李 鵬， 陳丹丹， 蔡 琳， 李 思， 彭曉紅

武漢市第四醫(yī)院麻醉科，武漢 430022

滋養(yǎng)層細胞是組成胎盤組織的主要細胞之一，其遷移和侵襲能力類似于腫瘤細胞[1]。滋養(yǎng)細胞正常的增殖、侵襲能力對胎盤血管重塑、胎兒營養(yǎng)物質輸送具有重要作用，但其增殖及侵襲能力異常是導致絨毛膜癌、妊娠糖尿病、流產(chǎn)、子癇前期等妊娠期疾病發(fā)生的重要原因[2]。滋養(yǎng)層細胞侵襲能力調(diào)控機制的研究，對闡明人類多種妊娠疾病的發(fā)生發(fā)展具有重要意義?；|金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)可在絨毛膜滋養(yǎng)層細胞入侵和改造螺旋動脈的過程中起重要作用[3]，血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)可在滋養(yǎng)層細胞入侵子宮內(nèi)膜、轉化子宮內(nèi)壁血管過程中發(fā)揮作用[4-5]，且VEGF及MMP-9也是腫瘤遷移及侵襲的重要調(diào)控因子[6]。丙泊酚為腫瘤切除手術時施行全身麻醉的常用麻醉藥之一[7]，且越來越多研究發(fā)現(xiàn)，其可抑制人類腫瘤細胞的侵襲能力[8]，但丙泊酚是否也能影響人類滋養(yǎng)層細胞的增殖、侵襲能力還未見報道。本研究利用體外培養(yǎng)的人絨毛外滋養(yǎng)層細胞，從VEGF/MMP-9通路角度探究丙泊酚對滋養(yǎng)層細胞侵襲能力的影響，以期為人類妊娠疾病的治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑與儀器

人類絨毛外滋養(yǎng)層細胞株HTR8-SVneo細胞由第四軍醫(yī)大學王曉紅教授饋贈。

DMEM/F12培養(yǎng)液(北京百奧萊博科技有限公司，貨號：SNM544-SCD)；丙泊酚(上海晶抗生物工程有限公司，貨號：JKG8628)；MTT試劑盒(上海恒斐生物科技有限公司，貨號：M1020)；BD生物涂層基質侵襲室試劑盒(北京沃比森科技有限公司，貨號：BD2025)；VEGF、MMP-9、CD34、人類白細胞抗原G(HLA-G)、蘋果酸脫氫酶(MDH)、細胞骨架相關蛋白(prefoldin 1)抗體(美國Abcam公司，貨號：ab27278，ab76003，ab81289，ab134743，ab181857，ab151708)；熒光顯微鏡(日本奧林巴斯，型號：Olympus BX63)。

1.2 細胞培養(yǎng)及處理

取人類絨毛外滋養(yǎng)層細胞株HTR8-SVneo常規(guī)復蘇后，用DMEM/F12培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)進行常規(guī)傳代培養(yǎng)。待細胞融合度達60%左右時，取對數(shù)期細胞，以1×105個/孔的密度接種于6孔板內(nèi)，并進行如下處理：①取HTR8-SVneo細胞，分別在培養(yǎng)液中加入終濃度為0、10、25、50、100、200 μmol/L的丙泊酚溶液培養(yǎng)72 h，用MTT法及Western blot法檢測不同濃度丙泊酚干預下細胞活力及MMP-9、VEGF蛋白表達；②取HTR8-SVneo細胞，加入終濃度為100 μmol/L丙泊酚溶液，分別檢測細胞在培養(yǎng)0、8、12、24、72 h時的細胞活力及MMP-9、VEGF蛋白表達水平；③取HTR8-SVneo細胞轉染含VEGF過表達序列的腺病毒載體(ad-VEGF)及不含VEGF過表達序列的腺病毒空載體(ad-NC)，并設置對照組、丙泊酚組、ad-VEGF組、ad-NC組、丙泊酚+ad-VEGF組。對照組在正常條件下培養(yǎng)24 h；丙泊酚組在對照組基礎上加入終濃度為100 μmol/L丙泊酚溶液干預培養(yǎng)；ad-VEGF組及ad-NC組轉染ad-VEGF或對照腺病毒空載體6 h后，在正常條件下培養(yǎng)24 h；丙泊酚+ad-VEGF組在丙泊酚組基礎上轉染ad-VEGF；各組均培養(yǎng)24 h后，檢測細胞活力，侵襲能力，HLA-G、MDH、prefoldin 1蛋白表達及MMP-9、VEGF、CD34陽性表達水平。

1.3 MTT法檢測細胞活力

取1.2項中處理后的各組細胞，每孔加入濃度為5 mg /mL的MTT溶液20 μL，培養(yǎng)箱中放置4 h后，棄上清，每孔加入二甲基亞砜(DMSO)溶液150 μL搖床振蕩10 min后，在490 nm波長下，用酶標儀讀取各組吸光度(A)值，根據(jù)公式，細胞存活率=(對照組A值-給藥組A值)/對照組A值×100%，計算出各組細胞存活率，存活率越大，預示細胞活力越強。

1.4 Western blot法檢測細胞MMP-9、VEGF、HLA-G、MDH、prefoldin 1蛋白表達

收集各組細胞，裂解并抽提蛋白，BCA法測蛋白濃度后，取100 μg蛋白樣品行電泳及轉膜，加入一抗[MMP-9、VEGF、HLA-G、MDH、prefoldin 1抗體(1∶500)，內(nèi)參GAPDH(1∶800)]，4℃孵育過夜，辣根過氧化物酶標記的IgG二抗(1∶2000)室溫孵育1.5 h，ELC顯影曝光，化學發(fā)光成像分析系統(tǒng)拍照并分析灰度值。每組實驗重復3次。

