仵宇帥，尚穎旭，蔣 喬，丁寶全

（1.鄭州大學(xué)河南先進(jìn)技術(shù)研究院,鄭州 450003；2.國(guó)家納米科學(xué)中心,中國(guó)科學(xué)院納米系統(tǒng)與多級(jí)次制造重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100190）

惡性腫瘤是威脅人類健康的重大疾病之一. 手術(shù)治療及化學(xué)藥物治療仍然是目前腫瘤治療的主要手段. 雖然傳統(tǒng)的小分子化療藥物已展現(xiàn)出較好的治療效果，但是其溶解性差、特異性差和全身毒性強(qiáng)等問題會(huì)帶來(lái)諸多副作用［1，2］，限制了其更為廣泛的應(yīng)用. 近年來(lái)，蛋白質(zhì)和核酸類藥物在腫瘤治療方面展現(xiàn)出巨大潛力［3］，但其成本高、易酶解及靶向性差等問題仍然亟待解決［4］. 因此，開發(fā)高效低毒的藥物遞送載體具有重要意義.

理想的藥物載體應(yīng)具備以下特點(diǎn)：（1）能夠增強(qiáng)藥物穩(wěn)定性，防止藥物在體內(nèi)發(fā)生化學(xué)降解或失活；（2）能夠降低藥物對(duì)正常組織的生物毒性或免疫刺激；（3）能夠改善藥代動(dòng)力學(xué)，延長(zhǎng)藥物在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間；（4）能夠?qū)崿F(xiàn)多種藥物的共同遞送、協(xié)同增效；（5）實(shí)現(xiàn)藥物的精準(zhǔn)靶向及可控釋放. 納米技術(shù)的快速發(fā)展為開發(fā)具有上述特性的納米藥物載體提供了豐富的材料選擇. 脂質(zhì)體［5～7］、聚合物［8，9］、無(wú)機(jī)納米顆粒［10，11］、樹枝狀大分子［12］、膠束［13］、納米乳液［14］和聚合物藥物偶聯(lián)物［15］等多種納米材料已作為載體系統(tǒng)應(yīng)用于多種藥物的遞送中，如脂質(zhì)載體Doxil、DaunoXome 及聚合物載體Gliadel等［16］已被美國(guó)食品藥品管理局（FDA）批準(zhǔn)用于臨床使用或臨床試驗(yàn)的載體. 由于納米級(jí)尺寸和功能化修飾帶來(lái)的獨(dú)特性質(zhì)，納米載體能夠有效延長(zhǎng)藥物的體內(nèi)半衰期，增加藥物水溶性，提高其細(xì)胞攝取效率. 然而，大部分傳統(tǒng)納米載體的結(jié)構(gòu)均一性不佳，難以進(jìn)行多級(jí)次結(jié)構(gòu)組裝而實(shí)現(xiàn)豐富的功能；在一定程度上減弱了其在生理?xiàng)l件下的藥物遞送效果；大部分傳統(tǒng)納米載體缺乏對(duì)藥物裝載劑量、藥物釋放速率和藥物代謝行為的精準(zhǔn)控制. 此外，有些納米載體的靶向性較差或具有一定生物安全性隱患. 因此，如何設(shè)計(jì)具有精確結(jié)構(gòu)、能夠?qū)崿F(xiàn)藥物高效裝載以及可控釋放的納米材料載體，以提高藥物的靶向性、有效性和生物安全性，是納米藥物載體平臺(tái)構(gòu)建面臨的關(guān)鍵問題.

對(duì)于上述問題，結(jié)構(gòu)DNA納米技術(shù)（Structural DNA nanotechnology）作為一種新型的可控自組裝技術(shù)為人們提供了一個(gè)新穎的解決方案. 在過(guò)去的幾十年里，DNA分子作為一種可編程的自組裝單元備受關(guān)注. 1982 年，Seeman 等［17］創(chuàng)造性地利用特定序列的DNA 分子構(gòu)建出了穩(wěn)定的四臂結(jié)納米結(jié)構(gòu)（Holliday juncture/junction），開啟了結(jié)構(gòu)DNA 納米技術(shù)這一全新的科學(xué)領(lǐng)域. 此后，各種基于DNA 分子自組裝的納米結(jié)構(gòu)陸續(xù)被設(shè)計(jì)構(gòu)建出來(lái). 由DNA 瓦片（DNA tiles）技術(shù)構(gòu)建而成的DNA 水凝膠［18］、DNA 晶體［19～21］，由DNA 單鏈自組裝（Single-stranded tiles，SST）所形成的二維（2D）或三維（3D）結(jié)構(gòu)等［22，23］，由滾環(huán)擴(kuò)增（Rolling circle amplification，RCA）組裝得到的DNA 納米花［24］、DNA 水凝膠［25］及DNA 交聯(lián)聚合物［26］等結(jié)構(gòu)，已被開發(fā)作為多功能載體用于細(xì)胞和活體的藥物遞送［27］. 2006 年，Rothemund 等［28］報(bào)道的DNA 折紙結(jié)構(gòu)開啟了DNA 納米技術(shù)的新紀(jì)元. DNA 折紙技術(shù)利用一條長(zhǎng)的腳手架鏈（Scaffold strand，約7000 nt）與數(shù)百條訂書釘鏈（Staple strands）通過(guò)熱退火過(guò)程，利用氫鍵、親疏水性和靜電力等分子間的弱相互作用，自組裝為預(yù)先設(shè)計(jì)的二維或三維納米結(jié)構(gòu). 這種組裝方法簡(jiǎn)單易行，結(jié)構(gòu)高度可控，顯著降低了DNA納米技術(shù)的門檻，為DNA納米結(jié)構(gòu)的廣泛應(yīng)用奠定了基礎(chǔ). 更重要的是，數(shù)百條序列完全可控的訂書釘短鏈也使得DNA折紙納米結(jié)構(gòu)完全可尋址（Complete addressability），即整個(gè)納米模板具有精確的定位能力，可以用于功能基團(tuán)的位點(diǎn)特異性修飾. 精確排列蛋白質(zhì)空間取向用于其結(jié)構(gòu)的解析［29］、制備納米級(jí)傳感器以提高傳感精度［30］、用于引導(dǎo)DNA邏輯計(jì)算［31］及作為構(gòu)建等離子體納米結(jié)構(gòu)的模板以制備納米光學(xué)器件等［32，33］. 在生命科學(xué)領(lǐng)域，DNA折紙技術(shù)在合成仿生微納結(jié)構(gòu)［34］及構(gòu)筑可控酶催化反應(yīng)容器［35］等領(lǐng)域也取得了一定的進(jìn)展. 而利用可控自組裝DNA折紙結(jié)構(gòu)作為藥物遞送載體則是其最重要的應(yīng)用之一.

