甄錦程，穆玉婷，司 璐，于洪佳，都婷婷，單體江，徐利劍

（1黑龍江大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150080；2華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院/廣東省微生物信號(hào)與作物病害防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510642）

0 引言

真菌是重要的生物資源，目前報(bào)道的真菌已經(jīng)超過了15萬種，它們可以產(chǎn)生豐富的次生代謝產(chǎn)物，其中一些次生代謝產(chǎn)物可以開發(fā)成為藥物，應(yīng)用在醫(yī)藥與農(nóng)藥領(lǐng)域中，日益引起人們的重視，并顯示出廣闊的前景[1-2]。例如，抗生素青霉素、頭孢菌素、灰黃霉素，免疫抑制劑環(huán)孢菌素，以及農(nóng)藥甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑最初的活性成分，都與真菌的代謝產(chǎn)物有關(guān)[3-7]。在森林凋落物中，尚有大量可培養(yǎng)的、具有抗菌活性的真菌資源，可以為進(jìn)一步開發(fā)和利用凋落物真菌資源提供備選菌株。

真菌是森林系統(tǒng)中的重要分解者，森林凋落物也是真菌的良好棲息地，目前，研究證明森林凋落物與土壤中有大量的真菌資源，其中不乏真菌新物種[8]。在對(duì)大興安嶺及長白山森林凋落物的研究中，也相繼報(bào)道了多個(gè)真菌新物種，例如白色粘絲裸囊菌(Myxotrichum albicans)、長 白 黃 微 孢 菌(Parametarhizium changbaiense)和興安黃微孢菌(P.hingganense)[9-10]。在森林凋落物真菌活性方面，劉博洋等[11]分離培養(yǎng)了40株凋落物真菌，它們隸屬于35個(gè)屬38個(gè)分類單元，其中6株真菌為疑似真菌新種，來自2株真菌的2個(gè)提取物展現(xiàn)了抗細(xì)菌活性，尤其是Parapyenchaeta sp.LB0026菌株具有較強(qiáng)的抗革蘭氏陽性細(xì)菌活性。李澤宇等[12]利用顆粒法在大興安嶺凍土中得到66株可培養(yǎng)真菌，有8株為疑似真菌新物種，其中6株新型真菌的提取物具有抗菌活性。張哲棟等[13]分離得到88株森林凋落物真菌，其隸屬于57個(gè)屬74個(gè)分類單元，其中6株疑似真菌新種的提取物具有抗菌活性，在2株真菌中得到4個(gè)單體化合物，其中2個(gè)化合物為首次在真菌提取物中分離。邱天藝[14]分離得到70株大興安嶺森林凋落物真菌，隸屬于57個(gè)分類單元，21株真菌ITS相似性≤98.5%，其中17株真菌的乙酸乙酯提取物具有抗菌活性，經(jīng)代謝物分離得到4個(gè)單體化合物。

森林凋落物中含有大量未被開發(fā)利用的真菌資源，而且這些真菌具有抗菌活性，研究它們產(chǎn)生的代謝物，可以為森林凋落物真菌資源的利用提供備選菌株。本研究以大興安嶺森林凋落物為研究材料，嘗試分離其中可培養(yǎng)真菌，測(cè)試它們的抗植物病原菌活性，從63株真菌中選取未被深入研究的目標(biāo)菌株SGSF622(Berkleasmium sp.)，對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析與鑒定，并分離得到其主要抗菌化合物，以期為進(jìn)一步利用森林凋落物真菌產(chǎn)生的天然產(chǎn)物資源提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 樣品采集 森林凋落物樣品采集于黑龍江省大興安嶺地區(qū)加格達(dá)奇區(qū)南甕河國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)，該地區(qū)為寒溫帶大陸性氣候且受人類活動(dòng)影響較小，優(yōu)勢(shì)樹種為興安落葉松(Larix gmelinii)、蒙古櫟(Quercus mongolica)和水曲柳(Fraxinus mandshurica)等。將凋落物裝入滅過菌的信封中，于陰涼處自然風(fēng)干后保存。

1.1.2 培養(yǎng)基及配方 凋落物真菌培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)觀察所需培養(yǎng)基選用馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA)；凋落物真菌發(fā)酵所需培養(yǎng)基選用馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(PD)、大米固體培養(yǎng)基(Rice)、酵母浸提物蔗糖培養(yǎng)基(YES)和PDA；凋落物真菌發(fā)酵提取物抗細(xì)菌活性篩選選用LB固體培養(yǎng)基(LBA)，抗真菌活性篩選選用PDA。上述培養(yǎng)基配方參考李澤宇等[12]的研究。

