聶靖茹，馬 黎，嚴(yán)達(dá)偉，鄧 俊，張 浩，張 博，劉金橋，董新星

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明 650201；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 100193；3.云南農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院畜牧獸醫(yī)學(xué)院，昆明 650212；4.云南省畜牧總站，昆明 650224)

肌內(nèi)脂肪(intramuscular fat,IMF)含量是肉質(zhì)評(píng)定的首選指標(biāo)，影響豬肉的風(fēng)味、嫩度和多汁性[1]，篩選調(diào)控豬肌內(nèi)脂肪沉積的功能基因并解析其調(diào)控機(jī)制，對(duì)豬肉品質(zhì)的遺傳改良具有重要意義。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，一些影響豬脂肪沉積的功能基因和轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子被發(fā)現(xiàn)。李明洲等[2]研究發(fā)現(xiàn)，太湖豬在不同月齡脂肪細(xì)胞體積、肌內(nèi)脂肪含量均高于長(zhǎng)白豬，且在3月齡后差距逐漸明顯；Wood等[3]研究發(fā)現(xiàn)，維生素D受體(vitamin D receptor,VDR)通過(guò)抑制CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α(CCAAT/enhancer binding proteins alpha，C/EBPα)和過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferators-activated receptor gamma,PPARγ)抑制脂肪生成；Tang等[4]研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子Sp1基因是前脂肪細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化所必需的關(guān)鍵基因；Huang等[5]研究發(fā)現(xiàn)，XLOC_046142、XLOC_004398和XLOC_015408可能分別以絲裂原激活蛋白激酶激活蛋白激酶2(MAPK-activated protein kinase 2,MAPK-APK2)、核受體亞家族1D組成員2(nuclear receptor subfamily 1 group D member 2,NR1D2)和醛酮還原酶家族1成員C4(aldo-keto reductase family 1 member C4,AKR1C4)為靶點(diǎn)，在豬肌內(nèi)脂肪生成和脂質(zhì)積累中起重要調(diào)節(jié)作用；Xing等[6]研究發(fā)現(xiàn)了脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2(lipocalin 2,LCN2)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶1(phosphoenolpyruvate carboxykinase 1,PCK1)、過(guò)氧化物酶體增殖激活受體γ輔激活因子1β(peroxisome proliferative activated receptor,gamma,coactivator 1 beta,PPARGC1B)、腺苷一磷酸脫氨酶1(adenosine monophosphate deaminase 1,AMPD1)和線粒體肌酸激酶2(creatine kinase,mitochondrial 2,CKMT2)5個(gè)影響脂肪沉積的候選基因；Ana等[7]研究發(fā)現(xiàn)，Retinto伊比利亞豬脂肪酸結(jié)合蛋白3(fatty acid binding protein 3, FABP3)、FABP5、長(zhǎng)鏈脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(solute carrier family 27 member 1,SLC27A1)等基因上調(diào)能夠加速脂肪沉積，Torbiscal伊比利亞豬脂聯(lián)素(adiponectin,C1Q and collagen domain containing,ADIPOQ)和肉毒堿棕櫚酰基轉(zhuǎn)移酶1A(carnitine palmitoyltransferase 1A,CPT1A)基因上調(diào)會(huì)抑制脂肪沉積。迪慶藏豬是中國(guó)特有的高原型豬種之一，具有沉脂能力強(qiáng)、肉質(zhì)好等特點(diǎn)[8]，目前關(guān)于迪慶藏豬的研究主要在起源與馴化[9]、遺傳多樣性[10-12]、低氧適應(yīng)[13]、肉質(zhì)[14-16]、雜交利用[17]等方面，迪慶藏豬肌內(nèi)脂肪沉積遺傳調(diào)控機(jī)制尚不明晰。本研究采用RNA-Seq技術(shù)篩選大型迪慶藏豬不同生長(zhǎng)階段肌內(nèi)脂肪沉積差異的關(guān)鍵基因并分析其調(diào)控途徑，以期為大型迪慶藏豬肉品質(zhì)的遺傳改良提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