由于腫瘤區(qū)域的增強(qiáng)滲透滯留效應(yīng)（EPR）［36］，流體力學(xué)尺寸通常在10～400 nm之間的DNA納米結(jié)構(gòu)可以在腫瘤區(qū)域富集，進(jìn)而被細(xì)胞內(nèi)化以發(fā)揮其調(diào)節(jié)生物功能的作用［37］. 不同于游離的單鏈或雙鏈DNA分子，自組裝的DNA折紙結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗酶解能力和生理環(huán)境穩(wěn)定性. 此外，其親水性表面還可以修飾寡聚賴氨酸-聚乙二醇（Oligolysine-PEG）等聚合物［38］，從而進(jìn)一步提高其體內(nèi)穩(wěn)定性，降低其免疫原性. 作為藥物載體，DNA折紙結(jié)構(gòu)能夠通過(guò)共價(jià)或非共價(jià)等化學(xué)作用對(duì)多種功能基團(tuán)進(jìn)行裝載，如適配體、小分子化療藥物、核酸類藥物、蛋白/多肽類藥物和熒光基團(tuán)等，用于實(shí)現(xiàn)其腫瘤靶向性或攜帶多種治療功能成分. 可尋址性更是賦予其在納米級(jí)尺寸精度下精準(zhǔn)定位藥物分子、精確控制藥物上載量的能力. 在DNA折紙結(jié)構(gòu)中引入刺激響應(yīng)基團(tuán)可使其能夠?qū)ν饨绱碳ぃ缃t外光、腫瘤微環(huán)境或細(xì)胞溶酶體內(nèi)的酸性環(huán)境、腫瘤細(xì)胞表面特異性受體及腫瘤血管標(biāo)志物等進(jìn)行動(dòng)態(tài)響應(yīng)，從而構(gòu)建出基于DNA折紙結(jié)構(gòu)的智能遞送載體. 這類載體在到達(dá)腫瘤微環(huán)境后，可以選擇性地觸發(fā)其結(jié)構(gòu)發(fā)生構(gòu)象變化或特定化學(xué)鍵的斷裂，定位定量釋放藥物. DNA分子作為絕大多數(shù)生物體內(nèi)存在的生物大分子，具有天然的生物相容性，為構(gòu)建體內(nèi)安全可控的藥物遞送載體提供了有力支持. 本文總結(jié)了近年來(lái)DNA折紙結(jié)構(gòu)作為藥物遞送系統(tǒng)在疾病診療方面的應(yīng)用；詳細(xì)討論了DNA折紙結(jié)構(gòu)從單一藥物載體到智能響應(yīng)型納米載體的發(fā)展歷程；最后對(duì)DNA折紙載體的發(fā)展前景、現(xiàn)階段面臨的挑戰(zhàn)以及可能的解決方法進(jìn)行了展望與分析.

1 DNA折紙載體用于多種藥物分子的遞送

1.1 小分子藥物

1.1.1 化療藥物分子 阿霉素（Doxorubicin）是腫瘤化療中常用的藥物之一，能夠通過(guò)嵌入DNA 雙螺旋，抑制生物大分子合成，從而殺傷腫瘤細(xì)胞. 與其它化療藥物類似，阿霉素雖然在臨床使用中展示出良好的療效，但其游離分子靜脈給藥仍存在靶向性差、毒副作用大等缺點(diǎn)；長(zhǎng)期給藥還可能導(dǎo)致腫瘤多藥耐藥性的產(chǎn)生［2］. 研究表明，多種經(jīng)典的藥物載體，如脂質(zhì)體［39］、聚合物［40］和無(wú)機(jī)納米顆粒［41］等均可用于阿霉素的遞送，并取得了較好的效果，但這些載體本身仍然可能存在一定的安全性問題.

含有蒽環(huán)結(jié)構(gòu)的阿霉素可以嵌入DNA 雙螺旋中. 基于這一性質(zhì)，Ding等［42］嘗試使用DNA 折紙作為藥物載體遞送阿霉素［圖1（A）］. DNA折紙中大量的雙螺旋使得阿霉素具有較高的上載量，并且改善了阿霉素的水溶性以及細(xì)胞內(nèi)化效果，在耐藥的人乳腺癌細(xì)胞MCF-7 中展現(xiàn)了極強(qiáng)的細(xì)胞毒性. 之后，Ding等［43］系統(tǒng)研究了不同幾何形狀對(duì)DNA折紙載體活體分布的影響. 在靜脈注射后，DNA折紙顯示出較高的腫瘤富集特性，其中三角形DNA折紙表現(xiàn)出最佳的腫瘤被動(dòng)靶向積累. 負(fù)載阿霉素的DNA折紙?jiān)诤闪鲂∈篌w內(nèi)展現(xiàn)出明顯的腫瘤抑制效果，且無(wú)明顯毒副作用. H?gberg 等［44］研究了負(fù)載阿霉素的管狀DNA折紙結(jié)構(gòu)對(duì)3種乳腺癌細(xì)胞的殺傷能力. 通過(guò)在管狀DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中設(shè)計(jì)不同數(shù)量的堿基缺失，以此賦予DNA折紙結(jié)構(gòu)不同程度的扭曲，從而改善DNA折紙載體的裝載效率和藥物釋放能力. 相比于游離的阿霉素，DNA 折紙載體降低了藥物的細(xì)胞清除率，并且對(duì)3 種不同的腫瘤細(xì)胞（MDA-MB-231，MDA-MB-468和MCF-7）均產(chǎn)生了明顯的殺傷效果［圖1（B）］. 2019年，Li等［45］將靶向配體2-［3-（1，3-二羧丙基）］-脲基戊二酸（DUPA）和阿霉素修飾到管狀DNA折紙上，構(gòu)建了一種具有靶向功能的DNA 折紙載體. 先將DUPA 共價(jià)連接到DNA 單鏈上，然后通過(guò)雜交修飾到DNA 折紙表面. 在靶向配體的幫助下，DNA折紙載體實(shí)現(xiàn)了選擇性的細(xì)胞內(nèi)化及殺傷，且其治療效果與靶向配體修飾數(shù)量及細(xì)胞膜上受體數(shù)量呈正相關(guān)關(guān)系［圖1（C）］. 與傳統(tǒng)的靜脈注射給藥方式相比，透皮給藥方式（Transdermal drug delivery）具有無(wú)創(chuàng)或微創(chuàng)的特性，并且可以繞過(guò)肝臟代謝途徑，是一種便捷高效的給藥方式. Xu等［46］探究了不同DNA納米結(jié)構(gòu)的透皮給藥能力，發(fā)現(xiàn)8種不同形狀和尺寸的DNA納米載體均展現(xiàn)出不同程度的皮膚穿透能力，其中粒徑為17 nm 的DNA 四面體具有最高的穿透深度（約350 μm）. 與其它常用載體（脂質(zhì)體或聚合物等）相比，DNA納米載體裝載的阿霉素的局部聚集提高了2倍以上，并且對(duì)黑色素瘤具有顯著的抑制效果.

柔紅霉素（Daunorubicin）也是一種臨床常用的化療藥物，其作用機(jī)理與阿霉素類似. Castro等［47］利用棒狀DNA折紙結(jié)構(gòu)遞送柔紅霉素進(jìn)行白血病治療相關(guān)研究. 在相同濃度的柔紅霉素處理下，DNA折紙載體增加了藥物的細(xì)胞攝取量和滯留時(shí)間，并且顯著提高了療效. 這些成功的例子證明了DNA折紙結(jié)構(gòu)用作小分子藥物載體增強(qiáng)腫瘤治療效果的廣闊前景.