1.1.3 供試植物病原菌 供試真菌為串珠鐮刀菌(Fusarium moniliforme)、立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)，供試細(xì)菌為青枯勞爾氏菌(Ralstonia solanacearum)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 凋落物真菌的分離 真菌分離方法采用顆粒平板稀釋法，取1 g凋落物粉碎后置于離心管中，加入適量無菌水，充分懸浮，用移液槍將懸浮液加入到1/4PDA培養(yǎng)基平板上，用三角棒均勻涂抹，室溫下培養(yǎng)，待菌落長出后用接菌針挑取至新的PDA平板上，進(jìn)行純化培養(yǎng)。

1.2.2 凋落物真菌的鑒定 觀察真菌的菌落、菌絲及孢子結(jié)構(gòu)形態(tài)，根據(jù)《真菌鑒定手冊(cè)》等相關(guān)文獻(xiàn)書籍和資料，進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定[15]。

分子生物學(xué)鑒定。首先利用CTAB法對(duì)真菌基因組DNA進(jìn)行提取[16]。然后，對(duì)真菌的內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer，ITS)序列進(jìn)行擴(kuò)增，引物分別為ITS1和ITS4[17]。將所得PCR產(chǎn)物，利用相同引物進(jìn)行測(cè)序，最后利用NCBI網(wǎng)站的BLAST(Basic Local Alignment Search Tool，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)進(jìn)行比對(duì)分析。遺傳系統(tǒng)進(jìn)化樹利用Mega 7.0軟件[18]獲得。對(duì)真菌DNA序列進(jìn)行分析，首先利用ClustalW進(jìn)行序列比對(duì)，然后進(jìn)行最優(yōu)進(jìn)化模型篩選(Find Best DNA Models)，再基于最優(yōu)模型，利用最大似然法(maximum likelihood，ML)[19]進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建。

1.2.3 菌株發(fā)酵及提取物的制備 真菌發(fā)酵分別采用PD、Rice、YES和PDA 4種培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵。液體發(fā)酵，置于25℃、180 r/min黑暗條件下的搖床中培養(yǎng)14天；固體發(fā)酵，放入25℃培養(yǎng)箱黑暗靜置培養(yǎng)14天。發(fā)酵結(jié)束后加入等體積乙酸乙酯充分搖勻，靜止1天后過濾除掉固體，用分液漏斗取上層有機(jī)相，再進(jìn)行減壓濃縮，得到乙酸乙酯提取物，溶解于1 mL二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)配制成待測(cè)樣品，每株菌得到4種發(fā)酵方式的乙酸乙酯提取物，待抗菌活性篩選用。

1.2.4 抗菌活性測(cè)定 采用平板打孔藥劑擴(kuò)散法測(cè)定提取物的抗菌活性[20]。

抗真菌活性測(cè)定。在PDA平板四周上均勻打6 mm孔，依次加入同一株菌的不同發(fā)酵方式的10 μL提取物溶液，然后將測(cè)試真菌菌餅接入到培養(yǎng)基中心，放在25℃培養(yǎng)箱內(nèi)黑暗培養(yǎng)3～7天。

抗細(xì)菌活性測(cè)定。用移液槍吸取15 mL待測(cè)細(xì)菌菌液，加入到250 mL融化的LB固體培養(yǎng)基中，搖勻后倒成平板。同上文方法，在平板上均勻打孔，孔中加入提取物溶液，25℃培養(yǎng)箱內(nèi)黑暗培養(yǎng)1天。選用兩性霉素與金霉素作為陽性對(duì)照，測(cè)量抑菌圈直徑，以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.2.5 抗菌化合物的追蹤分離與鑒定 對(duì)目標(biāo)菌株進(jìn)行發(fā)酵，提取3次后，得到其乙酸乙酯提取物。將提取物溶液與3 g的100～200目硅膠樣品混合均勻干燥，干法上樣至200～300目硅膠柱上。利用甲醇與二氯甲烷溶液進(jìn)行梯度洗脫，每個(gè)梯度洗脫1 L，得到30個(gè)組分標(biāo)記為S1～S30。進(jìn)行抗菌活性測(cè)定，將活性組分利用葡聚糖凝膠Sephadex LH20進(jìn)行柱層析，洗脫劑為等量的甲醇與二氯甲烷溶液，進(jìn)行等度洗脫，流速約為5 s一滴，利用薄層層析(TLC)合并相似組分[21]。采用半制備液相、C18反向硅膠柱、甲醇-水系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫，利用紫外檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，獲得單體化合物。將單體化合物進(jìn)行核磁共振氫譜(1H-NMR)、碳譜(13C-NMR)及高分辨質(zhì)譜(HR-ESI-MS)分析，通過查閱文獻(xiàn)進(jìn)行化合物的結(jié)構(gòu)鑒定。

