張雪萍，石斌剛，金夏陽(yáng)，王向彥，蘭麗娟，時(shí) 鈺，祁有鵬，趙世杰，李少斌，胡 江

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅省草食動(dòng)物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730070)

脂肪組織主要分布在動(dòng)物皮下、內(nèi)臟及肌肉間等部位，可調(diào)節(jié)動(dòng)物機(jī)體能量平衡和脂質(zhì)代謝[1]。動(dòng)物脂肪代謝過(guò)程受到多種轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控，如過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptors，PPARs)、CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白(CCAAT/enhancer binding protein，C/EBP)、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(sterol regulatory element binding proteins，SREBPs)、叉頭框蛋白家族(Fork head box，F(xiàn)ox)[2]、鋅指蛋白家族2(GATA-binding protein 2，GATA2)和鋅指蛋白家族3(GATA-binding protein 3，GATA3)[3]及Krüppel樣因子(Krüppel-like factors，KLFs)家族等。

KLFs是一類(lèi)廣泛分布于真核生物體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子[4]，KLFs家族包括17個(gè)成員，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和胚胎發(fā)育等生物學(xué)過(guò)程[5]。據(jù)報(bào)道，KLFs家族多個(gè)成員在脂肪細(xì)胞分化中發(fā)揮重要作用[6]，其中KLF4、KLF5、KLF6和KLF15正向調(diào)控脂肪細(xì)胞分化，而KLF2、KLF3和KLF7則負(fù)向調(diào)控脂肪細(xì)胞分化[7]。KLF7基因也稱(chēng)為UKLF，在動(dòng)物體多個(gè)組織中廣泛表達(dá)，參與調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、Ⅱ型糖尿病發(fā)生及脂質(zhì)代謝等多種生物學(xué)過(guò)程[8-11]。研究表明，過(guò)表達(dá)KLF7基因可抑制C2C12成肌細(xì)胞、髓前體細(xì)胞增殖[12-13]；人和小鼠中過(guò)表達(dá)KLF7基因會(huì)抑制脂肪細(xì)胞分化和脂質(zhì)生成關(guān)鍵基因的表達(dá)[10]；miR-146b可下調(diào)KLF7基因表達(dá)并促進(jìn)人內(nèi)臟脂肪分化[14]；KLF7基因突變與雞血漿極低密度脂蛋白(very low-density lipoprotein，VLDL)含量、腹脂重等脂肪性狀相關(guān)[15]。

藏綿羊是中國(guó)三大原始綿羊品種之一，目前存欄量約2 500萬(wàn)只，主要分布在海拔3 000 m以上的青藏高原及其毗鄰地區(qū)[16]。藏綿羊適應(yīng)青藏高原嚴(yán)酷的環(huán)境條件，耐寒、耐粗飼能力強(qiáng)，羊肉纖維致密，細(xì)嫩多汁，且具有高蛋白、低脂肪的特點(diǎn)[17]，是當(dāng)?shù)啬撩裰匾纳钯Y源。脂肪沉積與綿羊生產(chǎn)性能(如肉品質(zhì))及飼料報(bào)酬等密切相關(guān)，但目前對(duì)藏綿羊脂肪沉積機(jī)制的分子遺傳研究相對(duì)較少?；贙LF7基因在動(dòng)物機(jī)體脂質(zhì)代謝中的重要作用，本研究擬檢測(cè)KLF7基因在藏綿羊各組織及成脂誘導(dǎo)分化不同階段脂肪細(xì)胞中的表達(dá)水平，構(gòu)建pcDNA3.1-KLF7過(guò)表達(dá)載體，探究過(guò)表達(dá)KLF7基因?qū)η爸炯?xì)胞增殖及分化的影響，以期為深入了解KLF7基因在藏綿羊脂肪生成中的調(diào)控機(jī)制提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 于甘肅省甘南藏族自治州選取飼養(yǎng)條件相同的3月齡健康藏綿羊公羊3只，屠宰后采集皮下脂肪、腎臟、瘤胃、背最長(zhǎng)肌、大腦、睪丸、回腸等組織樣，同時(shí)每只藏綿羊采集腹股溝處約1 cm3皮下脂肪組織樣，立刻投入液氮中，帶回實(shí)驗(yàn)室-80 ℃保存，用于組織表達(dá)譜分析及真核過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建，皮下脂肪樣品用含雙抗的PBS緩沖液清洗3遍，用于前脂肪細(xì)胞增殖分化研究。