1.1.2 染料分子 熒光染料分子是研究藥物載體的常用示蹤分子，能夠通過(guò)熒光顯微鏡使納米結(jié)構(gòu)可視化. 得益于成熟的化學(xué)合成技術(shù)，熒光染料小分子能以共價(jià)或非共價(jià)等多種方式連接在DNA分子的任意位置. 2012年，Ding 等［48］報(bào)道了一種無(wú)標(biāo)記熒光方法用于探究DNA 折紙結(jié)構(gòu)在細(xì)胞中的分布及穩(wěn)定性. 選用咔唑雙花青（Carbazole-based biscyanine）作為熒光分子，將其嵌入DNA雙螺旋并發(fā)出強(qiáng)烈熒光. 當(dāng)DNA折紙結(jié)構(gòu)被破壞后，染料分子得以釋放，進(jìn)而導(dǎo)致熒光強(qiáng)度降低，以此來(lái)監(jiān)控DNA折紙結(jié)構(gòu)在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DNA折紙結(jié)構(gòu)的降解過(guò)程在細(xì)胞中持續(xù)長(zhǎng)達(dá)60 h［圖1（D）］.2018年，Shih等［49］利用熒光分子標(biāo)記方法研究了不同DNA折紙結(jié)構(gòu)的細(xì)胞攝取能力. 將Cy5熒光分子共價(jià)連接到11 種不同的DNA 折紙結(jié)構(gòu)上；通過(guò)與3 種不同的腫瘤細(xì)胞共孵育，發(fā)現(xiàn)致密性更強(qiáng)的DNA折紙結(jié)構(gòu)具有更高的細(xì)胞內(nèi)化效率，且同種結(jié)構(gòu)的攝取動(dòng)力學(xué)與細(xì)胞類型相關(guān)［圖1（E）］. 最近，Cai等［50］使用放射性元素標(biāo)記的DNA折紙結(jié)構(gòu)探究了其在活體中的分布. 正電子發(fā)射斷層掃描（PET）結(jié)果顯示，64Cu標(biāo)記的矩形DNA折紙結(jié)構(gòu)在注射5 min后即在腎臟中迅速積累，并逐漸向膀胱轉(zhuǎn)移.

Fig.1 DNA origami as a doxorubicin carrier for circumvention of drug resistance(A)[42], DNA origami with tunable release properties for cancer treatment(B) [44], targeted DNA origami structure for doxorubicin delivery(C)[45], DNA origami with label?free fluorescent probe for visualization of the intracellular location(D)[48], the cellular uptake efficiency of DNA origami with different mass and shape(E)[49]and BMEPC loaded DNA origami for cancer photodynamic therapy(F)[52]（A）Copyright 2012，American Chemical Society；（B）Copyright 2012，American Chemical Society；（C）Copyright 2018，American Chemical Society；（D）Copyright 2012，Royal Society of Chemistry；（E）Copyright 2019，Wiley Online Library；（F）Copyright 2016，American Chemical Society.

1.1.3 光觸發(fā)分子 光動(dòng)力治療（PDT）利用光敏劑和分子氧在近紅外光照射下局部產(chǎn)生大量活性氧，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的死亡. 然而，受限于光敏劑的腫瘤穿透深度、實(shí)體瘤的缺氧環(huán)境和易光漂白等性質(zhì)，游離的光敏劑難以實(shí)現(xiàn)較強(qiáng)的腫瘤殺傷能力.

咔唑衍生物BMEPC｛3，6-［bis2-（1-methylpyridinium）ethynyl］-9-pentyl-carbazole diiodide｝是一種可用于單光子和雙光子成像的顯影劑和光敏劑，可以被近紅外光充分激發(fā)，高效產(chǎn)生活性氧［51］. 但BMEPC 在水中的溶解度很低，且容易聚集猝滅. 2015 年，Liang 等［52］嘗試用DNA 折紙結(jié)構(gòu)遞送BMEPC，用于腫瘤細(xì)胞的光動(dòng)力治療. BMEPC 可以通過(guò)靜電吸附和嵌插作用與DNA 分子結(jié)合，有效改善了其水溶性差和聚集猝滅的問題. 與游離的BMEPC分子相比，負(fù)載BMEPC分子的DNA折紙載體具有更高的細(xì)胞攝取能力，在近紅外光照射下對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7具有更強(qiáng)的殺傷效果［圖1（F）］.最近，Zhan等［53］開發(fā)了一種可用于腫瘤區(qū)域光聲成像的DNA折紙載體. 巴諾蒽醌（AQ4N）作為光聲成像探針和化療藥物被嵌入DNA雙螺旋中. DNA折紙載體提高了AQ4N在血液中的循環(huán)時(shí)間和腫瘤富集的效率，提高了光聲成像的質(zhì)量，還可監(jiān)測(cè)化療藥物導(dǎo)致的腫瘤缺氧狀況.

1.2 大分子藥物

1.2.1 功能核酸 未甲基化的CpG 序列（Cytosine-Phosphate-Guanosine motif）常見于細(xì)菌基因組，在哺乳動(dòng)物基因組中比較罕見，因此會(huì)被免疫系統(tǒng)視為病原體入侵的信號(hào)，從而高效激活生物體的免疫反應(yīng). 其具體作用機(jī)制為CpG序列與免疫細(xì)胞的Toll樣受體9（TLR9）相互作用，誘導(dǎo)生物體針對(duì)抗原產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)［54］.

2011年，Liedl等［55］選用小鼠脾細(xì)胞測(cè)試了負(fù)載CpG序列的DNA折紙引起免疫反應(yīng)的能力. 通過(guò)序列設(shè)計(jì)，62條CpG序列被裝載到管狀DNA折紙上. 與新鮮分離的小鼠脾臟細(xì)胞共孵育之后，DNA折紙載體顯示出比脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染更高的免疫刺激水平，使其產(chǎn)生更多的促炎因子，如白細(xì)胞介素-6（IL-6）和白細(xì)胞介素-12p70（IL-12p70），并且無(wú)明顯的細(xì)胞毒性［圖2（A）］. Rehberg 等［56］組裝了DNA 納米管作為CpG序列的遞送載體. DNA納米管基于DNA單鏈自組裝的方法構(gòu)建而成，每個(gè)DNA納米管上包含48 條CpG 序列. 與巨噬細(xì)胞RAW264.7 孵育15 h 后，DNA 納米管載體誘導(dǎo)了高效的免疫刺激. 此外，他們還探究了DNA納米管在活體水平誘導(dǎo)免疫刺激的能力. 通過(guò)肌肉注射，DNA納米管在幾分鐘內(nèi)即被巨噬細(xì)胞內(nèi)化，誘導(dǎo)白細(xì)胞募集到肌肉組織中，并激活周圍細(xì)胞的NF-?B通路［圖2（B）］. CpG序列在癌癥的免疫治療中也具有重要作用. Ding等［57］設(shè)計(jì)了管狀DNA折紙載體，用于遞送癌癥相關(guān)抗原和2種佐劑（CpG和dsRNA），在小鼠體內(nèi)實(shí)現(xiàn)了腫瘤抑制和長(zhǎng)效的抗腫瘤免疫保護(hù).

Fig.2 CpG motif?coated DNA origami for cellular immunostimulation(A)[55],DNA nanotube as intracellular CpG delivery vehicle(B)[56], Bcl2?targeting siRNA delivered by DNA nanoparticles for suppressing cancer cell growth(C) [61], DNA origami as a long chain nucleic acid delivery carrier for cancer combined therapy(D)[64],aptamer modified DNA origami for sequential therapy of acute kidney injury(E)[66]and DNA origami?based aptamer nanoarray for anticoagulation in hemodialysis(F)[67]（A）Copyright 2011，American Chemical Society；（B）Copyright 2015，Elsevier；（C）Copyright 2017，Wiley Online Library；（D）Copyright 2018，American Chemical Society；（E）Copyright 2021，American Chemical Society；（F）Copyright 2020，Springer Nature.