選擇胎次相同、出生日期及體重相近的純種大型迪慶藏豬36頭，隨機(jī)分為3組，每組12頭，在云南省香格里拉市綠源生態(tài)種養(yǎng)專(zhuān)業(yè)合作社藏豬養(yǎng)殖基地進(jìn)行育肥試驗(yàn)，分別在體重達(dá)40、80、120 kg左右時(shí)屠宰，每組采集3頭豬的背最長(zhǎng)肌(S1-3LD、S2-3LD、S3-3LD)，液氮速凍運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑及儀器

動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄-熒光定量試劑盒均購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。NanoDrop 2000核酸濃度測(cè)定儀購(gòu)自ThermoFisher Scientific公司；熒光定量PCR儀(FQD-96A)購(gòu)自杭州博日科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 RNA提取和質(zhì)量檢測(cè) 參考王志秀[18]采用TRIzol法結(jié)合動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒提取背最長(zhǎng)肌總RNA，去除rRNA。利用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所提取總RNA的質(zhì)量，以確定RNA是否存在降解及污染等情況；利用NanoDrop 2000測(cè)定儀對(duì)總RNA的純度(D260 nm/D280 nm)進(jìn)行測(cè)定，利用Qubit對(duì)總RNA進(jìn)行精確定量，利用Agilent 2100核酸分析儀檢測(cè)RNA的完整性，檢測(cè)合格的總RNA用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

1.3.2 去核糖體鏈特異性文庫(kù)構(gòu)建及測(cè)序 從9個(gè)檢測(cè)合格的樣本RNA中各取3 μg建庫(kù)，對(duì)測(cè)序文庫(kù)進(jìn)行質(zhì)檢，文庫(kù)濃度要求不低于1 ng/μL，電泳觀察構(gòu)建的文庫(kù)條帶大小在350～450 bp；按照cBot User Guide(Part#15006165，Rev.F，Illumina)流程，在Illumina Hiseq 2000測(cè)序儀配套的cBot上完成Cluster的生成和第一向測(cè)序引物雜交；按照Hiseq 2000 User Guide(Part#15011190_H，Illumina)要求備好測(cè)序試劑，將攜有cluster的flow cell上機(jī)，按程序進(jìn)行Paired End 2×100 nt Multiplex測(cè)序，并進(jìn)行數(shù)據(jù)的收集和實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)分析。將mRNA進(jìn)行Oligo(dT)磁珠富集，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA文庫(kù)。使用NlaⅢ內(nèi)切酶產(chǎn)生標(biāo)簽5′-端，該內(nèi)切酶可識(shí)別并切斷cDNA上的CATG位點(diǎn)，利用磁珠純化帶有cDNA 3′-端片段，將其5′-端連接到Illumina接頭1上；Illumina接頭1與CATG位點(diǎn)的結(jié)合處是MmeⅠ內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)，該內(nèi)切酶可將識(shí)別位點(diǎn)與酶切位點(diǎn)分離，酶切位置在CATG位點(diǎn)下游17 bp處，從而產(chǎn)生帶有接頭1的Tag；采用聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行純化，利用Agilent 2100 Bioanalyzer和ABI StepOnePlus Real-time PCR System對(duì)構(gòu)建好的文庫(kù)進(jìn)行質(zhì)檢，質(zhì)檢合格的文庫(kù)用Illumina Hiseq 2000上機(jī)測(cè)序。

1.3.3 測(cè)序數(shù)據(jù)處理及差異表達(dá)基因聚類(lèi)分析 對(duì)測(cè)序獲得的原始數(shù)據(jù)(raw reads)，去除污染和低質(zhì)量片段后獲得過(guò)濾后的有效數(shù)據(jù)(clean reads)，采用HISAT2軟件將clean reads與豬的參考基因組(Susscrofa11.1)進(jìn)行比對(duì)，對(duì)比對(duì)到基因組各染色體上的clean reads進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，以log2|FoldChange|>1且P<0.05作為篩選條件，將片段每百萬(wàn)堿基碎片數(shù)(fragments per kilobase million,FPKM)值歸一化進(jìn)行差異表達(dá)基因分析。將3個(gè)生長(zhǎng)階段分為3個(gè)比較組(S1vsS2：40 kgvs80 kg；S2vsS3：80 kgvs120 kg；S1vsS3：40 kgvs120 kg)，對(duì)每個(gè)比較組的陽(yáng)性共表達(dá)基因聚類(lèi)分析。

