王麗梅 李國平 陳余朋 鄭珂

口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinomas， OSCC)是一種致命的疾病，由于腫瘤侵襲性、頸部淋巴結轉移和最終的血行轉移導致不良的預后[1-2]。盡管在診斷和治療策略方面取得了很大進展，但由于腫瘤復發(fā)和轉移， 50% OSCC患者仍在5 年內(nèi)死亡，因而OSCC診斷與治療的關鍵還在于探索出更加有效的預后相關因子[3-4]。

過氧化物還原素(peroxiredoxins，PRDXs)由6 個小的抗氧化同工酶(PRDX1-6)組成，屬于氧化還原家族蛋白，其廣泛分布在人體各組織中[5]。在這6 類PRDXs中，只有PRDX4位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，參與調(diào)節(jié)過氧化物酶活性和氧化還原的過程[5-6]。由細胞內(nèi)氧化還原平衡的破壞所引起的氧化應激，與腫瘤干細胞的生存和增殖密切相關，已有研究表明其表達失調(diào)促進多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展5,7]?，F(xiàn)有關于PRDX4在OSCC中的相關研究尚少，與各臨床病理參數(shù)之間的相關關系也并不明確。為了進一步驗證PRDX4在口腔鱗狀細胞癌發(fā)生發(fā)展中的作用，本研究通過免疫組化檢測108 例OSCC病例標本中PRDX4的表達及與上皮間質(zhì)轉化相關蛋白E-cad及Vimentin表達，分析PRDX4表達與各臨床病理因素及預后的關系及其與E-cad及Vimentin表達的相關性，探討其可能機制，為OSCC治療和預后評估提供潛在標記物。

1 資料與方法

1.1 病例選擇

納入2012 年1 月～2016 年12 月在福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院口腔頜面頭頸外科手術的108 例 OSCC 患者。

納入標準： (1)原發(fā)于口腔的鱗狀細胞癌且術前未接受放射治療或化學治療; (2)切除組織包括腫瘤組織及其周圍正常組織; (3)手術包括行原發(fā)灶切除及頸淋巴結清掃; (4)具有完整的臨床及病理資料。

排除標準： (1)術前接受過放射治療或化學治療的口腔鱗狀細胞癌病例; (2)手術僅行原發(fā)灶切除而未進行頸淋巴結清掃; (3)繼發(fā)累及口腔的鱗狀細胞癌; (4)病例臨床及病理資料不全。 腫瘤的組織病理分級采用世界衛(wèi)生組織(WHO，2016)推薦的標準，臨床分期根據(jù) AJCC第八版pTNM分期標準進行分期。隨訪用電話及門診電子病歷系統(tǒng)隨訪，確診之日為隨訪開始時間，終止事件因腫瘤而死亡，排除非腫瘤的相關死亡。

1.2 組織芯片的制作

每例病例均由病理醫(yī)師選擇兩處代表性腫瘤組織區(qū)域及一處對照正常組織區(qū)域，使用打孔器在供體蠟塊的相應位置進行穿刺取樣。然后，將穿刺所得的微圓柱形結構植入預先制備的受體蠟塊的陣列孔中。

1.3 免疫組織化學

抗體使用以下濃度：PRDX4抗體(184167， 1∶1 000，Abcam，英國)；E-cad(MX020，1∶300)、vimentin(福州邁新V9，1∶1 000)，操作步驟嚴格按試劑盒說明進行。

1.4 結果判定

PRDX4及Vimentin染色以細胞漿出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽性； E-cad染色以胞膜出現(xiàn)黃色或棕黃色為陽性。采取二次計分法：每例標本隨機選取5 個高倍視野(×400)計數(shù)陽性細胞所占腫瘤細胞數(shù)的百分比計分，陽性細胞數(shù)<5%為0 分；陽性細胞數(shù)5%～30%為1 分；陽性細胞數(shù)31%～60%為2 分；陽性細胞數(shù)>60%為3 分。染色強度計分： 0 分為無色， 1 分為淡黃色， 2 分為棕黃色， 3 分為棕褐色。用染色強度得分和染色百分比得分的乘積作為判斷標準， 0～3 分為陰性(-)， 3～6 分為弱陽性(+)， >6 分為強陽性(++)。

1.5 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 23.0統(tǒng)計進行數(shù)據(jù)分析。運用秩和檢驗分析癌組織、癌旁正常組織中PRDX4的表達情況，運用非參數(shù)檢驗及多元Logistic有序回歸分析PRDX4表達與OSCC病理特征的關系，利用Spearman相關性分析對PRDX4與E-cad、Vimentin之間相關關系進行分析，Kaplan-Meier方法對患者隨訪的生存情況進行分析。

2 結 果

2.1 OSCC中PRDX4的表達及其與臨床病理的關系

通過免疫組織化學檢測 PRDX4在108 對OSCC及正常組織中的表達情況，結果顯示在口腔鱗狀細胞癌組織種PRDX4表達陽性率為68.5%(74/108)，癌旁正?？谇簧掀颖局蠵RDX4表達陽性率為4.6%(5/108)，PRDX4在口腔癌組織中高表達(P<0.001)(表 1)。PRDX4的表達與腫瘤組織分化程度、淋巴結轉移情況及神經(jīng)侵犯情況有關(P<0.05)；與患者的性別、年齡、TNM分期及淋巴間質(zhì)及脈管癌栓無關(P>0.05)(圖 1， 表 2)。通過進一步Logistic回歸分析，發(fā)現(xiàn)腫瘤分化程度低(低分化vs高分化，OR=6.579，P=0.002)、有淋巴結轉移(OR=2.375，P=0.039)是PRDX4高表達的獨立危險因素 (表 3)。