RNA干擾（RNAi）療法是一種由小干擾RNA（siRNA）介導(dǎo)的內(nèi)在基因沉默途徑，通過(guò)siRNA結(jié)合互補(bǔ)的mRNA來(lái)抑制其下游蛋白質(zhì)的合成［58］. RNAi療法以其極高的特異性受到越來(lái)越多的關(guān)注，但是作為一種核酸類藥物，易酶促降解、內(nèi)化效率低和體內(nèi)半衰期短等問題仍然限制了RNA 療法的廣泛應(yīng)用. 研究人元已經(jīng)開發(fā)了多種遞送材料如脂質(zhì)體、聚合物及無(wú)機(jī)納米顆粒等來(lái)提高siRNA的穩(wěn)定性與內(nèi)化效率，但是這些材料本身又會(huì)導(dǎo)致一定的細(xì)胞毒性及免疫反應(yīng)等問題［59］. 因此，近年來(lái)生物相容性更好的核酸遞送載體受到了廣泛關(guān)注. 2012年，Anderson等［60］使用DNA四面體作為siRNA的遞送載體，用于體內(nèi)靶向基因沉默. 利用DNA 納米結(jié)構(gòu)的可編程性控制腫瘤細(xì)胞靶向配體（多肽或葉酸）在DNA四面體表面的朝向和密度. 在荷瘤小鼠模型中，葉酸修飾的DNA四面體（半衰期24.2 min）表現(xiàn)出比游離siRNA（半衰期6 min）更長(zhǎng)的血液循環(huán)時(shí)間，并增強(qiáng)了其在腫瘤區(qū)域的富集. 將葉酸和抗熒光素酶siRNA修飾的四面體注射到KB異種移植腫瘤后，可以觀察到明顯的基因沉默，且無(wú)明顯的免疫反應(yīng)產(chǎn)生. Shin 等［61］基于模塊化DNA 磚的方法構(gòu)建了一系列不同尺寸矩形和管狀DNA 納米顆粒（DNPs）.通過(guò)在DNPs表面延伸出一定長(zhǎng)度的DNA單鏈來(lái)雜交靶向抗凋亡蛋白Bcl2的siRNA. 不同尺寸的DNA納米顆粒均可以提高siRNA 的穩(wěn)定性和細(xì)胞內(nèi)化效率. 其中，尺寸越小的DNPs 可以更多地被腫瘤細(xì)胞內(nèi)化，有效降低相關(guān)蛋白表達(dá)水平，抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng). 負(fù)載siRNA的DNPs還在荷瘤小鼠體內(nèi)展現(xiàn)出高效的基因沉默，抑制腫瘤的生長(zhǎng)，并且無(wú)明顯的生物毒性［圖2（C）］.

腫瘤多藥耐藥性（MDR）是癌癥化療過(guò)程中常見的問題之一，其可能的產(chǎn)生機(jī)制包括改變藥物代謝途徑、增加藥物外排、減少藥物攝取以及DNA損傷修復(fù)功能失衡等. 雖然對(duì)這些機(jī)制已經(jīng)有了一定程度的研究，但尚未完全闡明. P-糖蛋白（Pgp）是一種跨膜ATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，可以促進(jìn)很多化療小分子外排出癌細(xì)胞. 研究表明，Pgp在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)明顯上升是導(dǎo)致多種腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性的重要原因之一［62］. 因此，靶向Pgp 進(jìn)而抑制其發(fā)揮功能是逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥性的重要手段之一. 2018 年，Ding 等［63］設(shè)計(jì)了一種三角形DNA 折紙結(jié)構(gòu)，用作RNAi 和阿霉素的共遞送載體. 2 個(gè)MDR 相關(guān)基因（Pgp基因和Sur基因）的小發(fā)夾RNA和靶向基團(tuán)MUC1被裝載到DNA折紙載體上. 共遞送載體提高了RNA的酶穩(wěn)定性，在人乳腺癌細(xì)胞MCF-7中顯示出高效的細(xì)胞攝取和基因敲除能力. 加載阿霉素后，共遞送載體在荷瘤小鼠體內(nèi)進(jìn)行協(xié)同治療，顯著抑制了耐藥性腫瘤的生長(zhǎng). 隨后，又將DNA折紙結(jié)構(gòu)作為線性腫瘤治療基因p53和阿霉素的共遞送載體［64］［圖2（D）］，用于多藥耐藥性腫瘤的協(xié)同治療. 反義核酸（ASOs）是一類可以與靶基因配對(duì)，進(jìn)行基因表達(dá)調(diào)控的治療型核酸，是癌癥基因療法的候選藥物之一. Chu等［65］設(shè)計(jì)了一種多功能DNA折紙載體用于遞送反義核酸和阿霉素等藥物分子. 2種反義核酸（Pgp-ASO和Bcl2-ASO）和適配體MUC1通過(guò)位點(diǎn)設(shè)計(jì)被精確地組裝在DNA折紙模板上. 在靶向適配體的作用下，DNA折紙載體被高效內(nèi)化到癌細(xì)胞中，進(jìn)而在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行基因調(diào)控，下調(diào)相關(guān)蛋白表達(dá)水平. 多功能的DNA載體在2種耐藥癌細(xì)胞系（MCF-7R和HeLa-R）均顯示出良好的細(xì)胞殺傷效果，表明其廣譜的抗腫瘤效果.

適配體（Aptamer）通常是單鏈DNA/RNA分子，在體外經(jīng)過(guò)配體指數(shù)富集的系統(tǒng)進(jìn)化（SELEX）過(guò)程篩選得到，能夠在復(fù)雜的生物環(huán)境中通過(guò)氫鍵、空間構(gòu)型匹配等弱相互作用識(shí)別并結(jié)合特定的標(biāo)志物，形成穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)［66］. 鑒于其與DNA折紙結(jié)構(gòu)的同源性，適配體可以很容易地通過(guò)序列延伸或堿基互補(bǔ)配對(duì)的方法連接到DNA折紙結(jié)構(gòu)上. Ge等［67］開發(fā)了一種腎積累的DNA納米裝置，用于不同階段急性腎損傷的治療. 在矩形DNA折紙上修飾抗補(bǔ)體成分5a適配體（aC5a），在治療前期DNA折紙可以清除腎臟的活性氧來(lái)緩解腎臟的氧化應(yīng)激反應(yīng)，隨后其靶向結(jié)合C5a蛋白，抑制其活性從而阻斷后續(xù)的炎癥反應(yīng). 這種基于不同時(shí)間的貫序治療在急性腎損傷小鼠模型中展現(xiàn)出明顯的治療效果［圖2（E）］. 2020年，Ding等［68］開發(fā)了一種基于矩形DNA 折紙的DNA 納米抗凝劑，旨在捕獲血液中的凝血酶以提高血液透析過(guò)程中的抗凝效果. 2種凝血酶適配體（TBA15和HD22）被規(guī)律地排列在DNA折紙上. 通過(guò)不同的位點(diǎn)設(shè)計(jì)可以控制2種適配體的間距，當(dāng)二者相距5.4 nm時(shí)，對(duì)凝血酶具有最高的捕獲效率. 雙適配體修飾的DNA折紙載體在人血漿、新鮮全血和小鼠模型中均可有效防止血栓的形成，并且顯示出免疫惰性［圖2（F）］. Li等［69］通過(guò)重組質(zhì)粒的方法將適配體序列連接到M13腳手架上，而非DNA折紙結(jié)構(gòu)的訂書釘短鏈上，然后采用一鍋法組裝得到帶有適配體的DNA折紙結(jié)構(gòu). 這種方法明顯提高了適配體的抗酶解能力，并且整合了血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF）適配體的DNA 折紙載體，對(duì)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231具有顯著的抑制作用. 最近，基于適配體-受體高特異性和高親和力的特性，Baker等［70］開發(fā)了一種特異性識(shí)別細(xì)胞表面蛋白的DNA分子信標(biāo)，用于提高冷凍電鏡斷層掃描（cryoET）過(guò)程中的信噪比. 通過(guò)在DNA折紙結(jié)構(gòu)上連接不同適配體，可以使其在復(fù)雜的生物環(huán)境中準(zhǔn)確地結(jié)合目標(biāo)分子. DNA分子信標(biāo)能精確識(shí)別和定位目標(biāo)結(jié)構(gòu)，從而提高了膜囊泡、包膜病毒以及細(xì)胞在冷凍電鏡下的成像分辨率.

