楊成，張燕飛，管宏新，陳一鳴，魏亮，鐘春龍

臨床中將顱內(nèi)動(dòng)脈血管先天異常等因素引發(fā)的局部血管壁損傷統(tǒng)稱為顱內(nèi)動(dòng)脈瘤，受血流動(dòng)力學(xué)負(fù)荷等因素影響，逐漸擴(kuò)大形成異常膨出[1]。顱內(nèi)動(dòng)脈瘤作為高致殘、致死的腦血管疾病對(duì)人類健康造成嚴(yán)重威脅。流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示，美國約有900萬顱內(nèi)動(dòng)脈瘤患者，占總?cè)丝诘?%，每年約有3萬人出現(xiàn)大腦蛛網(wǎng)膜下腔出血，其中40%是致命的；在中國，顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的發(fā)病率約為7%[2]。顱內(nèi)動(dòng)脈瘤根據(jù)病因可分為動(dòng)脈硬化性動(dòng)脈瘤、感染性動(dòng)脈瘤、外傷性動(dòng)脈瘤、先天性動(dòng)脈瘤等4種類型[3]。顱內(nèi)動(dòng)脈瘤早期無癥狀，但隨著病情轉(zhuǎn)移、發(fā)展，會(huì)因瘤體破裂而導(dǎo)致出血，如果瘤體破裂出血，可導(dǎo)致嚴(yán)重的蛛網(wǎng)膜下腔出血，出現(xiàn)嚴(yán)重的頭痛、頸部僵硬、嘔吐、體溫升高等癥狀，甚至意識(shí)模糊或昏迷[4]。miRNA屬于高保守性、內(nèi)源性非編碼小RNA，主要由核內(nèi)RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄而成，在進(jìn)行轉(zhuǎn)錄過程中能夠?qū)C(jī)體內(nèi)30%的編碼基因進(jìn)行調(diào)節(jié)。miR-143是人類5號(hào)常染色體編碼的miRNA，在血管平滑肌細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)，能夠有效調(diào)控平滑肌細(xì)胞表型，這一生物學(xué)反應(yīng)能夠促進(jìn)顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的發(fā)生發(fā)展，與顱內(nèi)動(dòng)脈瘤之間具有緊密關(guān)聯(lián)[5]。因此，本研究旨在探究上調(diào)miR-143對(duì)顱內(nèi)動(dòng)脈瘤模型大鼠的干預(yù)作用及作用機(jī)制，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1) 動(dòng)物：SPF級(jí)SD大鼠60只，購自河南中醫(yī)藥大學(xué)[許可證號(hào)：SYXK(豫)2020-0004)]，雌雄各半，月齡4～7(5.23±1.42)個(gè)月，體質(zhì)量250～305(263.63±26.12)g，光照12 h/d，在濕度24%～32%、溫度為(26.6±3.8)℃的環(huán)境下喂養(yǎng)1周。(2)試藥試劑：0.12%β-氨基丙腈、miR-143購自美國西格瑪—奧德里奇公司；轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1) ELISA試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA試劑盒購自武漢伊萊特生物科技股份有限公司；血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)ELISA試劑盒購自上海彩佑實(shí)業(yè)有限公司；基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)ELISA試劑盒購自南京賽泓瑞生物科技有限公司；MMP-9 ELISA試劑盒購自上海廣銳生物科技有限公司；TLR4抗體、Caspase-3抗體購自武漢益普生物科技有限公司，NF-κB抗體購自上海雅吉生物科技有限公司。(3)儀器設(shè)備：顯微鏡、離子濺射儀、冰箱購自北京索萊寶生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 2020年12月—2021年9月在同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。參考文獻(xiàn)[6]建立顱內(nèi)動(dòng)脈瘤大鼠模型。將60只大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、上調(diào)組和下調(diào)組，各15只。除空白組外，其余大鼠構(gòu)建顱內(nèi)動(dòng)脈瘤模型：腹腔注射1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉大鼠，取仰臥位，消毒后沿頸部正中縱向切開1.5 cm，顯微鏡下分離左側(cè)頸總動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈，使用8-0尼龍線依次結(jié)扎左側(cè)頸外動(dòng)脈、左側(cè)翼腭動(dòng)脈及右側(cè)頸總動(dòng)脈，最后逐層縫合?？瞻捉M：僅手術(shù)暴露血管但不結(jié)扎。通過電鏡判斷大鼠前交通動(dòng)脈復(fù)合體的成瘤情況來判斷建模是否成功，根據(jù)血管形態(tài)判斷瘤樣改變程度，共分4級(jí)：0級(jí)為血管管徑正常光滑；1級(jí)為血管管徑增大或出現(xiàn)粗糙樣改變；2級(jí)為血管出現(xiàn)不規(guī)則印記或局部出現(xiàn)淺梭形抬高；3級(jí)為血管上可觀察到囊狀動(dòng)脈瘤或血管局部存在動(dòng)脈瘤樣擴(kuò)張。其中1～3級(jí)為造模成功。構(gòu)建miR-143慢病毒載體：于建模成功后立即給予干預(yù)，上調(diào)組大鼠尾部注射30 mg/kg ago miR-143，下調(diào)組大鼠尾部注射30 mg/kg antago miR-143，正常組、模型組大鼠尾部注射等劑量生理鹽水。模型組另給予miR-143空載質(zhì)粒(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所)，均連續(xù)給藥7 d,做慢病毒滴度測定[病毒滴度為1×109轉(zhuǎn)導(dǎo)單位(TU)/ml)]。

