馬建青，楊清芳，宋占鋒，賈丁丁，吳東蔚，莫秀芳，徐增年，楊 克，吳占勇，籍 穎，周榮艷

(1.華北醫(yī)療健康集團(tuán)邢臺(tái)總醫(yī)院骨科實(shí)驗(yàn)室，邢臺(tái) 054000；2.邢臺(tái)市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，邢臺(tái) 054001；3.華北理工大學(xué)護(hù)理與康復(fù)學(xué)院，唐山 063210；4.河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部，石家莊 050017；5.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，保定 071001)

目前已明確維生素D(vitamin D,VD)在機(jī)體內(nèi)主要是由VD受體(VD receptor,VDR)介導(dǎo)而發(fā)揮其生理學(xué)效應(yīng)。VD化學(xué)本質(zhì)為環(huán)戊烷多氫菲類化合物，在名義上雖屬于脂溶性維生素的家族成員之一，但其本質(zhì)為類固醇一種激素前體，真正發(fā)揮生物學(xué)功能的活性形式為1,25(OH)2D3[1]。VDR作為一種重要的核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，在靶細(xì)胞內(nèi)與VD形成激素-受體復(fù)合物作用于靶基因的特定DNA序列上發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[2]。最為經(jīng)典和被廣泛研究的是其參與機(jī)體鈣磷平衡的調(diào)節(jié)機(jī)制，如對(duì)腸道、骨骼、腎臟及甲狀旁腺等組織的調(diào)節(jié)作用，維持骨組織礦物質(zhì)平衡[3]。眾所周知，骨礦鹽代謝失衡可引發(fā)骨質(zhì)疏松癥、骨關(guān)節(jié)炎、椎間盤退變、骨軟化癥及肌肉減少癥等多種骨代謝相關(guān)疾病。目前，VDR在動(dòng)物醫(yī)學(xué)及動(dòng)物遺傳學(xué)領(lǐng)域的研究較多，如Santillán等[4]發(fā)現(xiàn)小雞骨骼肌細(xì)胞中1,25(OH)2D3可以促進(jìn)鈣離子內(nèi)流；余曉丹等[5]發(fā)現(xiàn)大鼠體內(nèi)鋅缺乏可直接改變VDR的活性并影響VDR基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平，從而影響鈣結(jié)合蛋白基因轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而影響鈣吸收，最終導(dǎo)致骨生成障礙；趙家榮等[6]成功建立了VDR基因敲除小鼠品系；Plum等[7]通過(guò)低鈣喂食方法構(gòu)建了VD缺乏大鼠模型，利用切除卵巢(OVX)的基本無(wú)骨吸收能力大鼠模型研發(fā)出一種新型具有強(qiáng)化骨合成代謝活性的1,25(OH)2D3類似藥物，為治療骨質(zhì)疏松等代謝性骨病提供了新的方法；Miao等[8]綜述了利用純合子轉(zhuǎn)基因(VDR-/-)小鼠和(1α(OH) ase-/-)小鼠模型研究鈣的腸吸收、骨化三醇的腎磷酸鹽代謝、骨化三醇與骨穩(wěn)態(tài)及骨礦鹽體內(nèi)代謝等生理機(jī)制，較為全面地探討了VD活性代謝物骨化三醇的作用范圍、作用機(jī)制和VD/VDR信號(hào)途徑的調(diào)控機(jī)理。

目前，對(duì)VD/VDR分子途徑導(dǎo)致骨代謝相關(guān)疾病機(jī)制研究多集中在嚙齒類、雞等小動(dòng)物模型上[8-9]，而在密碼子水平對(duì)綿羊等實(shí)驗(yàn)大動(dòng)物VDR基因的研究報(bào)道相對(duì)較少。綿羊作為一種體型與骨骼較大的哺乳動(dòng)物，性情溫順，對(duì)飼養(yǎng)環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)，有著與人類較為接近的脊柱形態(tài)和結(jié)構(gòu)。相對(duì)于小動(dòng)物，用綿羊做骨代謝疾病建模更易于手術(shù)操作和觀察[10]。本研究通過(guò)對(duì)綿羊和其他14個(gè)物種VDR基因密碼子偏好性及其影響因素進(jìn)行分析，以期為預(yù)測(cè)VDR基因潛在功能、表達(dá)水平和基因的異源表達(dá)提供重要的理論依據(jù)，同時(shí)為研究VDR基因進(jìn)化規(guī)律及其在轉(zhuǎn)錄、翻譯過(guò)程中的調(diào)控機(jī)制提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 VDR基因序列來(lái)源