1.2.2 多肽和蛋白 多肽和蛋白（抗原、抗體、免疫球蛋白等）同樣能夠作為藥物用于多種疾病的治療. 目前臨床應(yīng)用中的大多數(shù)蛋白候選藥物仍然面臨著靶向性差、酶促降解和膜通透性差等問題［71］.多肽與蛋白可以通過(guò)多種共價(jià)或非共價(jià)的方式與DNA連接形成偶聯(lián)物，如Click反應(yīng)［72］、NHS/EDC反應(yīng)［73］、生物素-鏈霉親和素［74］、適配體-靶標(biāo)［75］和抗原-抗體［74］等，這使得利用DNA折紙載體遞送多肽和蛋白、調(diào)控生物功能成為可能.

Fig.3 Organizing antigen on DNA origami for B?cell activation(A)[76],clustering of death receptors using DNA origami sheets(B)[80], nanoscale FasL organization on DNA origami to induce cell apoptosis(C)[81], DNA origami carriers for intracellular delivery of RNase A(D)[83], DNA origami platform for cytokine delivery to alleviate acute kidney injury(E)[84] and DNA origami?based icosahedral shell system for virus trapping(F)[85]（A）Copyright 2020，Springer Nature；（B）Copyright 2020，American Chemical Society；（C）Copyright 2021，Wiley Online Library；（D）Copyright 2019，American Chemical Society；（E）Copyright 2021，American Chemical Society；（F）Copyright 2021，Springer Nature.

利用DNA折紙結(jié)構(gòu)強(qiáng)大的可控組裝及定位修飾能力，可以在納米尺度下精確地控制抗原間距，以探究抗原的不同分布對(duì)免疫細(xì)胞刺激水平的影響. Bathe 等［76］將不同數(shù)目的疫苗免疫原（eOD-GT8）修飾在DNA折紙結(jié)構(gòu)上，旨在探究抗原數(shù)目、間距和親和力對(duì)B細(xì)胞活化的影響. 利用DNA折紙的位點(diǎn)可尋址性，構(gòu)建了修飾有不同數(shù)量和排布的eOD-GT8的DNA折紙載體. 在病毒樣DNA折紙表面修飾最少5個(gè)抗原（間距20～30 nm）便可以最大化地活化B細(xì)胞，且DNA 折紙結(jié)構(gòu)的剛性對(duì)B細(xì)胞的刺激水平也有重要影響［圖3（A）］. Sevcsik等［77］將激動(dòng)劑肽/主要組織相容復(fù)合物（pMHCs）通過(guò)生物素-鏈霉親和素綴合到DNA 折紙模板上，發(fā)現(xiàn)2個(gè)間距為20 nm的pMHC是誘導(dǎo)T細(xì)胞發(fā)生信號(hào)傳導(dǎo)的最低條件. Douglas等［78］開發(fā)了一種DNA折紙“釘板”，用于控制合成T細(xì)胞受體的空間排布. 使用癌癥相關(guān)的嵌合抗原受體T細(xì)胞（CAR-T）模型，發(fā)現(xiàn)受體在DNA折紙釘板上的空間排布決定了細(xì)胞信號(hào)激活的靈敏度和動(dòng)力學(xué). 類似地，Teixeira等［79］利用線框DNA折紙結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)，程序性死亡配體（PD-L1）的空間排布會(huì)對(duì)T細(xì)胞信號(hào)展現(xiàn)出不同程度的抑制效果. 以上研究證明了抗原的納米級(jí)排布會(huì)影響免疫細(xì)胞活化效率，可能為納米疫苗的設(shè)計(jì)提供參考原則. 利用DNA折紙結(jié)構(gòu)組裝腫瘤細(xì)胞相關(guān)配體可以用于激活腫瘤細(xì)胞凋亡信號(hào). H?gberg 等［80］開發(fā)了2 種不同的DNA 折紙結(jié)構(gòu)作為跨膜腫瘤壞死因子（TNF）的組裝模板. 通過(guò)控制TNF在DNA折紙模板上的相對(duì)距離，發(fā)現(xiàn)配體間距為5 nm是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡的關(guān)鍵距離，這種排布的DNA 折紙載體在3 種不同的腫瘤細(xì)胞（MCF-7，SK-BR-3 和MDAMB-231）中均可有效誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［圖3（B）］. Jungemann等［81］將死亡受體配體（FasL）通過(guò)生物素-鏈霉親和素作用精確組裝到矩形DNA折紙模板上. 相比于游離的FasL，相距為10 nm的六角形FasL排布明顯加快了腫瘤細(xì)胞凋亡信號(hào)的傳導(dǎo)，傳導(dǎo)效率提高近100倍［圖3（C）］.

除了上述分子量較小的多肽類分子外，分子量較大的蛋白也可以通過(guò)DNA 折紙載體進(jìn)行遞送.Kjems等［82］開發(fā)了一種轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾的DNA折紙載體，用于增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)化效率. 利用蛋白質(zhì)上的金屬結(jié)合位點(diǎn)與NHS修飾的DNA 鏈進(jìn)行偶聯(lián)，可以將DNA 共價(jià)偶聯(lián)至蛋白表面的特定位置，避免影響蛋白功能. 轉(zhuǎn)鐵蛋白的偶聯(lián)顯著增強(qiáng)了DNA折紙?jiān)诎┘?xì)胞系KB中的內(nèi)化效率，且其增幅與折紙表面轉(zhuǎn)鐵蛋白的數(shù)量呈正相關(guān). Ding 等［83］報(bào)道了一種利用DNA 折紙載體遞送核糖核酸酶A（RNase A）的方法. 采用經(jīng)典的SMCC反應(yīng)得到RNase A-DNA偶聯(lián)物，通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式將RNase A 負(fù)載到矩形DNA折紙上. 在整合癌細(xì)胞靶向的適配體后，遞送系統(tǒng)的細(xì)胞內(nèi)化效率得到增強(qiáng)，且對(duì)乳腺癌細(xì)胞系MCF-7 具有良好的殺傷效果［圖3（D）］. 最近，Zheng 等［84］開發(fā)了一種遞送白細(xì)胞介素-33（IL-33）的DNA折紙載體，用于急性腎損傷的免疫治療. 先將IL-33通過(guò)化學(xué)連接劑3-（2-吡啶二硫代）丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯（SPDP）與巰基修飾的DNA鏈交聯(lián)，所得偶聯(lián)產(chǎn)物隨后通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)組裝到DNA折紙模板上. 通過(guò)靜脈注射后，DNA折紙載體優(yōu)先將IL-33遞送至腎臟，誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)2型淋巴細(xì)胞分化（ILC 2s），并使調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（T-reg）快速擴(kuò)增. 與游離的IL-33相比，DNA折紙載體延長(zhǎng)了IL-33在腎臟的停留時(shí)間，對(duì)急性腎損傷表現(xiàn)出更好的治療效果［圖3（E）］. 此外，利用DNA折紙結(jié)構(gòu)的可編程性還可以開發(fā)更為高階的結(jié)構(gòu). Dietz等［85］利用可編程的DNA三角塊組裝了內(nèi)徑高達(dá)280 nm的DNA二十面體外殼，構(gòu)造了一種廣譜的抗病毒平臺(tái). 在其內(nèi)腔中偶聯(lián)了乙型肝炎病毒抗體（anti-HBc17H7）之后，DNA二十面體外殼表現(xiàn)出特異性的病毒捕獲能力，并顯著抑制其毒性［圖3（F）］.