1.1.2 主要試劑及儀器 DL2000 DNA Marker、1 kb DNA Marker、Trizol Reagent試劑盒和SYBR Green ProTaqHS預(yù)混型qPCR試劑盒均購(gòu)自艾科瑞生物公司；限制性核酸內(nèi)切酶KpnⅠ和XhoⅠ均購(gòu)自TaKaRa公司；大腸桿菌Trans5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金生物科技有限公司；胎牛血清購(gòu)自Invitrogen公司；PBS緩沖液、雙抗和DMEM培養(yǎng)基均購(gòu)自HyClone公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和HiScript Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis Kit均購(gòu)自諾唯贊生物科技有限公司；BeyoClickTMEdU-555細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；INVI DNA RNA Transfection ReagentTM轉(zhuǎn)染試劑和CCK-8試劑盒均購(gòu)自Invigentech公司；質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；油紅O染色液購(gòu)自索萊寶生物科技有限公司。

超微量分光光度計(jì)(NanoDropTMOne)、Varioskan LUX酶標(biāo)儀均購(gòu)自Thermo Scientific公司；IX53型熒光倒置顯微鏡購(gòu)自O(shè)lympus公司。

1.2 方法

1.2.1 藏綿羊前脂肪細(xì)胞的分離培養(yǎng) 采用酶消化法分離培養(yǎng)藏綿羊前脂肪細(xì)胞[18]，具體為：脂肪組織去除肉眼可見(jiàn)的血管和筋膜后，用含1%雙抗的PBS緩沖液清洗3次后，剪至1 mm3大小的微粒狀，加入0.1%中性蛋白酶Ⅱ和Ⅳ型膠原酶，放置搖床消化90 min；加入等體積含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化，用200目的細(xì)胞過(guò)濾篩，反復(fù)過(guò)濾消化液，1 500 r/min離心10 min，棄上清；加入1 mL紅細(xì)胞裂解液，吹打數(shù)次，室溫靜止5 min，1 500 r/min離心5 min。離心結(jié)束后棄上清，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并將細(xì)胞接種至T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)24 h棄上清，細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)后進(jìn)行傳代及凍存。

1.2.2 總RNA提取及cDNA合成 根據(jù)Trizol Reagent試劑盒說(shuō)明書(shū)分別提取藏綿羊不同組織總RNA，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性，用超微量分光光度計(jì)評(píng)估RNA純度和濃度。檢測(cè)合格的總RNA使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 PCR擴(kuò)增與測(cè)序 根據(jù)GenBank中公布的綿羊(Ovisaries)KLF7基因mRNA序列(登錄號(hào)：XM_027965128)，應(yīng)用Primer Premier 3.0在線(xiàn)軟件設(shè)計(jì)引物P1(表1)，用于藏綿羊KLF7基因CDS區(qū)擴(kuò)增。引物由楊凌天潤(rùn)奧科生物科技有限公司合成。PCR反應(yīng)體系20 μL：高保真Taq酶10 μL，脂肪組織cDNA(100 ng/μL)0.8 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL，ddH2O 7.6 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送楊凌天潤(rùn)奧科生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.4 藏綿羊KLF7基因組織表達(dá)差異分析 根據(jù)綿羊KLF7基因mRNA序列(GenBank登錄號(hào)：XM_027965128)，應(yīng)用Primer Premier 3.0在線(xiàn)軟件設(shè)計(jì)引物P2(表1)，用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)KLF7基因在藏綿羊大腦、皮下脂肪、腎臟、背最長(zhǎng)肌、瘤胃、睪丸和回腸中的相對(duì)表達(dá)量，以β-tubulin為內(nèi)參基因，對(duì)應(yīng)引物P9(表1)。引物均由楊凌天潤(rùn)奧科生物科技有限公司合成。PCR反應(yīng)體系20 μL：2×SYBR qPCR MasterMix 10 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL，cDNA(100 ng/μL) 2 μL，ddH2O補(bǔ)足體系。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性15 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火32 s，72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.2.5KLF7基因在藏綿羊脂肪細(xì)胞不同分化期的表達(dá) 復(fù)蘇藏綿羊前脂肪細(xì)胞，將前脂肪細(xì)胞接種于12孔板，加入適量基礎(chǔ)生長(zhǎng)培養(yǎng)基(10%胎牛血清、90% DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、0.1%雙抗)培養(yǎng)；待細(xì)胞匯合度至90%時(shí)，用MDI(DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基+胰島素+地塞米松+3-異丁基-1-甲基黃嘌呤)誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基培養(yǎng)至第8天。按照1.2.2方法分別從分化第0、2、4、8天的脂肪細(xì)胞提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，按照1.2.4方法使用P2引物檢測(cè)誘導(dǎo)分化不同階段脂肪細(xì)胞中KLF7基因的表達(dá)量。