通過(guò)檢索GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)，目前已有880個(gè)關(guān)于VDR基因CDS區(qū)核苷酸序列物種分類單元。本研究選取了脊索動(dòng)物門中綿羊、大猩猩、鴯鹋和褐家鼠等來(lái)自偶蹄目、靈長(zhǎng)目、鳥類和嚙齒目的15個(gè)物種VDR基因CDS序列(表1)。

表1 VDR基因CDS序列信息

1.2 方法

1.2.1 同義密碼子相對(duì)使用度計(jì)算 同義密碼子相對(duì)使用度(relative synonymous codon usage,RSCU)通常用來(lái)衡量某一種特定密碼子在編碼對(duì)應(yīng)氨基酸的同義密碼子間使用的相對(duì)概率。RSCU臨界值為1，RSCU值>1，有較高使用度；RSCU值=1，未表現(xiàn)出偏好性；RSCU值<1，使用頻率較低。該項(xiàng)參數(shù)利用CodonW軟件計(jì)算獲得。

1.2.2 密碼子堿基含量、用法分值、用法頻率、有效密碼子數(shù)、最佳密碼子使用頻率和密碼子偏好指數(shù)計(jì)算 GC含量(GC、GC3s)、密碼子第3位上A/T堿基含量(A3s、T3s)和密碼子第1、2位上GC含量及其平均值(GC1、GC2、GC12)的計(jì)算均通過(guò)CodonW軟件和EMBOSS工具中CUSP(http:∥emboss.bioinformatics.Nl/cgi-bin/emboss/cusp)獲取，其中GC含量和GC3s值是對(duì)密碼子在堿基使用上表現(xiàn)出偏倚性的重要反映參數(shù)，若它們同時(shí)>0.5，則表示該基因傾向于使用G、C的程度高。在多肽鏈翻譯過(guò)程中，參與編碼某一氨基酸的各密碼子所占比例之和為1，通常以用法分值(Fraction)表示某一密碼子在編碼時(shí)所占比例，用法頻率(Frequency)值表示某一種密碼子在編碼基因所有密碼子數(shù)中出現(xiàn)的頻率值，即在1 000個(gè)密碼子中出現(xiàn)的次數(shù)。ENc值即有效密碼子數(shù)(effective number of codons)，能反映出在某個(gè)基因中全部用到的密碼子種類，取值范圍為20

1.2.3 ENc-Plot關(guān)聯(lián)分析 以GC3s值為橫軸、ENc值為縱軸繪制散點(diǎn)圖。如果不同物種的基因參數(shù)點(diǎn)位于標(biāo)準(zhǔn)曲線上或附近，則提示基因突變?yōu)槊艽a子偏好性的主要影響因素；若各基因參數(shù)點(diǎn)落在曲線下方或更遠(yuǎn)處，提示自然選擇壓力對(duì)密碼子偏好性作用更為凸顯[15]。

1.2.4 中性繪圖分析 以GC1和GC2的平均值GC12為橫軸、GC3s值為縱軸繪制散點(diǎn)圖。若顯示各基因參數(shù)點(diǎn)的斜率趨近于1，說(shuō)明突變?yōu)橛绊懨艽a子偏好性使用的主要原因；若斜率向0趨近，則提示自然選擇為其主要影響因素[11,16]。

1.2.5VDR基因的聚類分析 利用DNAMAN 8.0軟件對(duì)15個(gè)物種VDR基因CDS序列(FASTA格式)進(jìn)行多重序列比對(duì)，刪除各物種間多余不齊的核苷酸種類，序列同一性達(dá)90.09%；利用鄰接距離矩陣法進(jìn)行聚類分析，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 綿羊VDR基因CDS區(qū)密碼子偏好性分析