1.3.4 差異表達(dá)基因功能富集分析 對(duì)篩選出的差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能和KEGG通路富集分析，篩選與迪慶藏豬脂肪沉積相關(guān)的差異表達(dá)基因，按富集度count≥2且校正P<0.05作為顯著富集基因的閾值。

1.3.5 差異表達(dá)基因STEM分析 采用短時(shí)間序列表達(dá)分析(short time-series expression miner,STEM)對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行趨勢(shì)分析，數(shù)據(jù)過(guò)濾標(biāo)準(zhǔn)為3個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)兩兩比較的組內(nèi)表達(dá)差異倍數(shù)在2倍以上且P<0.05，對(duì)顯著差異表達(dá)的模塊進(jìn)行GO功能和KEGG通路富集分析。

1.3.6 差異表達(dá)基因互作網(wǎng)絡(luò)分析 利用Cytoscape 3.9.1軟件挖掘差異表達(dá)基因間的互作關(guān)系，構(gòu)建差異表達(dá)基因的互作網(wǎng)絡(luò)。

1.3.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物(表1)，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以GAPDH作為內(nèi)參基因，采用ABI HT7900定量PCR儀對(duì)篩選到的差異表達(dá)基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。PCR擴(kuò)增體系20 μL：2×T5 Fast qPCR Mix(SYBR Green Ⅰ) 10 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O 7.4 μL。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性1 min；95 ℃變性15 s，退火15 s(退火溫度見(jiàn)表1)，72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后開(kāi)始熔解曲線分析：95 ℃ 5 s，60 ℃ 1 min，溫度以0.11 ℃/s的速率從60 ℃遞增到95 ℃。每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)重復(fù)，根據(jù)2-ΔΔCt值計(jì)算定量結(jié)果。

表1 引物信息

2 結(jié) 果

2.1 大型迪慶藏豬背最長(zhǎng)肌RNA提取質(zhì)量及測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA質(zhì)量，樣品總RNA的28S和18S條帶清晰，28S的亮度約為18S的2倍，質(zhì)量達(dá)到RNA-Seq上機(jī)測(cè)序的要求。由表2可知，每個(gè)樣品的raw reads數(shù)都在48 Mb以上，clean reads比例均超過(guò)88%，有效Q30比例均在94%以上，比對(duì)率均在95%以上，測(cè)序數(shù)據(jù)符合生物信息學(xué)分析要求。

表2 RNA-Seq測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

2.2 大型迪慶藏豬背最長(zhǎng)肌差異表達(dá)基因聚類(lèi)分析

對(duì)3個(gè)比較組的陽(yáng)性共表達(dá)基因進(jìn)行聚類(lèi)發(fā)現(xiàn)，每個(gè)組內(nèi)部聚為一類(lèi)，組間明顯分開(kāi)(圖1)，可進(jìn)行后續(xù)分析。

A，S1 vs S2；B，S2 vs S3；C，S1 vs S3。圖2同A，S1 vs S2；B，S2 vs S3；C，S1 vs S3.The same as fig.2圖1 大型迪慶藏豬背最長(zhǎng)肌差異表達(dá)基因聚類(lèi)熱圖Fig.1 Clustering heat map of differentially expressed genes in longissimus dorsi muscle of large Diqing Tibetan pigs

2.3 不同體重階段大型迪慶藏豬背最長(zhǎng)肌顯著差異基因篩選

以log2|FoldChange|>1且P<0.05為篩選顯著差異基因的閾值，S1vsS2階段共篩選到730 個(gè)基因顯著差異表達(dá)，其中，上調(diào)基因341個(gè)，下調(diào)基因389個(gè)(圖2A)；S2vsS3階段共篩選到981個(gè)基因顯著差異表達(dá)，其中，530個(gè)基因上調(diào)，451個(gè)基因下調(diào)(圖2B)；S1vsS3階段共篩選到735個(gè)基因顯著差異表達(dá)，其中，364個(gè)基因上調(diào)，371個(gè)基因下調(diào)(圖2C)。