表1 引物信息

1.2.6 過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建及測(cè)序 將1.2.3測(cè)序正確的KLF7基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后，使用KpnⅠ和XhoⅠ限制性核酸內(nèi)切酶37 ℃酶切30 min，酶切產(chǎn)物再次純化；將純化產(chǎn)物與Solution Ⅰ連接酶混合均勻，連接至pcDNA3.1(+)真核表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)板上，于搖床中倒置培養(yǎng)過(guò)夜；次日挑取單克隆菌落于LB液體培養(yǎng)基中搖至渾濁有明顯沉淀后，利用pcDNA3.1(+)通用引物(T7-BGH)進(jìn)行菌液PCR擴(kuò)增鑒定，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，采用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒并送測(cè)序，重組質(zhì)粒命名為pcDNA3.1-KLF7，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7 藏綿羊前脂肪細(xì)胞增殖及活力檢測(cè) 取出凍存的藏綿羊前脂肪細(xì)胞，37 ℃水浴鍋解凍復(fù)蘇后接種于12孔板內(nèi)，培養(yǎng)24 h待細(xì)胞匯合度達(dá)到50%左右，將pcDNA3.1-NC(對(duì)照組)和pcDNA3.1-KLF7質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至12孔板內(nèi)，48 h后按照1.2.2方法提取細(xì)胞總RNA。應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)KLF7和增殖標(biāo)志基因CDK4、CyclinB1和CyclinD1的mRNA表達(dá)量，以β-tubulin為內(nèi)參基因，相應(yīng)基因的引物分別為P3、P4、P5和P9(表1)，PCR反應(yīng)體系及程序同1.2.4。按照BeyoClickTMEdU-555細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒處理步驟，對(duì)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-NC和pcDNA3.1-KLF7質(zhì)粒48 h后的脂肪細(xì)胞進(jìn)行EdU染色處理，染色后放置熒光顯微鏡觀察染色結(jié)果并拍照。采用CCK-8試劑盒檢測(cè)前脂肪細(xì)胞活力，將pcDNA3.1-NC和pcDNA3.1-KLF7過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至96孔板，48 h后每孔加入10 μL的CCK-8試劑，并在37 ℃孵育1 h后，VarioskanTMLUX酶標(biāo)儀測(cè)定每個(gè)樣品在450 nm波長(zhǎng)的光密度值。

1.2.8 藏綿羊前脂肪細(xì)胞的轉(zhuǎn)染、誘導(dǎo)分化及油紅O染色 取出凍存的前脂肪細(xì)胞，接種于12孔板，培養(yǎng)24 h后，按照INVI DNA RNA Transfection ReagentTM轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書(shū)將pcDNA3.1-NC和pcDNA3.1-KLF7質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至細(xì)胞內(nèi)，基礎(chǔ)生長(zhǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，替換為MDI(DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基+胰島素+地塞米松+3-異丁基-1-甲基黃嘌呤)誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2 d，8 d后收集細(xì)胞，按照1.2.2方法提取總RNA。用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)KLF7基因及脂肪細(xì)胞分化標(biāo)志基因PPARγ、Glut4和ELOVL6的mRNA表達(dá)情況，以β-tubulin為內(nèi)參基因，相應(yīng)基因的擴(kuò)增引物分別為P6、P7、P8和P9(表1)，PCR反應(yīng)體系及程序同1.2.4。此外，檢測(cè)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-NC和pcDNA3.1-KLF7質(zhì)粒后脂肪細(xì)胞脂滴著色情況，即4%多聚甲醛固定脂肪細(xì)胞30 min，PBS清洗3遍，油紅O染色液染色1 h，置于熒光倒置顯微鏡觀察著色脂滴并拍照。