由表2可知，所有密碼子中有25個(gè)密碼子RSCU值均>1，除參與編碼脯氨酸(Pro)的CCA和終止密碼子TGA外，其他23個(gè)密碼子均是以G、C為第3位堿基，且這些密碼子所對(duì)應(yīng)Fraction和Frequency值相對(duì)偏高，在編碼對(duì)應(yīng)氨基酸時(shí)個(gè)數(shù)也最多；有2個(gè)密碼子RSCU值=1，分別是編碼蛋氨酸/甲硫氨酸(Met)的ATG和編碼色氨酸(Trp)的TGG，提示無(wú)使用偏好；對(duì)RSCU值<1的密碼子進(jìn)行分析，37個(gè)密碼子大多以A、T結(jié)尾，它們的Fraction和Frequency值也偏小。

表2 綿羊VDR基因CDS區(qū)密碼子偏好性分析

續(xù)表

2.2 綿羊和其他物種VDR基因CDS區(qū)各密碼子偏好指標(biāo)分析

綿羊VDR基因ENc值為38.84(>35)，GC和GC3s值同時(shí)>0.5，A3s和T3s的數(shù)值明顯小于GC3s值，F(xiàn)op值>0.5且CBI值>0；綜合分析各物種的ENc值取值范圍在32.72～44.77之間，平均值為39.13，GC、GC3s、GC1、GC2、GC12、A3s、T3s、Fop和CBI值等各項(xiàng)數(shù)據(jù)在各物種間比較整齊，相互之間相差不大，表現(xiàn)出和綿羊VDR基因密碼子使用的相似特征(表3)。

表3 不同物種VDR基因的密碼子偏好性參數(shù)

2.3 不同物種VDR基因RSCU數(shù)據(jù)分析

所研究的15個(gè)物種VDR基因中，RSCU值均>1的密碼子有21個(gè)(以密碼子名稱下方標(biāo)記“XXX”)，這些密碼子(除終止密碼子TGA外)均是以C/G為第3位堿基，分布于除半胱氨酸、組氨酸、蛋氨酸/甲硫氨酸和色氨酸以外的16種氨基酸中，為共同偏好使用的密碼子；同時(shí)發(fā)現(xiàn)24個(gè)密碼子(以密碼子名稱下方標(biāo)記“XXX”)的RSCU值均<1，它們的第3位堿基基本為A/T，提示它們的使用頻率相對(duì)較低。由于蛋氨酸/甲硫氨酸和色氨酸僅由1個(gè)密碼子編碼，因此不表現(xiàn)出任何偏好性。比較特別的現(xiàn)象是TGC(編碼半胱氨酸(Cys))在褐家鼠中沒(méi)有使用偏好性，而在其他物種中均具有較高使用度；GGG(編碼甘氨酸(Gly))是除鴯鹋、褐家鼠、小鼠和原雞外其他物種共同偏好性使用密碼子；CAC(編碼組氨酸(His))是除鴯鹋外其他物種的偏好性使用密碼子；CCG(編碼脯氨酸(Pro))和TCG(編碼絲氨酸(Ser))為鴯鹋和(或)麻雀VDR基因偏好性使用；CCA(編碼脯氨酸(Pro))僅為綿羊和山羊VDR基因偏好性使用(表4)。

表4 不同物種VDR基因的RSCU值

續(xù)表

續(xù)表

2.4 ENc-Plot關(guān)聯(lián)分析結(jié)果

基于表3中GC3s和ENc值(GC3s值為橫坐標(biāo)、ENc值為縱坐標(biāo))繪制ENc-Plot關(guān)聯(lián)分析坐標(biāo)圖(圖1)，發(fā)現(xiàn)散點(diǎn)均落在遠(yuǎn)離標(biāo)準(zhǔn)曲線略下方，提示自然選擇壓力可能是導(dǎo)致不同物種VDR基因密碼子偏好性使用的主要影響因素。

圖1 ENC-Plot關(guān)聯(lián)分析曲線Fig.1 ENc-Plot correlational analytic curve

2.5 中性繪圖分析

GC3的變化和GC12的增長(zhǎng)不存在正相關(guān)性(斜率為-0.0031，R2=0.0004)，同ENc-Plot關(guān)聯(lián)分析圖對(duì)比顯示，與突變壓力相比，選擇壓力為不同物種VDR基因密碼子使用偏好性的主要力量(圖2)。