1.3 觀測指標(biāo)與方法

1.3.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染：取對(duì)數(shù)生長期的腦動(dòng)脈瘤組織細(xì)胞(購自于上海佰曄生物公司)，將其分為空白組(不做任何處理的腦動(dòng)脈瘤組織細(xì)胞)、上調(diào)組(腦動(dòng)脈瘤組織細(xì)胞+miR-143 mimics)、下調(diào)組(腦動(dòng)脈瘤組織細(xì)胞+miR-143 inhibitor)，將100 μl 1×105個(gè)/ml細(xì)胞濃度的細(xì)胞懸液加入各組且設(shè)置2個(gè)復(fù)孔，當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期時(shí)，空白組加入常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)液做空白處理，上調(diào)組、下調(diào)組分別加入miR-143 mimics、Lipofectamine 2000試劑行上調(diào)轉(zhuǎn)染，miR-143 inhibitor、Lipofectamine 2000試劑行下調(diào)轉(zhuǎn)染。

1.3.2 miR-143基因表達(dá)檢測：在建模完成后3 d做miR-143轉(zhuǎn)染，大鼠45只以3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，將大鼠仰臥固定，手術(shù)區(qū)域酒精消毒。分離并結(jié)扎腎動(dòng)脈后支，同理結(jié)扎右側(cè)，取腹部正中切口，暴露膀胱，確定卵巢，結(jié)扎，逐層縫合皮膚關(guān)腹；手術(shù)完成后給予大鼠0.9%氯化鈉溶液、0.12%β-氨基丙腈飼養(yǎng)，最后鑒定轉(zhuǎn)染效率：Treg細(xì)胞總RNA、所提取的RNA濃度、完整性采用比色法測定，使用多基因梯度做實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)鑒定miR-143轉(zhuǎn)染效率，引物由北京天根生化科技有限公司合成。反應(yīng)過程為75 ℃預(yù)變性120 s，90 ℃變性5 min，60 ℃、60 s退火，72 ℃、30 s延伸，共行40個(gè)循環(huán)。以U6為內(nèi)參照，采用2-△△CT表示結(jié)果。β-actin上游引物:5'-TGACCCAGATCATGTTTG-3'，下游引物:5'-CTTTGCGGATGTCCACGTC-3'；miR-143上游引物:5'-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCCA-GAGAT-3'，

下游引物:5'-ACACTCCAGCTGGGGGTGCAGTGCTGCAT-3'。

1.3.3 血清TGF-β1、TNF-α、VEGF、MMP-2、MMP-9水平檢測：60只大鼠分別采集血樣本2 ml，靜置1 h，離心取上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測血清TGF-β1、TNF-α、VEGF、MMP-2、MMP-9。酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定吸光度(OD值)，計(jì)算樣品濃度。