1.2.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 使用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。利用SPSS 26.0軟件進(jìn)行顯著性分析，使用Image J軟件統(tǒng)計(jì)脂肪細(xì)胞中脂滴含量和EdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目，利用GraphPad Prism 8.0繪圖。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05表示差異顯著；P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 KLF7基因在藏綿羊不同組織及不同分化期脂肪細(xì)胞中的表達(dá)特性

KLF7基因在藏綿羊不同組織及不同分化期脂肪細(xì)胞中的表達(dá)譜見(jiàn)圖1。由圖1A可知，KLF7基因在藏綿羊不同組織中均有表達(dá)，且有明顯的組織特異性，以回腸表達(dá)水平為參照，KLF7基因在藏綿羊大腦、皮下脂肪和腎臟中表達(dá)量較高，且顯著高于背最長(zhǎng)肌、瘤胃、睪丸和回腸(P<0.05)。由圖1B可知，以分化第0天的脂肪細(xì)胞表達(dá)水平為參照，KLF7基因在成脂分化第2天的脂肪細(xì)胞中表達(dá)水平最高，且顯著高于第0、4和8天(P<0.05)；在成脂分化第0天最低，且顯著低于第4和8天(P<0.05)。

肩標(biāo)不同字母表示差異極顯著(P<0.05)；肩標(biāo)相同字母表示差異不顯著(P>0.05)Values with different letter superscripts mean extremely significant difference (P<0.05);While with the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05)圖1 KLF7基因在藏綿羊不同組織(A)及不同分化期脂肪細(xì)胞(B)中的表達(dá)Fig.1 Expression of KLF7 gene in different tissues (A) and adipocytes at different differentiation stages (B) of Tibetan sheep

2.2 KLF7基因真核過(guò)表達(dá)載體鑒定

對(duì)藏綿羊KLF7基因真核過(guò)表達(dá)載體(pcDNA3.1-KLF7)進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示，片段大小為1 143 bp(圖2)，與預(yù)期相符。取鑒定正確的菌液提取質(zhì)粒并測(cè)序，結(jié)果與GenBank中綿羊KLF7基因CDS序列(登錄號(hào)：XM_027965128)相一致，表明成功構(gòu)建了藏綿羊KLF7基因真核過(guò)表達(dá)載體。

圖2 藏綿羊KLF7基因過(guò)表達(dá)載體PCR擴(kuò)增電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis of PCR amplification of KLF7 gene overexpression vector in Tibetan sheep

2.3 過(guò)表達(dá)KLF7基因?qū)Σ鼐d羊前脂肪細(xì)胞增殖的影響

2.3.1 細(xì)胞增殖標(biāo)志基因mRNA表達(dá) 過(guò)表達(dá)

KLF7基因?qū)Σ鼐d羊前脂肪細(xì)胞增殖的影響見(jiàn)圖3。由圖3A可知，前脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-KLF7質(zhì)粒48 h后，KLF7基因的表達(dá)水平較pcDNA3.1-NC提高了67倍以上(P<0.01)，表明KLF7基因成功過(guò)表達(dá)。由圖3B可知，細(xì)胞增殖標(biāo)志基因CDK4、CyclinB1及CyclinD1表達(dá)水平比對(duì)照組顯著或極顯著下調(diào)(P<0.05；P<0.01)。表明過(guò)表達(dá)KLF7基因抑制了藏綿羊前脂肪細(xì)胞增殖標(biāo)志基因的表達(dá)。