圖2 中性繪圖分析曲線Fig.2 Neutrality plot analytic curve

2.6 聚類分析

通過(guò)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖3)并基于2.5中RSCU數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，綿羊和山羊來(lái)源于同一支，總變異值較為接近，二者的RSCU值也趨于一致；人和黑猩猩雖起源于同一進(jìn)化分支，RSCU值基本接近，但是大猩猩對(duì)GGG密碼子有著較高偏好性，人與之相反；小鼠和褐家鼠的總變異值僅相差0.003，但是二者對(duì)TGC密碼子的使用偏好性也完全相反；大猩猩和黑猩猩雖不在同一分支，但它們的總變異值相同，在RSCU值上也趨于一致；羊駝和野豬的總變異值相同，RSCU值利用性相一致，但是羊駝和牛、山羊、綿羊的進(jìn)化比野豬更為接近；鴯鹋雖和原雞進(jìn)化上很接近，但是在編碼組氨酸和絲氨酸時(shí)對(duì)CAC、TGG的利用表現(xiàn)出獨(dú)有的非偏好性特點(diǎn)；麻雀單獨(dú)分支，總變異值也最大，對(duì)CCG密碼子的使用也與其他物種差異較大。

每條進(jìn)化分支末尾的數(shù)值為物種的總變異值The end of the value is the total variation of the species圖3 各物種VDR基因CDS區(qū)的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of VDR gene CDS in different species

3 討 論

蛋白質(zhì)編碼是一個(gè)較為復(fù)雜的過(guò)程，某一物種或某種基因在編碼時(shí)通常對(duì)一種或多種特定的密碼子有偏好使用的特點(diǎn)，這種生物學(xué)特征即同義密碼子的使用偏好性[17-18]。針對(duì)某種功能基因做密碼子偏好性研究對(duì)于基因表達(dá)具有重要意義，但是密碼子偏好程度會(huì)受到基因自身堿基組成結(jié)構(gòu)、染色體中基因位點(diǎn)、基因長(zhǎng)度、翻譯起始效應(yīng)及種屬差異等諸多因素干擾[11,19-25]。

隨著對(duì)VDR基因功能研究的深入，其在機(jī)體胃腸道保護(hù)、發(fā)揮抗炎癥效用、維持正常的胰島素分泌和糖耐量等多種疾病中的生理機(jī)制逐漸被報(bào)道[26-27]。郭勛等[28]通過(guò)在飼料中添加不同濃度的VD3發(fā)現(xiàn)，VD3/VDR對(duì)幼魚生長(zhǎng)及病原體識(shí)別分子Toll樣受體具有重要的調(diào)控作用，而VD/VDR在機(jī)體中參與鈣磷代謝、維持骨礦物質(zhì)穩(wěn)態(tài)是其最經(jīng)典的生物學(xué)作用。本研究發(fā)現(xiàn)，綿羊VDR基因的使用偏好密碼子多以G/C為結(jié)尾，23個(gè)密碼子包括GCC、TGC、GAC、GAG、TTC、GGG、GGC、CAC、ATC、AAG、CTG、CTC、AAC、CCC、CAG、CGG、CGC、AGC、TCC、ACC、GTG、GTC及TAC，這些密碼子的Fraction和Frequency值相對(duì)較高，初步判斷它們?yōu)槠眯允褂妹艽a子；而參與編碼脯氨酸的CCA和終止密碼子TGA的RSCU值雖>1，但在編碼脯氨酸的4個(gè)密碼子中，密碼子CCC對(duì)應(yīng)的RSCU值更大(1.82)，因此在參與編碼時(shí)更具優(yōu)勢(shì)。這種特點(diǎn)在分析山羊VDR基因密碼子時(shí)同樣存在，而在其他物種中無(wú)類似表現(xiàn)，推斷可能與VDR基因表達(dá)與偶蹄目羊亞科物種特異性有關(guān)。對(duì)終止密碼子TGA偏好使用的現(xiàn)象不僅表現(xiàn)在綿羊VDR基因中，在其他物種中其RSCU值(3.00)均>1。針對(duì)TGA出現(xiàn)幾率偏高的現(xiàn)象，Sun等[29]曾報(bào)道該現(xiàn)象在較為復(fù)雜的真核生物中尤其在脊椎動(dòng)物體內(nèi)表現(xiàn)更為突出。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果較一致。進(jìn)一步對(duì)密碼子偏好指標(biāo)等各項(xiàng)參數(shù)計(jì)算發(fā)現(xiàn)，綿羊VDR基因密碼子使用偏好整體程度偏低，GC含量大于AT含量，對(duì)以G/C結(jié)尾的密碼子使用偏好程度更強(qiáng)。通過(guò)對(duì)各物種VDR基因密碼子偏好性參數(shù)綜合分析，綿羊及其他物種的使用偏好性整體上具有一致性，同時(shí)表現(xiàn)出了對(duì)以G/C為第3位堿基的密碼子更為偏好性使用的現(xiàn)象。為進(jìn)一步明確造成該現(xiàn)象的原因，試驗(yàn)進(jìn)行了ENc-Plot關(guān)聯(lián)分析和中性繪圖分析，結(jié)果表明，自然選擇壓力可能是導(dǎo)致綿羊等不同物種VDR基因密碼子偏好性使用的主要影響因素，提示VDR基因多態(tài)性的發(fā)生可能與之有關(guān)[30]，繼而為后期骨代謝疾病模型VDR基因表達(dá)水平研究提供了線索。

