湯雪齡， 劉 柳， 蔣沛月

浙江大學醫(yī)學院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院婦產(chǎn)科，杭州 310003

宮頸癌(cervical cancer，CC)是發(fā)病率較高且死亡率較高的婦科惡性腫瘤，其發(fā)病率近年來呈增高及年輕化趨勢，嚴重威脅女性的生命安全。宮頸癌發(fā)生及發(fā)展過程涉及多基因、多因素，而宮頸癌轉(zhuǎn)移是導致患者治療效果降低及預(yù)后差的主要原因[1-2]。環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)具有閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)控基因表達從而參與細胞生物學過程。circGFRA1是近年來研究比較多的一種circRNA。報道顯示，circGFRA1可通過調(diào)節(jié)微小RNA(microRNA，miRNA)表達，調(diào)節(jié)RNA結(jié)合蛋白與核轉(zhuǎn)錄參與或影響惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展，如circGFRA1在膠質(zhì)瘤細胞中表達水平升高，下調(diào)circGFRA1可促進microRNA-99a表達并抑制膠質(zhì)瘤細胞增殖和遷移。研究表明circRNA在宮頸癌中表達異常，并可參與宮頸癌發(fā)生及發(fā)展過程[3-5]。但circGFRA1對宮頸癌細胞生物學行為的影響及其可能作用機制報道較少。另外，miR-138-5p在宮頸癌細胞表達水平較低，提高其表達水平能夠抑制宮頸癌細胞增殖及轉(zhuǎn)移[6]。我們研究團隊進行的預(yù)實驗顯示，circGFRA1與miR-138-5p存在靶向關(guān)系，但尚未有學者闡明circGFRA1/miR-138-5p分子軸在宮頸癌發(fā)生及發(fā)展過程中的具體機制。因此，本研究通過分析circGFRA1能否靶向調(diào)控miR-138-5p表達從而調(diào)節(jié)宮頸癌細胞生物學行為，為宮頸癌的防治提供參考，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 臨床資料及實驗試劑

選取2020年3月至2020年7月浙江大學醫(yī)學院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院確診的宮頸癌患者共45例，取其癌組織及其癌旁組織(≥5 cm處的組織)標本，癌組織均經(jīng)病理學診斷確診為宮頸癌?；颊吣挲g48～66歲，平均年齡(53.38±4.16)歲。組織標本在術(shù)后轉(zhuǎn)移至-80℃超低溫冰箱保存。排除標準：合并其他惡性腫瘤患者；術(shù)前接受放療或化療患者。納入本研究患者均簽署知情同意書，且研究中收集的臨床資料及研究結(jié)果均采取保密措施，不做其他用途，本研究已獲浙江大學醫(yī)學院倫理委員會批準。

DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、胰蛋白酶、MTT試劑均購自上海碧云天生物公司；Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司；Trizol試劑購自美國Thermo Fisher公司；反轉(zhuǎn)錄與SYBR Green試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；si-NC、si-circGFRA1、anti-miR-NC、anti-miR-138-5p、miR-NC、miR-138-5p mimics均購自廣州銳博生物科技有限公司；Transwell小室購自美國Corning公司；Matrigel基質(zhì)膠購自美國BD公司；RIPA裂解液、BCA蛋白定量檢測試劑盒均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；野生型載體wt-circGFRA1、突變型載體mut-circGFRA1及其活性檢測試劑盒均購自美國Promega公司；兔抗人Bax、Bcl-2抗體與內(nèi)參GAPDH抗體均購自美國Abcam公司。

1.2 細胞轉(zhuǎn)染及分組

將宮頸癌SiHa細胞放入含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。將SiHa細胞接種到6孔板，當細胞生長融合達到70%時轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染方法：將不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液分別與si-NC、si-circGFRA1、anti-miR-NC、anti-miR-138-5p混合，室溫孵育5 min(A液)，將不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液與Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑充分混合(B液)，A液與B液充分混勻后室溫孵育20 min，按分組將混合液加入6孔板中，每孔200 μL，置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)6 h，棄培養(yǎng)液，更換為含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h。實驗分組：采用上述轉(zhuǎn)染方法將si-NC、si-circGFRA1分別轉(zhuǎn)染至SiHa細胞，分別記為si-NC組、si-circGFRA1組；將si-circGFRA1和anti-miR-NC轉(zhuǎn)染至SiHa細胞，記為si-circGFRA1+anti-miR-NC組；將si-circGFRA1和anti-miR-138-5p轉(zhuǎn)染至SiHa細胞，記為si-circGFRA1+anti-miR-138-5p組。