此外，DNA 折紙還可以用于溶菌酶的靶向遞送來(lái)抑制細(xì)菌的活性［86］，用于信號(hào)蛋白的精確排布［87］，用于連接多種天然酶以控制其催化效率［88］等.

1.2.3 其它納米顆粒 DNA納米載體同樣可用于遞送多種無(wú)機(jī)納米顆粒. 金納米棒（AuNR）是長(zhǎng)度為幾十到幾百納米的棒狀金納米顆粒，由于其可控的表面等離子共振（LSPR）特性，在光熱治療中具有非常廣闊的應(yīng)用前景［89］. 此外，金納米棒可通過(guò)金硫鍵與DNA鏈共價(jià)連接，為DNA折紙載體的遞送提供了條件.

2015年，Ding等［90］將金納米棒連接至DNA折紙表面，構(gòu)建了一種雙功能的納米組裝體，以探究其活體光熱治療功效. 與裸金納米棒或管狀DNA折紙載體相比，三角形DNA折紙載體顯著增加了金納米棒的細(xì)胞內(nèi)化效率. 在808 nm的激光照射下，該組裝體在細(xì)胞水平和活體水平上同時(shí)展現(xiàn)出良好的腫瘤細(xì)胞殺傷能力. 此外，該納米組裝體同樣可作為光聲成像（OAI）造影劑，用于腫瘤的光聲成像［91］.負(fù)載金納米棒的DNA折紙可以促使探針進(jìn)入腫瘤深部，提高了成像質(zhì)量［圖4（A）］. 之后，Ding等［92］設(shè)計(jì)并制備了一種多功能的DNA折紙平臺(tái)，整合了阿霉素、金納米棒及MUC1適配體等功能元件，在耐藥性腫瘤細(xì)胞MCF-7R 中表現(xiàn)出優(yōu)異的殺傷能力. 為了進(jìn)一步提高金納米棒光熱治療的效率，Zhu 等［93］開發(fā)了一種DNA 八面體折紙框架，精確組裝了siRNA、阿霉素及金納米棒等功能元件. 2 種siRNA可以抑制結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（CTGF）和熱休克蛋白（HSP72）的表達(dá)，提高了腫瘤細(xì)胞對(duì)化療和光熱治療的敏感性. 在協(xié)同治療的作用下，該DNA折紙載體顯著下調(diào)了細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，且在荷瘤小鼠模型中抑制了腫瘤的生長(zhǎng)［圖4（B）］.

鑒于金納米顆粒較高的電子襯度，Ke 等［94］將直徑10 nm 的金納米顆粒與不同尺寸的DNA 折紙結(jié)構(gòu)相連，利用透射電子顯微鏡（TEM）來(lái)跟蹤DNA 折紙?jiān)诎┘?xì)胞中的內(nèi)化路徑，評(píng)估了DNA 折紙的形狀、大小以及癌細(xì)胞種類對(duì)DNA 折紙細(xì)胞內(nèi)化效率的影響［圖4（C）］. DNA 折紙結(jié)構(gòu)還可以用于量子點(diǎn)（QD）及氧化鐵納米顆粒（IONP）的納米尺度排布. 2011年，Hughes等［95］利用生物素化的DNA折紙結(jié)構(gòu)，構(gòu)建了周期性排列的量子點(diǎn)陣列，但這種方法連接效率較低. 最近，Diaz 等［96］將肽核酸短鏈通過(guò)配位鍵固定到量子點(diǎn)的ZnS表面，隨后通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)連接到DNA折紙模板上，對(duì)量子點(diǎn)實(shí)現(xiàn)了超過(guò)90%的捕獲效率，并且由于肽核酸短鏈的可設(shè)計(jì)性，量子點(diǎn)的排布也更為可控［圖4（D）］. 磁性氧化鐵納米顆粒（IONP）可以作為核磁共振（MRI）造影劑進(jìn)行磁熱治療等應(yīng)用，在生物醫(yī)學(xué)方面具有廣闊前景. Ke等［97］通過(guò)DNA折紙結(jié)構(gòu)來(lái)控制IONP數(shù)量和距離，優(yōu)化了MRI的對(duì)比率. 雖然諸如DNA折紙載體遞送的量子點(diǎn)和氧化鐵納米顆粒尚未有疾病治療方面的相關(guān)報(bào)道，但這些探索豐富了DNA折紙載體的應(yīng)用領(lǐng)域，為納米藥物遞送系統(tǒng)的發(fā)展提供了新思路.

Fig.4 DNA origami?gold nanorod hybrids for enhanced optoacoustic imaging and photothermal therapy(A)[91], DNA origami octahedron for dual enhancement of chemotherapy and photothermal therapy(B)[93], AuNP modified DNA origami structures for visualization of cellular uptake process(C)[94] and DNA origami with peptide?PNA for quantum dot conjugation(D)[96]（A）Copyright 2016，Wiley Online Library；（B）Copyright 2021，Wiley Online Library；（C）Copyright 2018，American Chemical Society；（D）Copyright 2021，American Chemical Society.

2 智能響應(yīng)型DNA折紙載體

將多種刺激響應(yīng)功能基團(tuán)引入DNA折紙結(jié)構(gòu)中，可以從分子水平設(shè)計(jì)出針對(duì)不同刺激信號(hào)產(chǎn)生構(gòu)象變化的智能響應(yīng)型DNA折紙結(jié)構(gòu). 迄今，研究人員已經(jīng)構(gòu)建了多種動(dòng)態(tài)響應(yīng)結(jié)構(gòu)，包括DNA單鏈控制開合的DNA折紙盒子［98］及光控底物合成通道［99］等. 利用某些疾病靶點(diǎn)作為刺激信號(hào)，智能DNA折紙載體可以選擇性地在病患部位發(fā)生變構(gòu)，進(jìn)而釋放藥物，為所裝載的藥物提供更為充分的保護(hù)，并且減少遞送過(guò)程中由于脫靶效應(yīng)所產(chǎn)生的毒副作用，從而提高藥物的靶向控釋效果，在生物傳感、成像和疾病治療等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景.