2.4 不同體重階段大型迪慶藏豬背最長(zhǎng)肌顯著差異表達(dá)基因功能富集分析

S1vsS2階段，GO功能分析結(jié)果顯示，差異表達(dá)基因主要富集在凋亡過(guò)程調(diào)控、胰島素應(yīng)答、脂肪細(xì)胞分化等過(guò)程(圖3A)；KEGG通路分析結(jié)果顯示，差異表達(dá)基因主要富集在FOXO信號(hào)通路、脂肪細(xì)胞因子信號(hào)通路、胰島素抵抗等通路(圖3B)。S2vsS3階段，GO功能分析結(jié)果顯示，差異表達(dá)基因主要富集在葡萄糖穩(wěn)態(tài)、脂肪墊發(fā)育、脂肪酸氧化正調(diào)控等過(guò)程(圖3C)；KEGG通路分析結(jié)果顯示，差異表達(dá)基因主要富集在胰島素信號(hào)通路、PPAR信號(hào)通路、脂肪細(xì)胞因子信號(hào)通路等(圖3D)。S1vsS3階段，GO功能富集分析顯示，差異表達(dá)基因主要富集在葡萄糖應(yīng)答、脂肪細(xì)胞分化、能量穩(wěn)態(tài)等過(guò)程(圖3E)；KEGG通路富集分析顯示，差異表達(dá)基因主要富集在胰島素信號(hào)通路、胰島素抵抗信號(hào)通路等(圖3F)。

圖2 大型迪慶藏豬背最長(zhǎng)肌差異表達(dá)基因火山圖Fig.2 Volcanic map of differentially expressed genes in longissimus dorsi muscle of large Diqing Tibetan pigs

A、C、E，S1 vs S2、S2 vs S3和S1 vs S3 GO功能富集圖；B、D、F，S1 vs S2、S2 vs S3和S1 vs S3 KEGG通路富集圖A，C and E，GO function enrichment histograms of S1 vs S2，S2 vs S3 and S1 vs S3，respectively；B，D and F，KEGG pathway enrichment histograms of S1 vs S2，S2 vs S3 and S1 vs S3，respectively圖3 大型迪慶藏豬背最長(zhǎng)肌差異表達(dá)基因GO功能和KEGG通路富集分析圖Fig.3 GO function and KEGG pathway enrichment histograms of differentially expressed genes in longissimus dorsi muscle of large Diqing Tibetan pigs

2.5 大型迪慶藏豬背最長(zhǎng)肌差異表達(dá)基因STEM分析

對(duì)篩選到的顯著差異表達(dá)基因進(jìn)行STEM分析，共有4個(gè)差異顯著模塊(圖4)，模塊11和14的差異表達(dá)基因聚為一類(lèi)，先表達(dá)上調(diào)后呈現(xiàn)輕微表達(dá)下調(diào)；模塊9和10的差異表達(dá)基因聚為一類(lèi)，先表達(dá)上調(diào)后表達(dá)下調(diào)；其余模塊差異不顯著。模塊11和14的基因集GO功能分析顯示，差異表達(dá)基因主要富集到BMP信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控、JUN激酶活性激活等過(guò)程(圖5A)，KEGG通路分析顯示，差異表達(dá)基因主要富集到PI3K-Akt信號(hào)通路、ECM受體相互作用等通路(圖5B)；模塊9和10基因集GO功能主要富集到細(xì)胞對(duì)脂多糖反應(yīng)、T細(xì)胞凋亡過(guò)程的正調(diào)控(圖5C)，KEGG通路主要富集到Ⅱ型糖尿病、T細(xì)胞受體信號(hào)通路等通路(圖5D)。

顏色背景表示趨勢(shì)顯著(P<0.05)，相同顏色表示模塊內(nèi)所包含的基因表達(dá)趨勢(shì)相似；白色背景模塊表示趨勢(shì)不顯著(P>0.05)The trend of color background is significant (P<0.05)，the same color indicates that the gene expression trend contained in the module is similar;The trend of white background module is not significant (P>0.05)圖4 大型迪慶藏豬背最長(zhǎng)肌STEM分析Fig.4 STEM analysis of longissimus dorsi muscle in large Diqing Tibetan pigs