*，差異顯著(P<0.05)；**，差異極顯著(P<0.01)。下同*，Significant difference (P<0.05);**，Extremely significant difference (P<0.01).The same as below圖3 藏綿羊前脂肪細(xì)胞KLF7(A)及增殖標(biāo)志基因(B)mRNA相對(duì)表達(dá)量Fig.3 The mRNA relative expression of KLF7 (A) and proliferation marker genes (B) in preadipocytes of Tibetan sheep

2.3.2 過(guò)表達(dá)KLF7基因?qū)η爸炯?xì)胞EdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量的影響 轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-NC和pcDNA3.1-KLF7質(zhì)粒48 h后，前脂肪細(xì)胞EdU染色及陽(yáng)性細(xì)胞比例見(jiàn)圖4。由圖4可知，過(guò)表達(dá)KLF7基因極顯著下調(diào)了EdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量(P<0.01)，表明過(guò)表達(dá)KLF7基因可抑制新生成的前脂肪細(xì)胞數(shù)目，即抑制前脂肪細(xì)胞的增殖。

A，EdU染色圖(40×)；B，EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例A，EdU staining chart (40×)；B，Percentage of EdU positive cells圖4 前脂肪細(xì)胞過(guò)表達(dá)KLF7基因后EdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量Fig.4 Number of EdU positive cells after overexpression of KLF7 gene in preadipocytes

2.3.3 過(guò)表達(dá)KLF7基因?qū)η爸炯?xì)胞活力的影響 轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-NC和pcDNA3.1-KLF7質(zhì)粒48 h后，采用CCK-8檢測(cè)前脂肪細(xì)胞活力，結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)KLF7基因極顯著降低了前脂肪細(xì)胞活力(P<0.01，圖5)。

圖5 過(guò)表達(dá)KLF7基因后對(duì)前脂肪細(xì)胞活力的影響Fig.5 Effect on cell viability after KLF7 gene overexpression in preadipocytes

2.4 過(guò)表達(dá)KLF7基因?qū)Σ鼐d羊前脂肪細(xì)胞分化的影響

2.4.1 細(xì)胞分化標(biāo)志基因mRNA的表達(dá) 過(guò)表達(dá)KLF7基因藏綿羊前脂肪細(xì)胞分化標(biāo)志基因的表達(dá)水平見(jiàn)圖6。由圖6A可知，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-KLF7質(zhì)粒后KLF7基因表達(dá)量極顯著高于pcDNA3.1-NC(P<0.01)，即KLF7基因成功過(guò)表達(dá)。由圖6B可知，過(guò)表達(dá)KLF7基因后脂肪細(xì)胞分化標(biāo)志基因PPARγ、Glut4和ELOVL6的mRNA相對(duì)表達(dá)水平均顯著或極顯著低于pcDNA3.1-NC組細(xì)胞(P<0.01；P<0.05)，表明脂肪細(xì)胞過(guò)表達(dá)KLF7基因后抑制了脂肪細(xì)胞分化標(biāo)志基因的表達(dá)。

2.4.2 脂肪細(xì)胞過(guò)表達(dá)KLF7基因?qū)χ魏康挠绊?過(guò)表達(dá)KLF7基因的前脂肪細(xì)胞油紅O染色和脂滴生成量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖7。由圖7可知，前脂肪細(xì)胞過(guò)表達(dá)KLF7基因后，脂滴生成量極顯著減少(P<0.01)，表明過(guò)表達(dá)KLF7基因極顯著下調(diào)了前脂肪細(xì)胞內(nèi)的脂滴含量。

圖6 脂肪細(xì)胞過(guò)表達(dá)后KLF7(A)和分化標(biāo)志基因(B)mRNA相對(duì)表達(dá)量Fig.6 The mRNA relative expression of KLF7 (A) and adipogenic marker genes (B) after overexpression in adipocytes

圖7 油紅O染色的前脂肪細(xì)胞(A)及其脂滴含量(B)Fig.7 Oil red O staining (A) and amount of lipid droplets (B) in preadipocytes