Church 等［100］報(bào)道了一種基于DNA 折紙的桶狀DNA 納米裝置，能感受細(xì)胞表面受體而響應(yīng)性打開，從而實(shí)現(xiàn)內(nèi)部載荷分子的可控釋放. 桶狀DNA納米裝置的兩側(cè)被延伸的DNA鏈與核酸適配體雜交而鎖住，只有當(dāng)DNA 納米裝置接觸到細(xì)胞膜表面表達(dá)的相應(yīng)受體時(shí)，適配體才發(fā)生構(gòu)象變化，使DNA納米裝置打開，進(jìn)而暴露內(nèi)部載荷. 選用熒光標(biāo)記的抗體Fab片段作為內(nèi)部載荷，當(dāng)適配體遇到人白細(xì)胞表面抗原時(shí)，DNA折紙桶打開，抗體與表面受體結(jié)合導(dǎo)致熒光增強(qiáng). 當(dāng)納米桶的兩側(cè)被不同適配體鎖住時(shí)，便得到了一種邏輯“AND”門編碼的DNA納米裝置，需要細(xì)胞表面雙陽(yáng)性受體存在時(shí)，同時(shí)解鎖2種核酸適配體才能打開DNA納米桶，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)或發(fā)生凋亡［圖5（A）］. 該工作將邏輯門控添加到DNA折紙結(jié)構(gòu)中，在復(fù)雜的生物環(huán)境中可以控制內(nèi)部載荷的定位釋放，為智能藥物遞送體系的設(shè)計(jì)指明了方向. Bachelet等［31］基于這種結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)了多種邏輯門（AND，OR，XOR，NAND，NOT，CNOT 和半加法器），并研究了其在蟑螂（Blaberus discoidalis）體內(nèi)的動(dòng)態(tài)相互作用. 2018 年，Zhao等［101］設(shè)計(jì)了一種智能DNA納米機(jī)器，旨在將裝載于其內(nèi)腔的凝血酶遞送到腫瘤血管. AS1411適配體作為靶向基團(tuán)和響應(yīng)基團(tuán)，使DNA納米機(jī)器在腫瘤血管處定位開啟，進(jìn)而暴露出其內(nèi)部載荷凝血酶，導(dǎo)致血管阻塞并誘導(dǎo)腫瘤壞死. 在異種移植荷瘤小鼠模型和原發(fā)肺癌小鼠模型上的治療實(shí)驗(yàn)均表明，該DNA 納米機(jī)器可以選擇性地在腫瘤區(qū)域暴露凝血酶，誘導(dǎo)腫瘤血管發(fā)生血栓，實(shí)現(xiàn)對(duì)乳腺癌、卵巢癌、黑色素瘤和肺癌等惡性腫瘤的生長(zhǎng)抑制，延長(zhǎng)了小鼠的生存期. 此外，DNA納米機(jī)器在正常小鼠和巴馬小型豬身上展示出良好的生物安全性和免疫惰性，證明其具備臨床應(yīng)用的潛力.

Fig.5 DNA origami barrel for targeted transport of different payloads(A)[100], DNA origami nanocapsule for pH?controlled opening and cargo exposure(B)[102],acid responsive DNA origami?based vaccine for cancer immunotherapy(C) [57], tubular DNA nanodevice as siRNA/doxorubicin vehicle for cancer combined therapy(D)[103], DNA origami nanofactory for RNA production and processing(E)[104] and DNA nanodevice?based logic gating triggered by antigen(F)[106]（A）Copyright 2012，Springer Nature；（B）Copyright 2019，American Chemical Society；（C）Copyright 2020，Springer Nature；（D）Copyright 2020，Wiley Online Library；（E）Copyright 2020，American Chemical Society；（F）Copyright 2021，American Chemical Society.

DNA 三鏈體（DNA triplex）是由一條核酸單鏈通過(guò)Hoogsteen 堿基配對(duì)作用，與雙螺旋DNA 中的一條鏈通過(guò)氫鍵相連接而形成的一種三鏈結(jié)構(gòu)，具有酸響應(yīng)變構(gòu)的特性. 基于這一特性，Linko等［102］構(gòu)建了DNA納米膠囊，通過(guò)改變?nèi)芤簆H能可逆地控制膠囊的開合. 通過(guò)熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）驗(yàn)證了DNA納米膠囊的受控開合并且暴露內(nèi)部載荷分子（金球或酶）的過(guò)程. 此外，DNA納米膠囊的FRET效率在低鹽濃度下（近似于生理環(huán)境）沒有受到影響，只是DNA折紙結(jié)構(gòu)有輕微變形. 這表明DNA納米膠囊可以在活體下使用，具備體內(nèi)藥物遞送的可能［圖5（B）］. 最近，腫瘤疫苗展現(xiàn)了腫瘤高效治療的巨大潛力. Ding等［57］構(gòu)建了一種基于DNA折紙結(jié)構(gòu)的納米疫苗，旨在遞送腫瘤相關(guān)的抗原和佐劑.DNA納米裝置的內(nèi)腔中封裝了腫瘤相關(guān)抗原肽（OVA）和2種核酸類佐劑（dsRNA和環(huán)狀CpG），整個(gè)裝置被DNA三鏈體及其互補(bǔ)鏈通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)而鎖定. 通過(guò)皮下注射，DNA納米裝置在抗原遞呈細(xì)胞的溶酶體中酸化打開，從而暴露載荷以激活強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤消退. DNA納米裝置在荷瘤小鼠體內(nèi)明顯地刺激了免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致部分免疫指標(biāo)的上調(diào)，如細(xì)胞因子水平（TNF-α和IFN-γ）、CD80/86表達(dá)水平等，激活了抗原特異性T細(xì)胞，殺傷腫瘤細(xì)胞，在活體水平展示了對(duì)黑色素瘤、結(jié)腸癌等腫瘤的明顯抑制作用. 此外，該DNA納米裝置還可在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生長(zhǎng)效保護(hù)，抑制了腫瘤的復(fù)發(fā)［圖5（C）］.