A、B，模塊11、14的GO功能和KEGG通路富集圖；C、D，模塊9及10的GO功能和KEGG通路富集圖A and B，GO function and KEGG pathway enrichment histograms of module 11 and 14，respectively；C and D，GO function and KEGG pathway enrichment histograms of module 9 and 10，respectively圖5 大型迪慶藏豬背最長(zhǎng)肌差異表達(dá)基因顯著富集模塊GO功能和KEGG通路富集分析圖Fig.5 GO function and KEGG pathway enrichment histograms of differentially expressed genes of significant enrichment modules in longissimus dorsi muscle of large Diqing Tibetan pigs

2.6 不同體重階段大型迪慶藏豬背最長(zhǎng)肌差異表達(dá)基因互作網(wǎng)絡(luò)

2.6.1 S1vsS2 選擇S1vsS2階段顯著富集通路中的基因繪制網(wǎng)絡(luò)圖，結(jié)果見(jiàn)圖6。由圖6可知，轉(zhuǎn)錄激活因子3(activating transcription factor 3,ATF3)、核受體亞家族4A組成員3(nuclear receptor subfamily 4 group A member 3,NR4A3/NOR-1)、AMP激活蛋白激酶γ2調(diào)節(jié)亞單位(protein kinase AMP-activated non-catalytic subunit gamma 2,PRKAG2)、早期生長(zhǎng)應(yīng)答因子1(early growth response 1,EGR1)、早期生長(zhǎng)應(yīng)答因子2(early growth response 2,EGR2)基因位于網(wǎng)絡(luò)核心，其中ATF3、NOR-1、PRKAG2基因表達(dá)上調(diào)，ATF3基因與脂聯(lián)素表達(dá)有關(guān)，NOR-1和PRKAG2基因會(huì)影響胰島素敏感性；EGR1、EGR2基因表達(dá)下調(diào)，這2個(gè)基因與脂質(zhì)代謝、脂肪生成有關(guān)。

圖6 S1 vs S2階段差異表達(dá)基因互作網(wǎng)絡(luò)Fig.6 Interaction network diagram of differentially expressed genes at S1 vs S2 stage

2.6.2 S2vsS3 選擇S2vsS3階段顯著富集通路中的基因繪制網(wǎng)絡(luò)圖，結(jié)果見(jiàn)圖7。由圖7可知，過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體δ(peroxisome proliferator activated receptor delta,PPARD)、丙酮酸脫氫酶激酶(pyruvate dehydrogenase kinase 4,PDK4)、叉頭盒O1(forkhead box O1,FOXO1)、過(guò)氧化物酶體增殖激活受體γ輔激活因子1α(peroxisome proliferative activated receptor,gamma,coactivator 1 alpha,PPARGC1A/PPARGC-1)、ATF3、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子1(signal transducer and activator of transcription 1,STAT1)、脂肪酶E(lipase E,LIPE)基因位于網(wǎng)絡(luò)中心，其中，LIPE、ATF3基因表達(dá)上調(diào)，LIPE基因參與抗脂分解、脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)等過(guò)程，ATF3基因可調(diào)控脂聯(lián)素表達(dá)；PPARD、PDK4、FOXO1、PPARGC-1、STAT1基因表達(dá)下調(diào)，PPARD基因在脂肪代謝中發(fā)揮作用，PDK4和FOXO1基因可相互作用影響葡萄糖攝取及游離脂肪酸含量，PPARGC-1基因在脂肪儲(chǔ)存中起調(diào)控作用，STAT1基因可在脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中起作用。

2.6.3 S1vsS3 選擇S1vsS3階段顯著富集通路中的基因繪制基因網(wǎng)絡(luò)圖，結(jié)果見(jiàn)圖8。由圖8可知，ATF3、NOR-1、EGR1、EGR2、STAT1基因位于網(wǎng)絡(luò)中心，其中，ATF3、NOR-1基因表達(dá)上調(diào)，ATF3基因可調(diào)控脂聯(lián)素表達(dá)，NOR-1基因影響胰島素敏感性；EGR1、EGR2、STAT1基因表達(dá)下調(diào)，EGR1、EGR2基因影響脂質(zhì)代謝，STAT1基因與脂肪細(xì)胞分化有關(guān)。