3 討 論

3.1 藏綿羊KLF7基因表達(dá)特性分析

KLF7基因廣泛存在于海膽、魚(yú)、兩棲類(lèi)、鳥(niǎo)類(lèi)、爬行類(lèi)、哺乳類(lèi)和人等動(dòng)物的多種組織中，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和脂肪形成發(fā)揮著重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，藏綿羊KLF7基因在大腦組織中表達(dá)量最高，其次是皮下脂肪和腎臟，而在背最長(zhǎng)肌、瘤胃、睪丸和回腸中的相對(duì)表達(dá)水平較低。基因在動(dòng)物不同組織中的表達(dá)量與其功能息息相關(guān)，KLF7基因在藏綿羊大腦中的高表達(dá)可能與其腦神經(jīng)發(fā)育相關(guān)。研究證實(shí)，KLF7基因在小鼠脊索、大腦皮層及小腦等部位均表達(dá)，參與哺乳動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育，促進(jìn)軸突生長(zhǎng)和神經(jīng)元分化[19]；KLF7基因可調(diào)控雞腹脂重及血漿中VLDL含量[15，20]，且在多個(gè)物種脂肪組織中高度表達(dá)，如牦牛[21]、黃牛[22]、豬[23]及高腹部脂肪肉雞[24]。本研究中，KLF7基因在藏綿羊脂肪組織中高表達(dá)，推測(cè)該基因與藏綿羊脂肪沉積密切相關(guān)，這一結(jié)果也為進(jìn)一步研究過(guò)表達(dá)KLF7基因?qū)η爸炯?xì)胞增殖和分化的影響奠定了基礎(chǔ)。

前脂肪細(xì)胞分化受許多轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同作用，對(duì)動(dòng)物脂肪沉積有重要影響。研究表明，KLFs參與調(diào)控動(dòng)物前脂肪細(xì)胞分化[25-26]。KLF7基因在藏綿羊前脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中的時(shí)序表達(dá)表明，在未分化的前脂肪細(xì)胞中KLF7基因表達(dá)量較低，分化早期(第2天)的脂肪細(xì)胞表達(dá)量最高。KLFs家族成員在脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中存在時(shí)序表達(dá)，前脂肪細(xì)胞中KLF2基因表達(dá)量較高，分化狀態(tài)下KLF3、KLF4、KLF5和KLF7基因表達(dá)量較高，且隨著分化時(shí)間延長(zhǎng)其表達(dá)量逐漸下降[7]。朱江江等[27]研究發(fā)現(xiàn)，KLF7基因在山羊脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化第0天表達(dá)量極低，第3天達(dá)到最高峰，從5天開(kāi)始逐漸下降。Li等[28]研究表明，KLF7基因在山羊皮下脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化第2天的表達(dá)量最高，與本研究結(jié)果一致。但Zhang等[24]研究表明，雞前脂肪細(xì)胞中KLF7基因誘導(dǎo)分化的0 h表達(dá)量最高，第1、2天表達(dá)量著降低，而第3天又上升到峰值，其時(shí)序表達(dá)結(jié)果與藏綿羊及山羊有所不同，這可能與物種有關(guān)。

3.2 過(guò)表達(dá)KLF7基因抑制藏綿羊前脂肪細(xì)胞增殖

前脂肪細(xì)胞的增殖是脂肪組織發(fā)育過(guò)程中的關(guān)鍵事件，研究證實(shí)，KLF7基因參與調(diào)控細(xì)胞的增殖[29]，但有關(guān)藏綿羊前脂肪細(xì)胞增殖的功能研究較少。本研究通過(guò)檢測(cè)前脂肪細(xì)胞增殖標(biāo)志基因、EdU染色及細(xì)胞活力發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)KLF7基因可顯著抑制前脂肪細(xì)胞增殖。細(xì)胞增殖過(guò)程受眾多細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子調(diào)控，如CDKs、Cyclins及CKI，其中CDK4、CyclinB1和CyclinD1基因可加速細(xì)胞G1期到S期過(guò)渡，從而正向調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖[30]。王小斌[12]研究表明，過(guò)表達(dá)KLF7基因可抑制C2C12成肌細(xì)胞增殖；Schuettpelz等[13]報(bào)道，過(guò)表達(dá)KLF7基因可抑制髓前體細(xì)胞增殖；Li等[29]研究發(fā)現(xiàn)，miR-103通過(guò)靶向KLF7基因促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌增殖，推測(cè)過(guò)表達(dá)KLF7基因可抑制脂肪細(xì)胞增殖；但Zhang等[24]研究表明，過(guò)表達(dá)KLF7基因可促進(jìn)雞前脂肪細(xì)胞增殖，可能是KLF7基因在不同物種中表達(dá)規(guī)律具有差異性，具體原因尚需進(jìn)一步研究。