生物進(jìn)化是物種最本質(zhì)的特征之一，在進(jìn)化過(guò)程中，物種對(duì)密碼子的使用模式是其進(jìn)化的重要證據(jù)體現(xiàn)。通過(guò)對(duì)綿羊及其他各物種VDR基因RSCU數(shù)據(jù)綜合分析結(jié)合物種系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)發(fā)現(xiàn)，物種間總變異值相同或相近且匯聚于同一進(jìn)化樹(shù)分支時(shí)，其密碼子使用偏好性基本一致，但是在個(gè)別密碼子使用時(shí)仍存在差異；而物種間總變異值雖相近或相同，其RSCU值也相類似，但有可能分屬不同的進(jìn)化分支；總變異值同其他物種差距較大的麻雀在系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)上獨(dú)自分支，它在密碼子偏好性使用上也顯現(xiàn)出獨(dú)有的特點(diǎn)。由此提示，物種間種屬差異會(huì)對(duì)密碼子偏好性使用產(chǎn)生一定程度的影響，同時(shí)由于基因結(jié)構(gòu)、長(zhǎng)度及堿基組成等因素，對(duì)密碼子偏好性使用的作用也需加以關(guān)注，在動(dòng)物骨代謝疾病遺傳學(xué)領(lǐng)域未來(lái)發(fā)展中應(yīng)重要關(guān)注此方面研究，從而為生物進(jìn)化、生物多樣性及揭示相關(guān)疾病在不同動(dòng)物中的發(fā)病特點(diǎn)提供新的研究方向。

VD/VDR信號(hào)通路在調(diào)控機(jī)體鈣磷代謝和骨礦鹽平衡中發(fā)揮著極為重要的生理作用，多種疾病的發(fā)生與之密切相關(guān)。目前對(duì)綿羊等體型較大實(shí)驗(yàn)動(dòng)物VDR基因密碼子偏好性分析鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)分析綿羊VDR基因CDS區(qū)密碼子偏好性使用并與其他多個(gè)物種相比較，結(jié)果為人們利用綿羊這種大動(dòng)物模型研究骨質(zhì)疏松、軟骨病等骨代謝相關(guān)疾病提供參考，具有一定的理論和現(xiàn)實(shí)意義。

4 結(jié) 論

通過(guò)對(duì)綿羊及來(lái)自偶蹄目、靈長(zhǎng)目、鳥類和嚙齒目的15個(gè)物種VDR基因密碼子偏好性使用進(jìn)行比較分析，以G/C結(jié)尾的密碼子為VDR基因優(yōu)勢(shì)密碼子，導(dǎo)致密碼子偏好性使用的主要因素為自然選擇作用，多物種RSCU數(shù)據(jù)分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示出密碼子偏好性使用存在物種特異性，并與物種親緣關(guān)系進(jìn)化具有關(guān)聯(lián)性。