1.3.4 TLR4、NF-κB、Caspase-3蛋白檢測：采用Western blot法檢測。取待檢大鼠顱內(nèi)動(dòng)脈組織蛋白加入RIPA裂解液裂解、勻漿，BCA試劑盒測定總蛋白濃度，SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜后，5%脫脂牛奶封閉2 h，加入一抗(TLR4抗體、NF-κB抗體、Caspase-3抗體，1∶1 000)，過夜孵育。加入二抗(山羊抗兔IgG，1∶5 000)孵育2 h，顯影、定影、沖洗、晾干，掃描膠片，采用Image J軟件分析TLR4、NF-κB、Caspase-3表達(dá)，以β-actin為內(nèi)參，目標(biāo)蛋白水平=目標(biāo)條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。

2 結(jié) 果

2.1 各組miR-143基因表達(dá)比較 miR-143基因表達(dá)量模型組(3.26±1.02)>空白組(1.20±0.31)，下調(diào)組(5.13±1.21)>模型組>上調(diào)組(2.42±0.58)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F/P=7.484/0.001)。

2.2 各組大鼠動(dòng)脈壁病理組織學(xué)觀察 空白組大鼠動(dòng)脈壁組織細(xì)胞呈線性排列，血管內(nèi)膜完整；模型組動(dòng)脈壁平滑肌排列較為紊亂，血管壁厚度不均勻，血管壁呈現(xiàn)膠原化；下調(diào)組大鼠動(dòng)脈壁血管壁局部變得較??；上調(diào)組平滑肌細(xì)胞紊亂減輕，血管壁局部增厚，見圖1。

圖1 各組大鼠動(dòng)脈壁病理表現(xiàn)(HE染色，×400)

2.3 各組大鼠顱內(nèi)動(dòng)脈瘤成瘤比較 空白組大鼠腦動(dòng)脈瘤瘤樣較輕；模型組動(dòng)脈瘤瘤樣改變，動(dòng)脈淺梭行抬高；下調(diào)組動(dòng)脈瘤瘤樣改變嚴(yán)重，動(dòng)脈瘤樣擴(kuò)張嚴(yán)重，動(dòng)脈淺梭行明顯抬高；上調(diào)組前交通復(fù)合體動(dòng)脈瘤瘤樣與空白組比較差異不大，部分動(dòng)脈管徑均勻迂曲擴(kuò)張，見圖2。

圖2 各組大鼠顱內(nèi)動(dòng)脈瘤電鏡觀察(×2 000)

2.4 各組大鼠血清TGF-β1、TNF-α、VEGF水平比較 模型組血清TGF-β1、TNF-α、VEGF水平明顯高于空白組，TGF-β1、TNF-α、VEGF水平下調(diào)組>模型組>上調(diào)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)，見表1。

表1 各組大鼠血清TGF-β1、TNF-α、VEGF水平比較

2.5 各組大鼠血清MMP-2、MMP-9水平比較 模型組血清MMP-2、MMP-9水平明顯高于空白組，而下調(diào)組>模型組>上調(diào)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表2。

表2 各組大鼠血清MMP-2、MMP-9水平比較

2.6 各組大鼠TLR4/NF-κB信號(hào)通路蛋白基因表達(dá)量比較 模型組TLR4、NF-κB、Caspase-3表達(dá)量高于空白組，而下調(diào)組>模型組>上調(diào)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖3、表3。

圖3 各組大鼠細(xì)胞TLR4/NF-κB信號(hào)通路蛋白表達(dá)比較

表3 大鼠顱內(nèi)動(dòng)脈瘤TLR4/NF-κB信號(hào)通路蛋白基因表達(dá)量比較

3 討 論

顱內(nèi)動(dòng)脈瘤是引起蛛網(wǎng)膜下腔出血的主要原因，在臨床腦血管意外中，僅次于高血壓腦出血、腦栓塞，位居第三位，任何年齡都可發(fā)生，而多數(shù)為40～60歲的中老年婦女[7]，臨床強(qiáng)調(diào)早診斷、早治療[8]。

目前顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的病因尚不清楚，有學(xué)者認(rèn)為顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的出現(xiàn)是由顱內(nèi)動(dòng)脈壁的局部先天缺陷和腔內(nèi)壓力增加所導(dǎo)致[9]。顱內(nèi)動(dòng)脈瘤多發(fā)生在Willis環(huán)內(nèi)，80%發(fā)生在Willis環(huán)的前半段。本結(jié)果顯示，上調(diào)miR-143可有效抑制顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的發(fā)生發(fā)展，為腦動(dòng)脈瘤的預(yù)后提供重要的臨床理論依據(jù)。

