彭 凱，陳 冰，趙紅霞，王麗娟，朱喜鋒，黃 文

(廣東省農(nóng)業(yè)科學院動物科學研究所，廣東省畜禽育種與營養(yǎng)研究重點實驗室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華南動物營養(yǎng)與飼料重點實驗室，廣州 510640)

海鱸(Lateolabtaxmaculatus)，又稱花鱸、七星鱸，是中國海水養(yǎng)殖鱸魚的主要優(yōu)質(zhì)品種之一，主要分布于中國東南沿海地區(qū)，如廣東、福建、山東。海鱸肉質(zhì)細嫩、味道鮮美、營養(yǎng)豐富，一直備受市場和消費者青睞。根據(jù)中國漁業(yè)統(tǒng)計年鑒數(shù)據(jù)顯示，2020年中國海鱸產(chǎn)量近20萬t，年總產(chǎn)值超過30億元，市場前景廣闊[1]。然而，隨著集約化高密度養(yǎng)殖模式的迅猛發(fā)展，海鱸養(yǎng)殖暴露出來的氧化應激、病害、免疫力低等問題逐漸加劇，已成為制約產(chǎn)業(yè)發(fā)展亟待解決的問題。另一方面，自2021年進入“無抗時代”后，水產(chǎn)生產(chǎn)面臨的挑戰(zhàn)有增無減，抗生素優(yōu)勢的空缺亟待填補，迫切需要尋求新的抗生素替代品，維持水產(chǎn)養(yǎng)殖朝向綠色、安全、可持續(xù)的方向發(fā)展。

植物提取物來源于大自然，相比抗生素及化學藥物，具有高效、綠色、安全的優(yōu)勢，是抗生素替代品的理想選擇。在眾多植物提取物中，縮合單寧是一類由黃烷-3-醇單體組成的聚合物，屬于多酚類化合物，具有較強的抗菌、消炎、抗氧化等生物活性[2-3]。長期以來，縮合單寧被視為飼料抗營養(yǎng)因子，主要歸因于縮合單寧對動物采食量、營養(yǎng)物質(zhì)消化率及生長的不利影響。然而，有關(guān)縮合單寧對水產(chǎn)動物生長和健康的研究報道很少，相關(guān)作用機理仍不完全清楚。黎梅[4]研究表明，飼料中縮合單寧(純度78%)的添加量超過30 g/kg可降低草魚的采食量和生長性能，破壞腸道組織結(jié)構(gòu)，削弱腸道健康。近年來研究表明，低劑量縮合單寧不僅不影響動物的生長，還能通過調(diào)節(jié)動物腸道菌群的途徑增強機體健康[5-6]。Peng等[7-8]報道，當飼料中縮合單寧的添加量<1 g/kg時，不僅不影響海鱸的生長性能和消化功能，還能提高海鱸血清和肝臟的抗氧化能力，增強魚體抵抗環(huán)境應激的能力。飼料中添加0.5 g/kg縮合單寧對凡納濱對蝦具有促生長作用[9]。這說明縮合單寧對水產(chǎn)動物生長和健康的影響與其濃度直接相關(guān)。然而高劑量(>1 g/kg)縮合單寧對海鱸影響如何仍不清楚。本試驗通過研究縮合單寧對海鱸生長性能、體成分、營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率及腸道組織結(jié)構(gòu)的影響，旨為飼用縮合單寧的資源開發(fā)及其在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗飼料

3種試驗飼料(T1、T2和T3)組成及營養(yǎng)水平見表1。T1為基礎飼料，T2和T3分別在T1的基礎上添加1和2 g/kg縮合單寧，3組飼料配制時保持等氮等脂。縮合單寧來源于葡萄籽(購自廣州飛禧特生物科技有限公司)，其提取和純化步驟參照彭凱[10]方法，縮合單寧先溶于水后添加到飼料中。飼料原料全部通過60目標準篩，混合均勻后經(jīng)雙螺桿擠壓機(SLX-80，華南理工大學科技實業(yè)有限公司)制成顆粒飼料(直徑為2.0 mm)，經(jīng)55 ℃烘干，冷卻至室溫，于-20 ℃保存?zhèn)溆?。T1、T2和T3中縮合單寧的實際含量分別為0、0.95和1.93 g/kg(參照Terrill等[11]方法檢測)。