3.3 過(guò)表達(dá)KLF7基因抑制藏綿羊前脂肪細(xì)胞分化

前脂肪細(xì)胞分化是不同分化標(biāo)志基因時(shí)序表達(dá)的過(guò)程。PPARγ、Glut4、ELOVL6等基因在脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中發(fā)揮重要作用，檢測(cè)此類(lèi)標(biāo)志基因有助于深入了解脂肪細(xì)胞中脂質(zhì)代謝。PPARγ是脂肪沉積關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，其表達(dá)被抑制后導(dǎo)致脂質(zhì)分解，脂肪酸合成減少[31]。研究表明，PPARγ與視黃醛X受體結(jié)合形成異源二聚體，并與其他核受體共同作用進(jìn)而調(diào)控下游靶基因脂肪酸結(jié)合蛋白4(fatty acid binding protein 4，F(xiàn)ABP4)和脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase，LPL)表達(dá)，最終導(dǎo)致脂肪沉積[32]；Glut4主要分布于脂肪、骨骼肌和心肌組織細(xì)胞內(nèi)，是哺乳動(dòng)物最主要的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體，在小鼠脂肪和肌肉組織中表達(dá)量較低[33-34]；ELOVL6在白色脂肪和小腸中表達(dá)量較高[35]，可影響單不飽和脂肪酸的延長(zhǎng)，生成油脂[36]。據(jù)報(bào)道，KLF7基因可負(fù)向調(diào)控脂肪細(xì)胞分化，并結(jié)合其靶基因PPARγ的啟動(dòng)子，抑制PPARγ基因啟動(dòng)子活性，最終抑制一些脂質(zhì)生成關(guān)鍵基因如Glut2、Glut4和脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，F(xiàn)ASN)等表達(dá)，從而負(fù)向調(diào)控脂肪細(xì)胞分化[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，藏綿羊前脂肪細(xì)胞過(guò)表達(dá)KLF7基因后PPARγ、Glut4和ELOVL6基因表達(dá)量顯著降低。Kawamura等[10]及Zhang等[24]報(bào)道，過(guò)表達(dá)KLF7基因可抑制人及雞前脂肪細(xì)胞分化；Sun等[37]研究證實(shí)，KLF7基因可調(diào)控GATA3基因轉(zhuǎn)錄，抑制雞脂肪細(xì)胞分化；金釗等[38]研究表明，KLF7基因可調(diào)控低氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而抑制脂肪組織發(fā)育；但Li等[28]研究表明，KLF7基因敲低則抑制山羊肌內(nèi)脂肪及皮下脂肪細(xì)胞分化，與本研究結(jié)果不同，推測(cè)可能是細(xì)胞類(lèi)型不同或細(xì)胞在體內(nèi)具有復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制導(dǎo)致，具體原因仍需進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

KLF7基因在藏綿羊大腦、皮下脂肪、腎臟、背最長(zhǎng)肌、瘤胃、睪丸和回腸中廣泛表達(dá)，且大腦、皮下脂肪及腎臟中表達(dá)量較高；誘導(dǎo)分化后的脂肪細(xì)胞表達(dá)量顯著高于分化前，且分化第2天表達(dá)量最高；KLF7基因參與藏綿羊脂肪細(xì)胞增殖分化過(guò)程，其過(guò)表達(dá)可抑制前脂肪細(xì)胞的增殖及分化。研究結(jié)果為進(jìn)一步探究藏綿羊脂肪沉積的分子調(diào)控機(jī)制提供參考。