圖7 S2 vs S3階段差異表達(dá)基因互作網(wǎng)絡(luò)Fig.7 Interaction network diagram of differentially expressed genes at S2 vs S3 stage

圖8 S1 vs S3階段差異表達(dá)基因互作網(wǎng)絡(luò)Fig.8 Interaction network diagram of differentially expressed genes at S1 vs S3 stage

2.7 大型迪慶藏豬背最長(zhǎng)肌脂肪沉積差異表達(dá)基因?qū)崟r(shí)熒光定量驗(yàn)證

隨機(jī)挑選了EGR1、FOXO1等10個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證，EGR1、FOXO1、PDK4、PPARD、PPARGC-1、STAT1基因表達(dá)下調(diào)，ATF3、LIPE、NOR-1、PRKAG2基因表達(dá)上調(diào)，與RNA-Seq結(jié)果一致(圖9)。

圖9 大型迪慶藏豬背最長(zhǎng)肌差異表達(dá)基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證結(jié)果Fig.9 Real-time quantitative PCR verification results of differentially expressed genes in longissimus dorsi muscle of large Diqing Tibetan pigs

3 討 論

3.1 大型迪慶藏豬S1 vs S2背最長(zhǎng)肌脂肪沉積差異表達(dá)基因

大型迪慶藏豬40 kgvs80 kg階段，ATF3、NOR-1、PRKAG2基因表達(dá)上調(diào)，EGR1、EGR2基因表達(dá)下調(diào)。ATF3、NOR-1和PRKAG2基因均在胰島素抵抗信號(hào)通路中富集，當(dāng)誘發(fā)胰島素抵抗時(shí)，脂肪細(xì)胞、肌肉細(xì)胞對(duì)正常濃度的胰島素反應(yīng)不足，使得胰島素作用的敏感性降低，促進(jìn)葡萄糖攝取和利用效率下降，能量攝入過(guò)多[19]，脂肪分解減少[20]。而脂聯(lián)素能夠激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK),減少丙二酰輔酶A生成，促使脂肪酸進(jìn)入線粒體得到氧化[21]。當(dāng)發(fā)生脂聯(lián)素抵抗時(shí),脂聯(lián)素對(duì)AMPK的刺激減弱,骨骼肌中脂肪酸氧化的作用減弱，從而促進(jìn)胰島素抵抗[22]。ATF3基因是脂聯(lián)素基因表達(dá)的負(fù)調(diào)節(jié)因子，脂聯(lián)素基因低表達(dá)會(huì)導(dǎo)致肥胖和胰島素抵抗[23]。NOR-1基因在骨骼肌和脂肪組織中大量表達(dá)，參與肌內(nèi)脂肪形成[24]，NOR-1基因過(guò)度表達(dá)會(huì)導(dǎo)致循環(huán)兒茶酚胺濃度降低，引起胰島素敏感性降低[25]，導(dǎo)致脂肪分解減少，脂肪沉積增加[20]。PRKAG2基因編碼AMP活化蛋白激酶γ2亞單位，該基因上調(diào)導(dǎo)致AMPK活性增加，糖原合成激活、葡萄糖攝取增加，誘發(fā)胰島素抵抗，脂肪沉積增多[26]。本試驗(yàn)中，ATF3基因表達(dá)上調(diào)，引起脂聯(lián)素基因下調(diào)，可能導(dǎo)致脂肪含量增加；NOR-1基因上調(diào)引起胰島素敏感性降低，導(dǎo)致脂肪分解減少；PRKAG2基因上調(diào)導(dǎo)致糖原合成激活、葡萄糖攝取增加，脂肪沉積增多。