表1 試驗飼料組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎)

1.2 試驗設計與飼養(yǎng)管理

選擇初始體重為(2.76±0.05)g的健康海鱸幼苗480尾，隨機分為3組，每組4個重復，每個重復40尾。將魚苗隨機分配到12個圓柱形玻璃纖維缸(容積為350 L)中，分別投喂3組試驗飼料，養(yǎng)殖周期為63 d。采取飽食投喂方法，每天飼喂2次(08:00和20:00)，記錄飼料投喂量、魚苗死亡數(shù)量及養(yǎng)殖水質(zhì)情況。試驗期間采取自然光照，水溫為26～28 ℃，溶解氧濃度>5.0 mg/L，氨氮及亞硝酸鹽濃度<0.02 mg/L，pH為7.8～8.2。

1.3 樣品采集與分析

1.3.1 表觀消化率 于試驗周期的第49～63天連續(xù)收集糞便，每天晨飼后1 h清除殘料，4 h后依據(jù)虹吸法收集新鮮、飽滿、包膜完整的糞便(收集糞便期間暫停曝氣)，直至每個重復收集到足夠的糞便(干物質(zhì)重>10 g)，樣品于-20 ℃保存，依據(jù)酸不溶灰分法測定營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率[12]，包括干物質(zhì)消化率、粗蛋白質(zhì)消化率、粗脂肪消化率、灰分消化率。

表觀消化率的計算公式如下：

營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率(%)=[1-(a×b)/(c×d)]×100%，其中a和b分別為飼料和糞便中酸不溶灰分的含量(%)，b和d分別為糞便和飼料中營養(yǎng)物質(zhì)的含量(%)。

1.3.2 生長性能 試驗結(jié)束后，海鱸禁食24 h后采樣。統(tǒng)計每缸中魚的數(shù)量和總重量，計算存活率、終末體重、增重率、攝食量、特定生長率和飼料系數(shù)。每缸隨機取3尾魚分析全魚體成分，如水分、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、灰分的含量。

生長性能的計算公式如下：

存活率(%)=終末尾數(shù)/初始尾數(shù)×100%

增重率(%)=(終末體重-初始體重)/初始體重×100%

特定生長率(%/d)=(ln終末體重-ln初始體重)/飼養(yǎng)天數(shù)×100%

飼料系數(shù)=攝食飼料總量/(終末體重-初始體重)

1.3.3 腸道組織結(jié)構(gòu) 試驗結(jié)束后，每缸隨機取4尾魚，分離胃部后端膨大處1 cm的前腸，置于4%福爾馬林固定液中保存，制備石蠟組織切片，采用高碘酸-無色品紅染色(PAS染色)，置于顯微鏡下觀察腸絨毛形態(tài)[9]，測定腸絨毛杯狀細胞數(shù)量(以單個完整腸絨毛計)、腸絨毛長度、腸絨毛寬度、肌層厚度。

1.3.4 指標分析 飼料、全魚和糞便樣品中的水分含量采用105 ℃常壓干燥法測定，粗蛋白質(zhì)含量采用凱氏定氮法測定，粗脂肪含量采用乙醚抽提法測定，灰分含量采用550 ℃ 灼燒法測定。飼料和糞便樣品中的酸不溶灰分含量依據(jù)Huang等[13]方法測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對試驗數(shù)據(jù)進行分析。依據(jù)One-Way ANOVA單因素方差分析和Duncan氏多重比較法對數(shù)據(jù)的差異顯著性進行分析，若不滿足方差齊性，則采用Dunnett-T3檢驗法進行多重比較。試驗數(shù)據(jù)用平均值±標準誤表示，顯著性水平為P<0.05。