1.2.6 單體化合物最低抑菌濃度的測(cè)定 參照張哲棟等[13]的方法。單體化合物鑒定后使用96孔(12×8)平板測(cè)定其最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)，用DMSO溶液將單體化合物及陽性對(duì)照金霉素溶解為濃度2000 μg/mL的溶液。在250 mL的三角瓶中放入50 mL的LB液體培養(yǎng)基和2 mL的測(cè)試細(xì)菌菌液充分混勻，每一個(gè)孔都加入100 μL的菌液，后吸取配制好的單體化合物溶液在第1列中加入100 μL，用移液槍將其與混勻后，再吸取100 μL到第2列，依次加到第11列。棄去在第11列吸取的100 μL混合液，并在第12列以DMSO溶液作為陰性對(duì)照。每個(gè)化合物進(jìn)行3次重復(fù)。密封后放到25℃的培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，24 h后觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 凋落物真菌的分離與鑒定

來自大興安嶺的森林凋落物中共分離到63株真菌，經(jīng)過ITS序列對(duì)比分析可以發(fā)現(xiàn)，以上真菌來自于子囊菌門(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)和被孢霉門(Mortierellomycota)3個(gè)門、8個(gè)綱、12個(gè)目、22個(gè)科、36個(gè)屬、48個(gè)分類單元。分離菌株ITS序列在與已知真菌的對(duì)比中，相似性98.5%以下的有14株（表1），針對(duì)這14株真菌進(jìn)行進(jìn)一步的抗菌活性研究。

表1 凋落物真菌ITS序列相似性分析

2.2 疑似新種抗菌活性測(cè)定結(jié)果

針對(duì)ITS相似性98.5%以下的14株真菌進(jìn)行抗植物病原菌活性的研究，其中11株表現(xiàn)出了抗菌活性，結(jié)果見表2。其中，6株具有抗真菌活性，菌株SGSF622抗真菌活性最強(qiáng)；10株具有抗青枯勞爾氏菌的活性，其中菌株SGSF622也顯示出最強(qiáng)的抗細(xì)菌活性。根據(jù)表1可知，其最相近菌為Berkleasmium屬真菌。

表2 提取物抗菌活性

2.3 SGSF622號(hào)菌株的特征

菌株SGSF622號(hào)菌株在PDA培養(yǎng)基上25℃培養(yǎng)21天，菌落直徑達(dá)到23 mm（圖1），菌落呈圓形，灰褐色，有放射狀溝紋；菌落背面，灰褐色，邊緣為白色；氣生菌絲呈天鵝絨狀，具有分枝，有隔，未見明顯孢子。菌株SGSF622的最相近菌為Berkleasmium屬真菌，相似性為91%。將與SGSF622相近的Berkleasmium屬真菌的已知物種與SGSF622的ITS序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析（圖2），結(jié)果顯示SGSF622號(hào)菌株與Berkleasmium屬真菌的B.nigroapicale、B.micronesicum、B.ariense形成一個(gè)高支持度的獨(dú)立分枝，且與B.ariense的2株菌最近，位于它們的基部，由此推測(cè)SGSF622可能為Berkleasmium屬的新物種，具有進(jìn)一步研究價(jià)值。

圖1 SGSF622在PDA培養(yǎng)基上菌落形態(tài)學(xué)

圖2 SGSF622號(hào)菌株系統(tǒng)發(fā)育分析

2.4 SGSF622號(hào)菌提取物化合物的分離鑒定

對(duì)菌株SGSF622號(hào)菌進(jìn)行了PDA固體培養(yǎng)基的發(fā)酵，獲得3 g乙酸乙酯提取物。利用青枯勞爾氏菌進(jìn)行抗菌活性追蹤，得到單體化合物622A、622B、622C，其中化合物622A含量最高。化合物622A為白色粉末狀固體，易溶于甲醇、二氯甲烷和氯仿等有機(jī)溶劑。該化合物的13C-NMR(101 MHz，CDCl3)共有20個(gè)峰，它們的化學(xué)位移值為δ 149.60、147.10、147.06、134.17、131.46、129.66、127.75、127.50、122.86、121.82、121.17、121.13、120.11、112.80、110.01、109.18、97.50、61.89、52.64、50.59。高分辨質(zhì)譜的分子離子峰m/z為369.0521[M+H]+，分子式為C20H13ClO5，經(jīng)文獻(xiàn)查詢比對(duì)，將該化合物鑒定為螺二萘類化合物Sch53825[22]，其結(jié)構(gòu)如圖3所示。此外還分離了622B和622C 2個(gè)化合物，它們的碳譜與622A相似，也為螺二萘類化合物，具體結(jié)構(gòu)尚未確定。