1.3 qRT-PCR檢測circGFRA1、miR-138-5p的表達水平

采用Trizol試劑提取宮頸癌組織、癌旁組織及SiHa細胞內(nèi)總RNA，應(yīng)用Nanodrop2000c超微量分光光度計檢測RNA濃度與純度。反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并進行PCR擴增反應(yīng)，反應(yīng)體系：SYBR Green Master Mix 10 μL，正、反向引物各0.8 μL，cDNA 2 μL，ddH2O補足至20 μL。反應(yīng)條件：95℃ 5 min、95℃ 30 s、60℃ 30 s、7℃ 30 s，共循環(huán)40次。circGFRA1的內(nèi)參為GAPDH，miR-138-5p的內(nèi)參為U6，采用2-ΔΔCt法分別計算circGFRA1、miR-138-5p相對表達量。

1.4 雙熒光素酶報告實驗檢測circGFRA1與miR-138-5p的靶向關(guān)系

預(yù)測circGFRA1與miR-138-5p存在結(jié)合位點，將結(jié)合位點、突變位點克隆至pmirGLO載體，得到野生型載體wt-circGFRA1、突變型載體mut-circGFRA1，將miR-NC、miR-138-5p mimics分別與wt-circGFRA1、mut-circGFRA1共轉(zhuǎn)染至SiHa細胞，培養(yǎng)48 h后，收集轉(zhuǎn)染細胞，采用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測熒光素酶活性。采用“1.2”方法將si-NC、si-circGFRA1分別轉(zhuǎn)染至SiHa細胞，培養(yǎng)48 h后，采用qRT-PCR法檢測細胞miR-138-5p相對表達量。

1.5 MTT檢測細胞增殖

收集各組SiHa細胞并接種于96孔板，1×103個/孔，每孔加20 μL MTT溶液，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，4 h后丟棄培養(yǎng)液，加入二甲基亞砜(150 μL/孔)，采用酶標儀檢測各孔吸光度(A)值，計算細胞增殖抑制率=[(對照組A值-實驗組A值)/(對照組A值-空白組A值)×100%]。

1.6 平板克隆形成實驗

將各組SiHa細胞接種于6孔板，500個/孔，接種后培養(yǎng)14 d，14 d后丟棄培養(yǎng)液，用PBS溶液沖洗，甲醇固定細胞20 min，結(jié)晶紫染色15 min，顯微鏡下觀察克隆形成數(shù)。

1.7 Transwell實驗檢測細胞遷移及侵襲

遷移實驗：收集各組SiHa細胞加入小室的上室，1×105個/孔，下室加入500 μL培養(yǎng)液(20%胎牛血清)，進行48 h培養(yǎng)，用多聚甲醛進行固定20 min，固定完畢后采用PBS溶液沖洗，0.1%結(jié)晶紫染液染色10 min，顯微鏡下觀察細胞并計算穿過小室的細胞數(shù)。侵襲實驗：將Matrigel基質(zhì)膠按一定比例稀釋后，每孔45 μL加入小室的上室，37℃凝固2 h，收集各組SiHa細胞加入小室的上室，1×105個/孔，后續(xù)實驗步驟同遷移實驗。

1.8 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率

將各組SiHa細胞使用0.25%胰蛋白酶進行細胞消化，3000 r/min離心6 min(離心半徑15 cm)，棄上清液，加入500 μL提前預(yù)冷的PBS緩沖液重懸細胞，再依次加入Annexin Ⅴ-FITC與PI各5 μL，混勻后靜置10 min，采用FACS Calibur流式細胞儀及Cellauest軟件檢測細胞凋亡情況。

1.9 Western blot檢測Bax、Bcl-2蛋白表達量

采用RIPA裂解液提取SiHa細胞的總蛋白，BCA法測定其濃度。將40 μg蛋白進行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，4℃加入按比例稀釋好的Bax、Bcl-2一抗與內(nèi)參GAPDH抗體，24 h后室溫加入二抗稀釋液，1 h后滴加ECL顯影，采用Image J軟件分析條帶灰度值，計算Bax、Bcl-2蛋白的相對表達。