2 結(jié) 果

2.1 生長性能

由表2可知，各組之間的成活率和飼料系數(shù)無顯著差異(P>0.05)。T3組的終末體重、增重率、攝食量和特定生長率均顯著低于T1和T2組(P<0.05)。T1和T2組之間的終末體重、增重率、攝食量和特定生長率均無顯著差異(P>0.05)。

表2 海鱸生長性能的測定結(jié)果

2.2 全魚體成分

由表3可知，全魚水分、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪和灰分含量在3組間均無顯著差異(P>0.05)。

表3 海鱸全魚體成分的測定結(jié)果(濕重基礎)

2.3 營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率

由表4可知，干物質(zhì)和粗蛋白質(zhì)的表觀消化率均表現(xiàn)為T1>T2>T3(P<0.05)。T3組粗脂肪表觀消化率顯著低于T1和T2組(P<0.05)，T1和T2組之間的粗脂肪表觀消化率無顯著差異(P>0.05)。各組之間灰分表觀消化率無顯著差異(P>0.05)。

表4 海鱸營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的測定結(jié)果

2.4 腸道組織結(jié)構(gòu)

由圖1可知，T1組腸道組織結(jié)構(gòu)正常，腸絨毛形態(tài)規(guī)則，排列整齊。T2組腸絨毛結(jié)構(gòu)有輕度損傷，表現(xiàn)為腸絨毛長度縮短，杯狀細胞數(shù)量增加。T3組腸絨毛結(jié)構(gòu)損傷嚴重，表現(xiàn)為腸絨毛萎縮變形，邊緣輪廓不清，部分絨毛斷裂交聯(lián)，絨毛長度縮短，杯狀細胞數(shù)量增加。

線段a，肌層厚度；線段b，絨毛長度；線段c，絨毛寬度；箭頭，指示杯狀細胞Segment a,Muscular thickness;Segment b,Villus length;Segment c,Villus width;Arrow,Indicates gobbler cells圖1 海鱸腸道組織結(jié)構(gòu)(PAS染色，200×)Fig.1 Intestinal histomorphology of Lateolabtax maculatus (PAS staining,200×)

由表5可知，絨毛長度表現(xiàn)為T1>T2>T3(P<0.05)。T2和T3組杯狀細胞數(shù)量顯著大于T1(P<0.05)，T2和T3組之間的杯狀細胞數(shù)量無顯著差異(P>0.05)。各組之間的絨毛寬度和肌層厚度均無顯著差異(P>0.05)。

表5 海鱸腸絨毛長度、寬度、肌層厚度和杯狀細胞數(shù)的測定結(jié)果

3 討 論

3.1 縮合單寧對海鱸生長性能的影響

Peng等[7]報道，當飼料中縮合單寧的添加量為0.2、0.4、0.6和0.8 g/kg時，不影響海鱸的生長性能。本試驗結(jié)果表明，飼料中添加1 g/kg縮合單寧也不影響海鱸的生長性能，但添加2 g/kg縮合單寧則顯著抑制了海鱸生長，說明縮合單寧對海鱸生長性能的影響取決于飼料中縮合單寧的添加量。這與Becker等[14]在鯉魚及Aiura等[15]在羅非魚上的研究結(jié)果相似。Peng等[9]報道，飼料中添加0.5 g/kg縮合單寧顯著增加了凡納濱對蝦的增重率和特定生長率，說明適量的縮合單寧對凡納濱對蝦具有促生長作用。另有研究表明，飼料中單寧水平低于5 g/kg可提高虹鱒[16]、條文鱸[17]、小龍蝦[18]和羅非魚[19]的生長性能。綜上所述，縮合單寧對水產(chǎn)動物生長性能的影響主要取決于飼料中縮合單寧的水平以及水產(chǎn)動物的種類。在本試驗中，飼料中添加1 g/kg縮合單寧顯著降低了海鱸干物質(zhì)和粗蛋白質(zhì)的表觀消化率，減少了腸絨毛高度，但不影響海鱸生長性能，這可能是縮合單寧對海鱸有利和不利影響相互抵消的結(jié)果。一方面，縮合單寧通過損傷腸道組織結(jié)構(gòu)干預營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，對動物生長產(chǎn)生不利影響；另一方面，縮合單寧通過提高機體抗氧化免疫力，促進動物健康生長，如Peng等[7]研究表明，飼料中添加1 g/kg縮合單寧不僅不影響海鱸的生長性能，還能增強機體抗氧化和抗應激能力。