EGR1和EGR2基因?qū)儆谠缙谏L(zhǎng)反應(yīng)因子家族，與脂質(zhì)代謝、脂肪生成、胰島素及膽固醇生物合成有關(guān)，在脂肪細(xì)胞分化信號(hào)通路中富集。EGR1基因是3T3-L1脂肪細(xì)胞分化的負(fù)調(diào)節(jié)因子，敲除EGR1基因能增強(qiáng)脂肪細(xì)胞分化[27]。EGR2基因是脂肪細(xì)胞分化負(fù)調(diào)節(jié)因子miR-224-5p的直接靶點(diǎn)，miR-224-5p在早期脂肪形成中調(diào)節(jié)EGR2基因表達(dá)[28]。本試驗(yàn)中，EGR1和EGR2基因表達(dá)下調(diào)，可能促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化和脂肪形成。

3.2 大型迪慶藏豬S2 vs S3背最長(zhǎng)肌脂肪沉積差異表達(dá)基因

大型迪慶藏豬80 kgvs120 kg階段，LIPE、ATF3基因表達(dá)上調(diào)，PPARD、PDK4、FOXO1、PPARGC-1、STAT1基因表達(dá)下調(diào)。LIPE和ATF3基因均富集到葡萄糖穩(wěn)態(tài)信號(hào)通路中，影響肌肉組織對(duì)葡萄糖的吸收與利用及脂肪組織對(duì)胰島素的敏感性[29]。LIPE基因參與游離脂肪酸的動(dòng)員[30]、抗脂分解及脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致高肌內(nèi)脂肪含量[31]。ATF3基因通過(guò)負(fù)調(diào)控脂聯(lián)素基因而引起肥胖和胰島素抵抗[23]。本試驗(yàn)中，LIPE基因表達(dá)上調(diào)可能減少脂肪分解、提高肌內(nèi)脂肪含量，ATF3基因表達(dá)上調(diào)可引起脂聯(lián)素基因表達(dá)下調(diào)，可能導(dǎo)致肌內(nèi)脂肪含量增加。

PPARD基因在Wnt和PPAR信號(hào)通路中富集，參與脂肪代謝、能量調(diào)控，進(jìn)而影響脂肪細(xì)胞的分化[32]。研究發(fā)現(xiàn)，Wnt信號(hào)通路能夠調(diào)節(jié)脂肪沉積[33]，同時(shí)能維持前脂肪細(xì)胞向脂肪成熟細(xì)胞分化的狀態(tài)，Wnt信號(hào)通路減弱時(shí)，可分化大量脂肪細(xì)胞[34]。PPARD基因是胰島素敏感和脂肪代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在脂肪代謝中發(fā)揮作用，主要參與脂肪酸分解[35]，增強(qiáng)脂肪酸運(yùn)輸、氧化、能量解偶聯(lián)、線粒體呼吸、產(chǎn)熱等相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[36]，上調(diào)脂肪酸氧化相關(guān)基因，降低體重、脂滴數(shù)量和脂滴大小[35]。豬PPARD基因定位在7號(hào)染色體一個(gè)脂肪沉積的數(shù)量性狀基因座(quantitative trait locus,QTL)附近，可促進(jìn)膽固醇和血清高密度脂蛋白積累[37]。PDK4、FOXO1、PPARGC-1、STAT1基因均在葡萄糖穩(wěn)態(tài)、胰島素受體及胰島素信號(hào)通路過(guò)程中富集，通過(guò)影響脂聯(lián)素及胰島素作用的敏感性，進(jìn)而影響葡萄糖攝取和利用效率及能量代謝，從而影響肌內(nèi)脂肪含量。FOXO1基因會(huì)對(duì)脂聯(lián)素受體的表達(dá)及脂聯(lián)素敏感性的調(diào)節(jié)產(chǎn)生影響[38]，同時(shí)FOXO1基因在調(diào)節(jié)胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的糖異生和糖原分解中發(fā)揮重要作用，通過(guò)抑制細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)激酶而阻止脂肪生成轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)[39]，在終末分化開(kāi)始時(shí)，F(xiàn)OXO1基因被激活并轉(zhuǎn)移到前脂肪細(xì)胞的細(xì)胞核，與PPARG基因的啟動(dòng)子結(jié)合，導(dǎo)致有絲分裂后細(xì)胞生長(zhǎng)停滯，負(fù)調(diào)控脂肪生成[40]。此外，F(xiàn)OXO1與PDK4基因的啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合，增加肌肉中PDK4基因mRNA的表達(dá)[41]，減少丙酮酸脫氫酶復(fù)合物(pyruvate dehydrogenase complex,PDC)通量，減弱碳水化合物氧化和葡萄糖攝取，并減少游離脂肪酸[42]。PPARGC-1是一種轉(zhuǎn)錄共激活因子，可調(diào)控能量代謝，在米色和棕色脂肪組織中對(duì)脂肪代謝、脂肪細(xì)胞增殖、脂肪儲(chǔ)存起重要調(diào)控作用[43]，脂肪組織中缺乏PPARGC-1基因的小鼠會(huì)產(chǎn)生胰島素抵抗[44]。STAT1基因位于PPARG基因下游，在脂肪細(xì)胞分化中通過(guò)級(jí)聯(lián)調(diào)節(jié)負(fù)調(diào)控脂肪形成[45]。本試驗(yàn)中，PPARD、FOXO1、PPARGC-1、STAT1、PDK4基因表達(dá)下調(diào)，PPARD基因表達(dá)下調(diào)可能使脂肪酸運(yùn)輸、氧化等相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄下調(diào)，脂肪酸分解減少、脂肪酸積累增多、脂滴變大。FOXO1基因表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致與PPARG基因的啟動(dòng)子結(jié)合減少，脂肪生成增多；另外，F(xiàn)OXO1與PDK4基因的啟動(dòng)子結(jié)合減少，葡萄糖攝取增加，游離脂肪酸增多。PPARGC-1基因表達(dá)下調(diào)可能使骨骼肌對(duì)胰島素的敏感性降低，肌內(nèi)脂肪含量增加。STAT1基因位于PPARG基因下游，PPARG基因通過(guò)級(jí)聯(lián)調(diào)控引起STAT1基因表達(dá)下調(diào)，促進(jìn)脂肪生成。