1.10 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 circGFRA1、miR-138-5p在宮頸癌中的表達

與癌旁組織比較，宮頸癌組織中circGFRA1的表達量升高(P<0.05)，miR-138-5p的表達量降低(P<0.05)，見圖1。

A：宮頸癌中circGFRA1高表達；B：宮頸癌中miR-138-5p低表達；與癌旁組織比較，*P<0.05圖1 宮頸癌中circGFRA1、miR-138-5p表達的檢測Fig.1 Detection of circGFRA1 and miR-138-5p in cervical cancer tissues

2.2 circGFRA1靶向調(diào)控miR-138-5p

circGFRA1和miR-138-5p存在結(jié)合位點，見圖2A。miR-138-5p高表達對wt-circGFRA1的熒光素酶活性產(chǎn)生抑制作用(P<0.05)，對mut-circGFRA1熒光素酶活性無明顯影響，見圖2B。

與其在si-NC組的表達相比較，si-circGFRA1組miR-138-5p的表達量顯著升高(P<0.05)，見圖2C。

A：circGFRA1和miR-138-5p的互補序列；B：雙熒光素酶報告實驗；C：circGFRA1調(diào)控miR-138-5p的表達；與miR-NC組比較，*P<0.05；與si-NC組比較，#P<0.05圖2 circGFRA1靶向調(diào)控miR-138-5pFig.2 Targeted regulation of miR-138-5p by circGFRA1

2.3 circGFRA1和miR-138-5p對宮頸癌SiHa細胞增殖的影響

與si-NC組比較，si-circGFRA1組細胞增殖抑制率升高(P<0.05)，細胞克隆形成數(shù)減少(P<0.05)；與si-circGFRA1+anti-miR-NC組比較，si-circGFRA1+anti-miR-138-5p組細胞增殖抑制率降低(P<0.05)，細胞克隆形成數(shù)增多(P<0.05)，見圖3、表1。

圖3 circGFRA1和miR-138-5p對宮頸癌SiHa細胞克隆形成的影響Fig.3 Effect of circGFRA1 and miR-138-5p on the colony formation of SiHa cells

表1 circGFRA1和miR-138-5p對宮頸癌SiHa細胞增殖的影響Table 1 Effect of circGFRA1 and miR-138-5p on proliferation of SiHa

2.4 circGFRA1和miR-138-5p對宮頸癌SiHa細胞遷移、侵襲的影響

與si-NC組比較，si-circGFRA1組遷移及侵襲細胞數(shù)減少(均P<0.05)；與si-circGFRA1+anti-miR-NC組比較，si-circGFRA1+anti-miR-138-5p組遷移及侵襲細胞數(shù)增多(均P<0.05)，見圖4、表2。

圖4 circGFRA1和miR-138-5p對宮頸癌SiHa細胞遷移、侵襲的影響Fig.4 Effect of circGFRA1 and miR-138-5p on migration and invasion of SiHa cells

表2 circGFRA1和miR-138-5p對宮頸癌SiHa細胞遷移、侵襲的影響Table 2 Effect of circGFRA1 and miR-138-5p on migration and invasion of SiHa

2.5 circGFRA1和miR-138-5p對宮頸癌SiHa細胞凋亡的影響

與si-NC組比較，si-circGFRA1組細胞凋亡率和Bax蛋白水平升高(均P<0.05)，Bcl-2蛋白水平降低(P<0.05)；與si-circGFRA1+anti-miR-NC組比較，si-circGFRA1+anti-miR-138-5p組細胞凋亡率和Bax蛋白水平降低(均P<0.05)，Bcl-2蛋白水平升高(P<0.05)，見圖5、表3。

1：si-NC；2：si-circGFRA1；3：si-circGFRA1+anti-miR-NC；4：si-circGFRA1+anti-miR-138-5p；A：circGFRA1和miR-138-5p對宮頸癌SiHa細胞凋亡率的影響；B：circGFRA1和miR-138-5p對宮頸癌SiHa細胞凋亡相關(guān)蛋白表達的檢測圖5 circGFRA1和miR-138-5p對宮頸癌SiHa細胞凋亡的影響Fig.5 Effect of circGFRA1 and miR-138-5p on apoptosis of SiHa cells

表3 circGFRA1和miR-138-5p對宮頸癌SiHa細胞凋亡的影響Table 3 Effect of circGFRA1 and miR-138-5p on apoptosis of SiHa

