2 g/kg縮合單寧，3組飼料配制時(shí)保持等氮等脂?？s合單寧來(lái)源于葡萄籽(購(gòu)自廣州飛禧特生物科技有限公司)，其提取和純化步驟參照彭凱[10]方法，縮合單寧先溶于水后添加到飼料中。飼料原料全部通過(guò)60目標(biāo)準(zhǔn)篩，混合均勻后經(jīng)雙螺桿擠壓機(jī)(SLX-80，華南理工大學(xué)科技實(shí)業(yè)有限公司)制成顆粒飼料(直徑為2.0 mm)，經(jīng)55 ℃烘干，冷卻至室溫，于-20 ℃保存?zhèn)溆?。T1、T2和T3中縮合單寧的實(shí)際含量分別為0、0.95和1.93 g/kg(參照Terrill等[11]方法檢測(cè))。

表1 試驗(yàn)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理

選擇初始體重為(2.76±0.05)g的健康海鱸幼苗480尾，隨機(jī)分為3組，每組4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)40尾。將魚苗隨機(jī)分配到12個(gè)圓柱形玻璃纖維缸(容積為350 L)中，分別投喂3組試驗(yàn)飼料，養(yǎng)殖周期為63 d。采取飽食投喂方法，每天飼喂2次(08:00和20:00)，記錄飼料投喂量、魚苗死亡數(shù)量及養(yǎng)殖水質(zhì)情況。試驗(yàn)期間采取自然光照，水溫為26～28 ℃，溶解氧濃度>5.0 mg/L，氨氮及亞硝酸鹽濃度<0.02 mg/L，pH為7.8～8.2。

1.3 樣品采集與分析

1.3.1 表觀消化率 于試驗(yàn)周期的第49～63天連續(xù)收集糞便，每天晨飼后1 h清除殘料，4 h后依據(jù)虹吸法收集新鮮、飽滿、包膜完整的糞便(收集糞便期間暫停曝氣)，直至每個(gè)重復(fù)收集到足夠的糞便(干物質(zhì)重>10 g)，樣品于-20 ℃保存，依據(jù)酸不溶灰分法測(cè)定營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率[12]，包括干物質(zhì)消化率、粗蛋白質(zhì)消化率、粗脂肪消化率、灰分消化率。

表觀消化率的計(jì)算公式如下：

營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率(%)=[1-(a×b)/(c×d)]×100%，其中a和b分別為飼料和糞便中酸不溶灰分的含量(%)，b和d分別為糞便和飼料中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的含量(%)。

1.3.2 生長(zhǎng)性能 試驗(yàn)結(jié)束后，海鱸禁食24 h后采樣。統(tǒng)計(jì)每缸中魚的數(shù)量和總重量，計(jì)算存活率、終末體重、增重率、攝食量、特定生長(zhǎng)率和飼料系數(shù)。每缸隨機(jī)取3尾魚分析全魚體成分，如水分、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、灰分的含量。

生長(zhǎng)性能的計(jì)算公式如下：

存活率(%)=終末尾數(shù)/初始尾數(shù)×100%

增重率(%)=(終末體重-初始體重)/初始體重×100%

特定生長(zhǎng)率(%/d)=(ln終末體重-ln初始體重)/飼養(yǎng)天數(shù)×100%

飼料系數(shù)=攝食飼料總量/(終末體重-初始體重)

1.3.3 腸道組織結(jié)構(gòu) 試驗(yàn)結(jié)束后，每缸隨機(jī)取4尾魚，分離胃部后端膨大處1 cm的前腸，置于4%福爾馬林固定液中保存，制備石蠟組織切片，采用高碘酸-無(wú)色品紅染色(PAS染色)，置于顯微鏡下觀察腸絨毛形態(tài)[9]，測(cè)定腸絨毛杯狀細(xì)胞數(shù)量(以單個(gè)完整腸絨毛計(jì))、腸絨毛長(zhǎng)度、腸絨毛寬度、肌層厚度。

1.3.4 指標(biāo)分析 飼料、全魚和糞便樣品中的水分含量采用105 ℃常壓干燥法測(cè)定，粗蛋白質(zhì)含量采用凱氏定氮法測(cè)定，粗脂肪含量采用乙醚抽提法測(cè)定，灰分含量采用550 ℃ 灼燒法測(cè)定。飼料和糞便樣品中的酸不溶灰分含量依據(jù)Huang等[13]方法測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。依據(jù)One-Way ANOVA單因素方差分析和Duncan氏多重比較法對(duì)數(shù)據(jù)的差異顯著性進(jìn)行分析，若不滿足方差齊性，則采用Dunnett-T3檢驗(yàn)法進(jìn)行多重比較。試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，顯著性水平為P<0.05。