3.3 大型迪慶藏豬S1 vs S3背最長(zhǎng)肌脂肪沉積差異表達(dá)基因

大型迪慶藏豬40 kgvs120 kg階段，ATF3、NOR-1基因表達(dá)上調(diào)，STAT1、EGR1、EGR2基因表達(dá)下調(diào)。ATF3和NOR-1基因富集到胰島素信號(hào)通路中，通過(guò)影響肌肉組織和脂肪組織中胰島素敏感性來(lái)影響葡萄糖攝取及能量代謝效率，增加肌內(nèi)脂肪含量[19-20]。STAT1基因在能量穩(wěn)態(tài)、胰島素抵抗信號(hào)通路中富集，通過(guò)級(jí)聯(lián)調(diào)節(jié)負(fù)調(diào)控脂肪形成[45]。EGR1、EGR2基因?qū)儆诹⒃缁?immediate early genes,IEGs)，參與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化，富集到脂肪細(xì)胞分化信號(hào)通路。EGR1和EGR2為脂肪細(xì)胞分化的負(fù)調(diào)節(jié)因子[27-28]，其表達(dá)下調(diào)促進(jìn)脂肪形成。

4 結(jié) 論

ATF3、NOR-1、PRKAG2、EGR1、EGR2、LIPE、PPARD、PDK4、FOXO1、PPARGC-1、STAT1作為核心基因調(diào)控大型迪慶藏豬肌內(nèi)脂肪沉積；不同生長(zhǎng)階段參與調(diào)控的核心基因并不完全相同，40 kgvs80 kg階段，ATF3、NOR-1、PRKAG2基因表達(dá)上調(diào)，EGR1、EGR2基因表達(dá)下調(diào)；80 kgvs120 kg階段，LIPE、ATF3表達(dá)上調(diào)，PPARD、PDK4、FOXO1、PPARGC-1、STAT1基因表達(dá)下調(diào)；40 kgvs120 kg階段，ATF3、NOR-1基因表達(dá)上調(diào)，EGR1、EGR2、STAT1基因表達(dá)下調(diào)。