還原型谷胱甘肽（GSH）可與二硫鍵相互作用使其斷裂，通常在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá). 基于這一特性，Ding 等［103］構(gòu)建了一種用于siRNA 和阿霉素等藥物遞送的管狀DNA 折紙載體，用于克服腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥性. 管狀DNA納米結(jié)構(gòu)被一系列二硫鍵封鎖，可以被胞質(zhì)內(nèi)的谷胱甘肽切割進(jìn)而暴露其內(nèi)腔中裝載的2 種siRNA（siBcl2 和siPgp），誘導(dǎo)細(xì)胞死亡. 在與阿霉素的協(xié)同治療作用下，該DNA 折紙載體顯著下調(diào)了細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白表達(dá)水平，并在荷瘤小鼠模型中顯示出良好的治療效果［圖5（D）］. 智能DNA折紙載體還可以選擇性地執(zhí)行預(yù)設(shè)功能. Shih等［104］報(bào)道了一種桶狀的DNA納米工廠，可以自主生產(chǎn)和加工RNA. 利用DNA折紙圓筒作為底盤，通過(guò)特定的DNA模板、RNA聚合酶和RNA內(nèi)切酶的空間排列，整合了滾環(huán)轉(zhuǎn)錄和RNA合成過(guò)程. 得益于DNA折紙的可尋址性和靈活性，DNA納米工廠有序地排布了多種功能分子，從而實(shí)現(xiàn)RNA 的連續(xù)生產(chǎn)和加工［圖5（E）］. Han等［105］構(gòu)建了一種可用于人體血漿的自主血液抗凝的智能DNA納米機(jī)器人. 桶狀DNA折紙結(jié)構(gòu)的內(nèi)腔中包含由DNA鏈組成的輸入傳感器、閾值控制器和抑制劑發(fā)生器等功能模塊，用于環(huán)境中凝血酶濃度的感知和捕獲. 當(dāng)凝血酶濃度達(dá)到一定閾值時(shí)，DNA納米機(jī)器人可以自主地捕獲凝血酶以降低環(huán)境濃度. 通過(guò)簡(jiǎn)單的算法和模塊化的設(shè)計(jì)，DNA納米機(jī)器人在體外和血漿中均表現(xiàn)出顯著的抗凝效果. 這種可以用于智能監(jiān)測(cè)和治療的DNA折紙載體極大地推動(dòng)了個(gè)性化和智能化治療的發(fā)展. 最近，Dietz等［106］設(shè)計(jì)了一種抗原特異性響應(yīng)的DNA二十面體折紙結(jié)構(gòu). DNA二十面體由20個(gè)相同的三角形DNA折紙塊通過(guò)形狀互補(bǔ)和Mg2+的橋接作用組裝而成. 成殼后三角形塊邊緣修飾的抗原可以與二價(jià)IgG結(jié)合，使DNA二十面體可以抵抗低Mg2+環(huán)境. 當(dāng)加入可溶性抗原將IgG置換下來(lái)后，DNA二十面體會(huì)發(fā)生解聚. 此外，將該結(jié)構(gòu)用于抗原驅(qū)動(dòng)的邏輯“AND”門的設(shè)計(jì)，在三角形塊上修飾2種不同的抗原，只有當(dāng)溶液中同時(shí)存在2種抗原時(shí)，才可以觸發(fā)結(jié)構(gòu)解聚. 這種可控解聚的DNA二十面體具有大尺寸的內(nèi)腔，實(shí)現(xiàn)了乙型肝炎病毒的裝載與可控釋放［圖5（F）］.

3 總結(jié)與展望

隨著結(jié)構(gòu)DNA 納米技術(shù)的飛速發(fā)展，DNA 折紙結(jié)構(gòu)作為新型藥物載體平臺(tái)已經(jīng)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景. 基于DNA 折紙技術(shù)的DNA 自組裝材料具有優(yōu)異的結(jié)構(gòu)可設(shè)計(jì)性和可編程性、表面可修飾性及良好的生物相容性等獨(dú)特性質(zhì)，這些特性使其能夠高效裝載治療成分，如小分子藥物、適配體、核酸藥物、蛋白質(zhì)和無(wú)機(jī)納米顆粒等. DNA折紙載體還可以有效解決藥物溶解性差、靶向性差及生物毒性大等問題，進(jìn)一步提高藥物治療效果. DNA折紙載體獨(dú)特的性能使其具有精確的腫瘤靶向性、多功能性、化學(xué)穩(wěn)定性以及可控藥物釋放的能力，在諸多方面切合腫瘤治療的需求.

盡管有關(guān)這種新型自組裝材料在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究已經(jīng)取得了諸多進(jìn)展，但在其臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化過(guò)程中仍然面臨著大量挑戰(zhàn). 首先，DNA折紙載體的體內(nèi)特性還待詳細(xì)闡明，包括藥代動(dòng)力學(xué)、細(xì)胞內(nèi)代謝途徑、體內(nèi)分布和清除機(jī)制等. DNA折紙結(jié)構(gòu)作為具有負(fù)電荷的聚電解質(zhì)組裝體，相對(duì)較高的表面電荷密度可能對(duì)其在體內(nèi)的循環(huán)、運(yùn)輸和清除行為產(chǎn)生較大影響. 此外，當(dāng)DNA折紙結(jié)構(gòu)進(jìn)入血液循環(huán)后，可能會(huì)被蛋白冠包裹或巨噬細(xì)胞內(nèi)吞而導(dǎo)致其失效. 聚乙二醇［107］和類肽［108］等陽(yáng)離子外殼包裹的DNA 折紙結(jié)構(gòu)已被證明能夠改善其生理環(huán)境穩(wěn)定性和體內(nèi)循環(huán)半衰期. Shih等［49］證明了增加DNA結(jié)構(gòu)的尺寸和緊密度可以提高其細(xì)胞內(nèi)化的效率. Cai等［50］提出DNA折紙結(jié)構(gòu)具有優(yōu)先的腎富集效應(yīng). 這些結(jié)果均在一定程度上闡明了DNA折紙結(jié)構(gòu)在體外和體內(nèi)的特性. 其次，DNA折紙載體在體內(nèi)的免疫原性也是一個(gè)重要的問題［109］. 雖然DNA 是一種天然存在于生物體內(nèi)的材料，但在某些情況下，如結(jié)構(gòu)中CpG 序列或某些特定序列的存在可能會(huì)引起免疫反應(yīng)［110］. 這對(duì)所使用的DNA 鏈的序列設(shè)計(jì)提出了要求. 作為DNA折紙載體向臨床應(yīng)用發(fā)展的必要條件，大規(guī)模、高純度制備上述DNA納米結(jié)構(gòu)也同樣是一大挑戰(zhàn). 基于固相合成的方法得到的DNA短鏈成本往往較高. 而對(duì)于DNA折紙結(jié)構(gòu)，除了數(shù)量眾多的DNA 短鏈，M13 骨架鏈的大量制備更是限制了其大量生產(chǎn). 針對(duì)這一問題，Dietz等［111］建立了一種利用生物技術(shù)大規(guī)模量產(chǎn)M13基因組及DNA短鏈的方法，將DNA折紙結(jié)構(gòu)的生產(chǎn)成本降至0.18歐元/毫克. 這相對(duì)于使用固相合成的DNA短鏈，成本降低了3個(gè)數(shù)量級(jí)，極大地推動(dòng)了DNA折紙載體向?qū)嶋H應(yīng)用的發(fā)展.

隨著對(duì)DNA折紙結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)、藥代動(dòng)力學(xué)、體內(nèi)代謝途徑及與相關(guān)疾病靶點(diǎn)相互作用認(rèn)識(shí)的不斷加深，未來(lái)基于DNA折紙載體的遞送系統(tǒng)有望實(shí)現(xiàn)個(gè)體化、定制化的疾病治療，即基于患者的疾病種類而設(shè)計(jì)更安全、高效的個(gè)性化DNA納米藥物，以最大限度地達(dá)到精準(zhǔn)治療的效果. 可編程性和空間可尋址性也使得DNA納米結(jié)構(gòu)成為控制功能元件納米尺度排列的最佳模板之一. 靶向配體或藥物分子可以在DNA折紙模板預(yù)先設(shè)計(jì)好的位點(diǎn)精確自組裝，其朝向和距離可以被精準(zhǔn)控制，有望進(jìn)一步誘導(dǎo)產(chǎn)生更強(qiáng)的治療效果. 此外，基于DNA折紙結(jié)構(gòu)的智能納米機(jī)器可以針對(duì)腫瘤微環(huán)境或腫瘤細(xì)胞做出特異性響應(yīng)，觸發(fā)機(jī)械變構(gòu)，以設(shè)計(jì)可用于級(jí)聯(lián)藥物遞送、時(shí)空可控釋放的DNA納米平臺(tái). DNA納米技術(shù)正處于高速發(fā)展時(shí)期，必將在未來(lái)的生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域逐漸釋放巨大潛力.