2 結(jié) 果

2.1 生長(zhǎng)性能

由表2可知，各組之間的成活率和飼料系數(shù)無(wú)顯著差異(P>0.05)。T3組的終末體重、增重率、攝食量和特定生長(zhǎng)率均顯著低于T1和T2組(P<0.05)。T1和T2組之間的終末體重、增重率、攝食量和特定生長(zhǎng)率均無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表2 海鱸生長(zhǎng)性能的測(cè)定結(jié)果

2.2 全魚體成分

由表3可知，全魚水分、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪和灰分含量在3組間均無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表3 海鱸全魚體成分的測(cè)定結(jié)果(濕重基礎(chǔ))

2.3 營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率

由表4可知，干物質(zhì)和粗蛋白質(zhì)的表觀消化率均表現(xiàn)為T1>T2>T3(P<0.05)。T3組粗脂肪表觀消化率顯著低于T1和T2組(P<0.05)，T1和T2組之間的粗脂肪表觀消化率無(wú)顯著差異(P>0.05)。各組之間灰分表觀消化率無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表4 海鱸營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的測(cè)定結(jié)果

2.4 腸道組織結(jié)構(gòu)

由圖1可知，T1組腸道組織結(jié)構(gòu)正常，腸絨毛形態(tài)規(guī)則，排列整齊。T2組腸絨毛結(jié)構(gòu)有輕度損傷，表現(xiàn)為腸絨毛長(zhǎng)度縮短，杯狀細(xì)胞數(shù)量增加。T3組腸絨毛結(jié)構(gòu)損傷嚴(yán)重，表現(xiàn)為腸絨毛萎縮變形，邊緣輪廓不清，部分絨毛斷裂交聯(lián)，絨毛長(zhǎng)度縮短，杯狀細(xì)胞數(shù)量增加。

線段a，肌層厚度；線段b，絨毛長(zhǎng)度；線段c，絨毛寬度；箭頭，指示杯狀細(xì)胞Segment a,Muscular thickness;Segment b,Villus length;Segment c,Villus width;Arrow,Indicates gobbler cells圖1 海鱸腸道組織結(jié)構(gòu)(PAS染色，200×)Fig.1 Intestinal histomorphology of Lateolabtax maculatus (PAS staining,200×)

由表5可知，絨毛長(zhǎng)度表現(xiàn)為T1>T2>T3(P<0.05)。T2和T3組杯狀細(xì)胞數(shù)量顯著大于T1(P<0.05)，T2和T3組之間的杯狀細(xì)胞數(shù)量無(wú)顯著差異(P>0.05)。各組之間的絨毛寬度和肌層厚度均無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表5 海鱸腸絨毛長(zhǎng)度、寬度、肌層厚度和杯狀細(xì)胞數(shù)的測(cè)定結(jié)果

3 討 論

3.1 縮合單寧對(duì)海鱸生長(zhǎng)性能的影響

Peng等[7]報(bào)道，當(dāng)飼料中縮合單寧的添加量為0.2、0.4、0.6和0.8 g/kg時(shí)，不影響海鱸的生長(zhǎng)性能。本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼料中添加1 g/kg縮合單寧也不影響海鱸的生長(zhǎng)性能，但添加2 g/kg縮合單寧則顯著抑制了海鱸生長(zhǎng)，說(shuō)明縮合單寧對(duì)海鱸生長(zhǎng)性能的影響取決于飼料中縮合單寧的添加量。這與Becker等[14]在鯉魚及Aiura等[15]在羅非魚上的研究結(jié)果相似。Peng等[9]報(bào)道，飼料中添加0.5 g/kg縮合單寧顯著增加了凡納濱對(duì)蝦的增重率和特定生長(zhǎng)率，說(shuō)明適量的縮合單寧對(duì)凡納濱對(duì)蝦具有促生長(zhǎng)作用。另有研究表明，飼料中單寧水平低于5 g/kg可提高虹鱒[16]、條文鱸[17]、小龍蝦[18]和羅非魚[19]的生長(zhǎng)性能。綜上所述，縮合單寧對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物生長(zhǎng)性能的影響主要取決于飼料中縮合單寧的水平以及水產(chǎn)動(dòng)物的種類。在本試驗(yàn)中，飼料中添加1 g/kg縮合單寧顯著降低了海鱸干物質(zhì)和粗蛋白質(zhì)的表觀消化率，減少了腸絨毛高度，但不影響海鱸生長(zhǎng)性能，這可能是縮合單寧對(duì)海鱸有利和不利影響相互抵消的結(jié)果。一方面，縮合單寧通過(guò)損傷腸道組織結(jié)構(gòu)干預(yù)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)產(chǎn)生不利影響；另一方面，縮合單寧通過(guò)提高機(jī)體抗氧化免疫力，促進(jìn)動(dòng)物健康生長(zhǎng)，如Peng等[7]研究表明，飼料中添加1 g/kg縮合單寧不僅不影響海鱸的生長(zhǎng)性能，還能增強(qiáng)機(jī)體抗氧化和抗應(yīng)激能力。