研究表明，miR-143對(duì)平滑肌細(xì)胞的表型有著較強(qiáng)的調(diào)控作用。馮明陶[10]研究顯示，在動(dòng)脈瘤形成過程中，顱內(nèi)Willis環(huán)miR-143表達(dá)下降，分泌型平滑肌細(xì)胞表達(dá)上升。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-143基因在顱內(nèi)動(dòng)脈瘤大鼠中表達(dá)量顯著上升，表明miR-143可能參與顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的發(fā)生、發(fā)展。

TGF-β1為具有雙向調(diào)節(jié)性的高分子多肽，是參與細(xì)胞增殖分化的主要調(diào)控因子。TGF-β1來源較廣，并以二聚體的形式發(fā)揮作用。TGF-β1是由2個(gè)潛在的相關(guān)多肽結(jié)合蛋白結(jié)合形成[11]。TNF-α能夠通過維持炎性反應(yīng)，削弱血管壁結(jié)構(gòu)，進(jìn)而導(dǎo)致顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的發(fā)生[12-15]。VEGF參與了血管內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)移、增殖，參與炎性浸潤、心血管生成等，也參與血管通透性的增加、細(xì)胞增殖、遷移、基質(zhì)的變性等反應(yīng)，不同類型的VEGF有不同作用機(jī)制[16-18]。本結(jié)果顯示，下調(diào)組血清TGF-β1、TNF-α、VEGF水平明顯高于上調(diào)組，說明TGF-β1、TNF-α、VEGF降低可有效保護(hù)大鼠腦組織，使內(nèi)皮細(xì)胞的通透性降低。其水平升高能夠抑制相關(guān)細(xì)胞的增殖遷移。

MMPs是一個(gè)擁有20多個(gè)成員的大家庭，主要分為基質(zhì)溶酶、明膠酶﹑膜蛋白酶等。MMPs能夠降解幾乎所有細(xì)胞外基質(zhì)成分。MMP-2和MMP-9在動(dòng)脈瘤形成中的作用越來越受到關(guān)注，腦動(dòng)脈瘤血管壁重構(gòu)過程中的重要改變是內(nèi)皮細(xì)胞的丟失、細(xì)胞外基質(zhì)的重構(gòu)[19-21]。當(dāng)MMPs在傷口愈合、炎性反應(yīng)、惡性腫瘤發(fā)生時(shí)迅速上升，當(dāng)MMP-2、MMP-9失調(diào)，可導(dǎo)致血管壁基質(zhì)的破壞和動(dòng)脈瘤形成[22-23]。本結(jié)果顯示，下調(diào)組MMP-2、MMP-9水平明顯高于上調(diào)組，說明MMP-2、MMP-9對(duì)顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的發(fā)展發(fā)生起到一定的延緩、預(yù)防作用。

NF-κB活化后不僅可以調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)中的基因,還可以上調(diào)炎性相關(guān)基因的表達(dá)。研究顯示,TLR2、3、4、9參與了肺中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性病變,其中TLR4信號(hào)傳導(dǎo)通路能夠在卒中、蛛網(wǎng)膜下腔出血后急性炎性腦損害中發(fā)揮主要作用[24]。本研究說明TLR4/NF-κB信號(hào)通路在應(yīng)激性疾病發(fā)病機(jī)制中起到重要作用，通過上調(diào)NF-κB和TLR4達(dá)到抗顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的效果，在應(yīng)激狀態(tài)下TLR4/NF-κB信號(hào)通路受到抑制,TLR4/NF-κB表達(dá)量明顯降低。

綜上所述，上調(diào)miR-143基因可作用于TLR4/NF-κB信號(hào)通路，有效抑制顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的發(fā)生發(fā)展，miR-143可以成為顱內(nèi)動(dòng)脈瘤診斷和病情判斷的分子標(biāo)志物。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

楊成、魏亮：設(shè)計(jì)研究方案，實(shí)施研究過程，論文撰寫、修改；張燕飛：提出研究思路，分析試驗(yàn)數(shù)據(jù);管宏新、陳一鳴：實(shí)施研究過程，資料搜集整理，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，論文撰寫;鐘春龍：課題設(shè)計(jì)，論文審核