表 1 口腔鱗狀細胞癌組織及癌旁正常組織中PRDX4的表達

圖 1 PRDX4在正常鱗狀上皮及不同分化程度的口腔鱗狀細胞癌中表達情況(IHC, ×200)

表 2 口腔癌中PRDX4的表達與臨床病理參數(shù)的相關性

表 3 影響PRDX4表達的多元Logistic回歸分析

2.2 OSCC中PRDX4與E-cad和Vimentin表達的關系

分析OSCC腫瘤組織中PRDX4、E-cad及Vimentin的表達情況(圖 2)，統(tǒng)計學分析結果顯示：PRDX4與Vimentin的表達呈正相關(r=0.313，P=0.001)，與E-cad的表達呈負相關(r=-0.327,P=0.001)。

圖 2 PRDX4、 Vimentin及E-cad的表達(IHC， ×200)

2.3 OSCC患者PRDX4的表達與預后的關系

Kaplan Meier生存分析結果顯示PRDX4的表達與OSCC患者總體生存時間顯著相關，PRDX4高表達組(強陽性組)總體生存時間顯著低于低表達組(陰性或弱陽性)(Log Rankχ2=9.936，P=0.002)(圖 3)。

圖 3 不同PRDX4表達水平OSCC患者總生存率的K-M分析

3 討 論

口腔癌是全球第六大最常見的癌癥，每年約超過30 萬新增病例，其中OSCC約占口腔癌的90%[8]。OSCC對患者的生活質(zhì)量有極大影響，同時也危及著患者的生命，其中高淋巴結轉移率是造成OSCC預后不良的主要因素之一[6,9]。

PRDX4是一種主要的抗氧化劑，越來越多的證據(jù)表明它在多種腫瘤侵襲和轉移中的作用。在乳腺癌和結腸癌中，PRDX4的升高與遠處轉移相關[10-11]。在前列腺癌中，PRDX4的高表達與腫瘤分期的增加相關[12]。在對該院口腔頜面頭頸手術108 例OSCC患者的研究中，結果證實了PRDX4在OSCC組織中的表達水平明顯高于癌旁正常組織。這與既往PRDX4在前列腺癌、結腸癌、乳腺癌中表達升高究結論相似，提示PRDX4可能參與多種腫瘤包括口腔鱗狀細胞癌的發(fā)生[5]。本研究還發(fā)現(xiàn)PRDX4表達與腫瘤分化程度、淋巴結轉移及神經(jīng)侵犯相關，提示PDRX4可能參與OSCC腫瘤的進展；在生存分析曲線中顯示，PRDX4高表達患者的預后較低表達者差，提示PRDX4可能作為OSCC的預后預測因素；結果與于玢玢等[9]報道一致。

本研究進一步通過Logistic回歸分析多因素與PRDX4表達關系，發(fā)現(xiàn)腫瘤淋巴結轉移及分化程度低是影響PRDX4的表達的獨立危險因素。Capilla等[13]報道了淋巴結轉移是導致OSCC患者死亡的主要因素之一。但是根據(jù)組織病理學檢查在臨床淋巴結檢測陰性的OSCC患者中，實際淋巴結轉移的發(fā)生率為34%[6]。故對于活檢標本PRDX4表達較高的OSCC患者，術前影像學評估淋巴結轉移掃描應更全面，有助于更準確的臨床評估及預后預測。

有報道表明，PRDX4可通過上皮-間充質(zhì)轉換(EMT)參與調(diào)控腫瘤的進展[7,14]。EMT的分子特征是E-cad下調(diào)，Vimentin、N-cadherin等上調(diào)[15]。E-cad是一種維持上皮細胞與細胞間穩(wěn)定接觸的跨膜糖蛋白，E-cad低表達與預后密切相關，也促進各種上皮癌的侵襲和轉移[16-18]。Vimentin是誘導EMT過程的重要間葉標記[19]。為了進一步探討PRDX4與EMT的關系，本課題研究了PRDX4與E-cad及Vimentin表達之間的關系，結果顯示，在OSCC中PRDX4的表達與E-cad的表達呈負相關，即隨著PRDX4的表達水平升高，E-cad的表達水平明顯下降；PRDX4的表達與Vimentin的表達呈正相關，即隨著PRDX4表達水平的上升，Vimentin的表達水平明顯升高，由此表明PRDX4的過表達可能與EMT相關，通過促進腫瘤侵襲及轉移參與了OSCC的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，本研究證實PRDX4在OSCC組織中高表達，且其的表達水平與OSCC的分化程度、淋巴結轉移情況及生存時間呈現(xiàn)相關性，隨著PRDX4的表達水平的增高，OSCC分化越差、越容易發(fā)生淋巴結轉移，生存期越短，其可能作為判斷 OSCC 患者預后的標志物并且是OSCC治療的潛在靶標，PRDX4與Vimentin的表達呈正相關，而與E-cad的表達呈負相關，表明PRDX4可能通過EMT促進OSCC的發(fā)生發(fā)展。但在探討PRDX4在OSCC發(fā)生發(fā)展中的機制方面，本實驗僅研究了其與E-cad及Vimentin之間的相關關系，還有待進一步深入研究。