圖3 單體化合物622A的化學(xué)結(jié)構(gòu)

對(duì)已經(jīng)確定結(jié)構(gòu)的單體化合物622A，利用青枯勞爾氏菌進(jìn)行了最低抑菌濃度的測(cè)定，當(dāng)化合物622A濃度高于125 μg/mL時(shí)無測(cè)試菌生長，化合物622A對(duì)青枯勞爾氏菌的MIC值為125～250 μg/mL。

3 結(jié)論與討論

本研究對(duì)來自大興安嶺的森林凋落物的真菌進(jìn)行了抗菌活性的研究，共分離得到63株真菌，它們隸屬為36個(gè)屬48個(gè)分類單元，它們中有14株菌ITS相似性小于98.5%，可見森林凋落物中真菌多樣性較為豐富，其中不乏未被開發(fā)利用的真菌。通過抗菌活性測(cè)試發(fā)現(xiàn)6株真菌提取物具有抗真菌活性、10株具有抗細(xì)菌活性，其中SGSF622號(hào)菌展現(xiàn)了廣譜的抗菌活性。經(jīng)鑒定SGSF622號(hào)菌為Berkleasmium屬真菌，Berkleasmium屬建立于1958年，SGSF622在ITS序列上與該屬已知物種不同，對(duì)其進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化分析與鑒定，SGSF622號(hào)菌與Berkleasmium ariense最近[23]，但不相同，推測(cè)SGSF622可能為一新物種。Berkleasmium屬真菌曾被報(bào)道過具有抗真菌、抗細(xì)菌及抗腫瘤活性，2009年Cai等[24]報(bào)道從內(nèi)生菌Berkleasmiumsp.Dzf12發(fā)酵液中分離得的螺二萘類化合物Diepoxin η和Diepoxin ζ的混合物以及Diepoxin κ對(duì)大腸桿菌(Escherichia coli)、根瘤土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)、番 茄 瘡 痂 病 菌(Xanthomonas vesicatoria)、黃瓜角斑病菌(Pseudomonas lachrymans)和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)等有較好的抑制活性，Diepoxin ζ對(duì)稻瘟病菌(Pyricularia oryzae)的半抑制濃度(IC50)和最低抑菌濃度(MIC)分別為96.21和200 μg/mL[25]。2014年Shan等[26]的研究結(jié)果表明，螺二萘類化合物Diepoxin δ和Palmarumycin C8具有較好的細(xì)胞毒活性，IC50值的范圍在1.28～5.83μmol/L，進(jìn)一步研究結(jié)果表明Palmarumycin C8對(duì)多種細(xì)菌和真菌都具有一定的抑制作用?？梢姡珺erkleasmiumsp.Dzf12與本研究的SGSF622都可以產(chǎn)生螺二萘類化合物。雖然Berkleasmium屬真菌曾被報(bào)道分離鑒定了多個(gè)螺二萘類化合物，但本研究鑒定的622A(Sch53825)未曾報(bào)道在該屬真菌中分離鑒定，本研究也是首次報(bào)道了大興安嶺凋落物真菌可以產(chǎn)生螺二萘類化合物。另外化合物Sch53825最初被分離自1株未被鑒定的真菌，報(bào)道了該化合物具有抑制磷脂酶D的活性，但缺乏該真菌的相關(guān)描述[22]，未見有關(guān)化合物Sch53825的抗菌活性的相關(guān)報(bào)道。本研究首次發(fā)現(xiàn)了螺二萘類化合物Sch53825具有抗植物病原菌的活性。螺二萘類化合物被認(rèn)為擁有良好的生物活性[27]，具有被開發(fā)成農(nóng)藥及醫(yī)藥的潛力。本研究豐富了真菌產(chǎn)螺二萘類化合物及其活性的研究，證明Berkleasmium屬的不同真菌具有產(chǎn)生不同螺二萘類化合物的能力。

綜上，本研究分離了63株凋落物真菌，對(duì)其中一株菌SGSF622進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析，將其初步鑒定為Berkleasmium sp.，由于現(xiàn)有條件下未觀察到它的產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)等形態(tài)學(xué)特征，其分類學(xué)地位還有待深入研究。通過對(duì)其次生代謝研究，確定了其可以產(chǎn)生螺二萘類化合物Sch53825，但是否可能產(chǎn)生其他螺二萘類化合物或者其他類天然產(chǎn)物，還有待深入研究。