3.2 縮合單寧對海鱸營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的影響

本試驗結(jié)果表明，飼料中添加縮合單寧降低了海鱸對干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)和粗脂肪的表觀消化率。相關(guān)研究表明，縮合單寧可以降低魚類的采食量和營養(yǎng)物質(zhì)的表觀消化率，因為縮合單寧具有苦澀味，影響飼料適口性[14,20]。據(jù)Peng等[7]報道，當飼料中縮合單寧的添加量為0.6、0.8和1.0 g/kg時，顯著抑制了海鱸對干物質(zhì)的表觀消化率。本試驗中，縮合單寧抑制海鱸營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的原因可能是因為縮合單寧對腸道消化酶活性的抑制作用。Peng等[21]研究表明，飼料中添加縮合單寧顯著抑制了海鱸的腸道鈉鉀ATP酶及胰蛋白酶活性，從而阻礙了腸道對氨基酸的吸收，降低了飼料消化率?？s合單寧對腸道消化功能的抑制作用通常歸因于縮合單寧與腸道中其他營養(yǎng)素形成了復合物，如縮合單寧與酶或蛋白質(zhì)形成復合物，以及縮合單寧通過抑制腸道微生物而降低后者對營養(yǎng)物質(zhì)的消化能力[22-23]。另一方面，從本試驗腸道組織結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果來看，飼料中添加縮合單寧降低了腸絨毛長度，增加了絨毛杯狀細胞數(shù)量，表明縮合單寧破壞了海鱸的腸絨毛結(jié)構(gòu)與腸道完整性，這可能是縮合單寧降低營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的重要原因之一。

3.3 縮合單寧對海鱸腸道組織結(jié)構(gòu)的影響

腸道組織結(jié)構(gòu)分析是評價動物腸道健康的主要手段之一。本試驗結(jié)果表明，飼料中添加縮合單寧破壞了海鱸的腸道組織結(jié)構(gòu)，導致腸絨毛長度縮短，杯狀細胞數(shù)量增加。絨毛長度縮短代表腸道吸收面積減少，杯狀細胞數(shù)目增加代表腸道炎癥增加[24]。張敏等[25]研究表明，飼糧中添加0.3 g/kg單寧及兒茶提取物顯著降低了肉雞的腸絨毛長度，不利于腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的發(fā)育。黎梅[4]報道，飼料中添加縮合單寧破壞了草魚腸道組織結(jié)構(gòu)，削弱腸道健康，這是因為縮合單寧誘導了腸道氧化損傷，加重細胞凋亡，抑制肌球蛋白輕鏈激酶信號通路，最終破壞腸道緊密連接結(jié)構(gòu)和完整性。此外，縮合單寧具有較強的收斂性，容易與腸道黏膜蛋白形成不溶性鞣酸蛋白沉淀，從而改變腸絨毛形態(tài)結(jié)構(gòu)[4]，這可能是縮合單寧破壞海鱸腸道組織結(jié)構(gòu)的另一原因。

4 結(jié) 論

本試驗條件下，飼料中添加1和2 g/kg縮合單寧對海鱸的生長性能、營養(yǎng)物質(zhì)消化率和腸道組織結(jié)構(gòu)均產(chǎn)生一定影響。2 g/kg縮合單寧可抑制海鱸生長，降低營養(yǎng)物質(zhì)消化率，并誘發(fā)腸道損傷，提示海鱸飼料中添加縮合單寧應當謹慎，建議添加水平不高于1 g/kg。