3.2 縮合單寧對(duì)海鱸營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的影響

本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼料中添加縮合單寧降低了海鱸對(duì)干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)和粗脂肪的表觀消化率。相關(guān)研究表明，縮合單寧可以降低魚類的采食量和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的表觀消化率，因?yàn)榭s合單寧具有苦澀味，影響飼料適口性[14,20]。據(jù)Peng等[7]報(bào)道，當(dāng)飼料中縮合單寧的添加量為0.6、0.8和1.0 g/kg時(shí)，顯著抑制了海鱸對(duì)干物質(zhì)的表觀消化率。本試驗(yàn)中，縮合單寧抑制海鱸營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的原因可能是因?yàn)榭s合單寧對(duì)腸道消化酶活性的抑制作用。Peng等[21]研究表明，飼料中添加縮合單寧顯著抑制了海鱸的腸道鈉鉀ATP酶及胰蛋白酶活性，從而阻礙了腸道對(duì)氨基酸的吸收，降低了飼料消化率。縮合單寧對(duì)腸道消化功能的抑制作用通常歸因于縮合單寧與腸道中其他營(yíng)養(yǎng)素形成了復(fù)合物，如縮合單寧與酶或蛋白質(zhì)形成復(fù)合物，以及縮合單寧通過(guò)抑制腸道微生物而降低后者對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化能力[22-23]。另一方面，從本試驗(yàn)?zāi)c道組織結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果來(lái)看，飼料中添加縮合單寧降低了腸絨毛長(zhǎng)度，增加了絨毛杯狀細(xì)胞數(shù)量，表明縮合單寧破壞了海鱸的腸絨毛結(jié)構(gòu)與腸道完整性，這可能是縮合單寧降低營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的重要原因之一。

3.3 縮合單寧對(duì)海鱸腸道組織結(jié)構(gòu)的影響

腸道組織結(jié)構(gòu)分析是評(píng)價(jià)動(dòng)物腸道健康的主要手段之一。本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼料中添加縮合單寧破壞了海鱸的腸道組織結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致腸絨毛長(zhǎng)度縮短，杯狀細(xì)胞數(shù)量增加。絨毛長(zhǎng)度縮短代表腸道吸收面積減少，杯狀細(xì)胞數(shù)目增加代表腸道炎癥增加[24]。張敏等[25]研究表明，飼糧中添加0.3 g/kg單寧及兒茶提取物顯著降低了肉雞的腸絨毛長(zhǎng)度，不利于腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的發(fā)育。黎梅[4]報(bào)道，飼料中添加縮合單寧破壞了草魚腸道組織結(jié)構(gòu)，削弱腸道健康，這是因?yàn)榭s合單寧誘導(dǎo)了腸道氧化損傷，加重細(xì)胞凋亡，抑制肌球蛋白輕鏈激酶信號(hào)通路，最終破壞腸道緊密連接結(jié)構(gòu)和完整性。此外，縮合單寧具有較強(qiáng)的收斂性，容易與腸道黏膜蛋白形成不溶性鞣酸蛋白沉淀，從而改變腸絨毛形態(tài)結(jié)構(gòu)[4]，這可能是縮合單寧破壞海鱸腸道組織結(jié)構(gòu)的另一原因。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)條件下，飼料中添加1和2 g/kg縮合單寧對(duì)海鱸的生長(zhǎng)性能、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化率和腸道組織結(jié)構(gòu)均產(chǎn)生一定影響。2 g/kg縮合單寧可抑制海鱸生長(zhǎng)，降低營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化率，并誘發(fā)腸道損傷，提示海鱸飼料中添加縮合單寧應(yīng)當(dāng)謹(jǐn)慎，建議添加水平不高于1 g/kg。