3 討論

circRNA作為一種新型的非編碼RNA，通過典型的3′，5′-磷酸二酯鍵具有穩(wěn)定的閉環(huán)結(jié)構(gòu)。雖然circRNA被認為是RNA的異常剪接產(chǎn)物，但越來越多的證據(jù)表明circRNA參與各種生物學過程，例如circRNA可競爭性地結(jié)合miRNA，從而參與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。circRNA具有多個miRNA的結(jié)合位點，即circRNA可通過調(diào)控多個miRNA調(diào)節(jié)多種惡性腫瘤細胞的生物學行為[7-9]。circGFRA1是最近發(fā)現(xiàn)的與多種惡性腫瘤相關(guān)的circRNA，并在多種惡性腫瘤中呈高表達，如circGFRA1在三陰性乳腺癌中表達上調(diào)，并可促進三陰性乳腺癌細胞生長及轉(zhuǎn)移，下調(diào)的circGFRA1可通過調(diào)節(jié)miR-361-5p表達抑制三陰性乳腺癌對紫杉醇的耐藥性[10-11]。研究顯示，circGFRA1在惡性肝細胞癌中表達水平顯著升高，并作為miR-149的海綿分子而促進肝細胞癌細胞血管生成、細胞增殖及遷移[12]；circGFRA1在卵巢癌組織和細胞中表達水平升高，并可促進卵巢癌細胞增殖[13]；還有研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，circGFRA1可充當miR-188-3p的海綿分子而促進非小細胞肺癌發(fā)展進程[14]。本研究結(jié)果顯示，在宮頸癌組織中circGFRA1表達量升高，干擾circGFRA1表達可增加宮頸癌細胞抑制率，減少克隆數(shù)、遷移和侵襲細胞數(shù)，提示干擾circGFRA1可抑制宮頸癌細胞增殖、克隆形成、遷移及侵襲。Bcl-2與Bax定位于線粒體基質(zhì)中，當細胞受到信號刺激后會轉(zhuǎn)移至線粒體外膜，Bax可通過增強線粒體外膜的通透性，此時跨膜電壓下降，線粒體中細胞色素等蛋白質(zhì)被釋放從而促進細胞凋亡[15]。本研究結(jié)果顯示，干擾circGFRA1表達后宮頸癌細胞凋亡率和Bax蛋白水平升高，Bcl-2蛋白水平顯著降低，提示干擾circGFRA1表達可促進宮頸癌細胞凋亡。類似的研究亦顯示，干擾circGFRA1表達可降低神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細胞的活力、集落形成、增殖和遷移潛力[5]。

miR-138在脊椎動物中多為高度保守，miR-138-5p屬于miR-138家族成員，位于染色體Xq38.13，研究顯示，miR-138-5p不僅在帕金森病、椎間盤蛻變過程中發(fā)揮作用，在惡性腫瘤組織中也呈異常表達[16]。研究顯示，miR-138-5p在宮頸癌細胞中表達下調(diào)，過表達miR-138-5p可抑制宮頸癌細胞增殖、遷移和侵襲能力[17-18]。miR-138-5p通過靶向調(diào)控foxc1表達而有效抑制前列腺癌細胞生長和轉(zhuǎn)移[19]。本研究結(jié)果顯示，宮頸癌組織和細胞中miR-138-5p的表達量降低，circGFRA1可靶向結(jié)合miR-138-5p，抑制miR-138-5p表達的同時還能逆轉(zhuǎn)干擾circGFRA1對宮頸癌細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響。通過雙熒光素酶報告實驗進一步證實circGFRA1與miR-138-5p存在靶向關(guān)系。以上結(jié)果提示，一方面，circGFRA1可靶向結(jié)合miR-138-5p，影響宮頸癌發(fā)生發(fā)展，miR-138-5p有望成為宮頸癌診治的潛在標記物；另一方面，circGFRA1可能作為宮頸癌治療的新的潛在重要靶點。

綜上所述，circGFRA1在宮頸癌高表達，干擾circGFRA1能抑制宮頸癌細胞增殖、克隆形成、遷移及侵襲，并對細胞凋亡具有促進作用，可能與調(diào)控miR-138-5p有關(guān)，circGFRA1可能作為宮頸癌治療的潛在重要靶點，具體作用機制尚需進一步探究。