1.5 改良版基底膜基質Boyden室檢測細胞侵襲能力

按說明書方法制備溶膠，4℃過夜，冰臺上用磷酸緩沖液∶膠(1∶6)制備稀Matrigel膠，每孔加入40 μL Matrigel膠工作液浸潤，37℃過夜后。上室及下室分別加入600 μL及100 μL培養(yǎng)液平衡12 h。取1.2項③方法下的各組細胞，重懸成濃度為1×108個/mL的細胞懸液，在基質包被的濾器中接種含胎牛血清的細胞懸液，室溫孵育24 h后，取出小室，清洗膜，固定，染色，記錄已經(jīng)通過濾器的細胞數(shù)目，細胞數(shù)目越多代表細胞侵襲能力越強。實驗重復3次。

1.6 免疫熒光檢測細胞MMP-9、VEGF陽性表達

取1.2項③方法下的各組細胞，棄去培養(yǎng)液，4%多聚甲醛固定15 min，0.1%曲拉通透化、5%胎牛血清封閉后，加入一抗(MMP-9、VEGF，1∶200)室溫孵育2 h，加入熒光二抗室溫孵育1 h，DAPI復染后，防猝滅液封片，于熒光顯微鏡下觀察，拍照并評估熒光強度。

1.7 免疫細胞化學法檢測細胞CD34陽性表達水平

取1.2項③方法下的各組細胞，棄去培養(yǎng)液，4%多聚甲醛固定后，PBS漂洗3次，加入3%過氧化氫，PBS再漂洗3次，加入山羊血清封閉10 min，加入一抗(CD34，1∶300)4℃孵育過夜，加入二抗(1∶500)室溫孵育1.5 h，加入辣根酶標記鏈卵白素工作液室溫孵育20 min，DAB顯色、中性樹脂封片，光鏡下觀察拍照，用Image Pro Plus 5.0圖像分析系統(tǒng)分析單位面積內(nèi)細胞陽性染色吸光度值。

1.8 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 不同濃度丙泊酚對細胞活力及VEGF、MMP-9蛋白表達的影響

丙泊酚處理72 h，隨著丙泊酚濃度(0～100 μmol/L)升高，細胞活力呈逐漸下降趨勢，細胞VEGF、MMP-9蛋白表達逐漸下降(均P<0.05)，并在100～200 μmol/L時，細胞活力及VEGF、MMP-9蛋白表達趨于平衡。見圖1、圖2、表1。

與0 μmol/L組比較，*P<0.05圖1 不同濃度丙泊酚對HTR8-SVneo細胞存活率的影響(MTT檢測)Fig.1 Effect of different concentrations of propofol on the survival rate of HTR8-SVneo cells(MTT test)

圖2 不同濃度丙泊酚處理對HTR8-SVneo細胞VEGF、MMP-9蛋白表達的影響(Western blot法)Fig.2 Effect of different concentrations of propofol on VEGF and MMP-9 protein expression in HTR8-SVneo cells(Western blot)

表1 不同濃度丙泊酚處理條件下HTR8-SVneo細胞VEGF、MMP-9蛋白表達的比較Table 1 Comparison of VEGF and MMP-9 protein expression in HTR8-SVneo cells treated with propofol at different concentrations of

2.2 丙泊酚處理不同時間對細胞活力及VEGF、MMP-9蛋白表達的影響

100 μmol/L丙泊酚處理不同時間(0、8、12、24、72 h)后，細胞隨著丙泊酚處理時間延長，細胞活力呈逐漸下降趨勢，細胞VEGF、MMP-9蛋白表達逐漸下降(均P<0.05)，并在24～72 h時，細胞活力及VEGF、MMP-9蛋白表達趨于平衡。見圖3、圖4、表2。

與0 h組比較，*P<0.05圖3 丙泊酚不同處理時間對HTR8-SVneo細胞存活率的影響(MTT檢測)Fig.3 Effect of propofol treatment for different time durations on the survival rate of HTR8-SVneo cells(MTT test)

圖4 丙泊酚不同處理時間對HTR8-SVneo細胞VEGF、MMP-9蛋白表達的影響(Western blot法)Fig.4 Effect of propofol treatment for different time durations on VEGF and MMP-9 protein expression in HTR8-SVneo cells(Western blot)

表2 丙泊酚處理不同時間后HTR8-SVneo細胞VEGF、MMP-9蛋白表達的比較Table 2 Comparison of VEGF and MMP-9 protein expression in HTR8-SVneo cells treated with propofol

2.3 丙泊酚處理或過表達VEGF對細胞活力的影響

與對照組[(100.00±0.00)%]相比，丙泊酚組[(53.69±5.05)%]細胞活力降低(P<0.05)；ad-VEGF組[(146.79±10.05)%]細胞活力升高(P<0.05)。與丙泊酚組相比，丙泊酚+ad-VEGF組[(100.66±5.11)%]細胞活力升高(P<0.05)。ad-NC組[(101.59±5.12)%]及丙泊酚+ad-VEGF組，與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。

2.4 丙泊酚處理或過表達VEGF對細胞侵襲能力的影響

與對照組(223.35±10.06)相比，丙泊酚組(151.55±10.63)細胞侵襲數(shù)目減少，侵襲能力降低(P<0.05)；ad-VEGF組(362.53±10.99)細胞侵襲能力升高(P<0.05)。與丙泊酚組相比，丙泊酚+ad-VEGF組(247.07±12.08)細胞侵襲能力升高(P<0.05)。ad-NC組(221.06±10.58)與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖5。

A：對照組；B：丙泊酚組；C：ad-VEGF組；D：丙泊酚+ad-VEGF組；E：ad-NC組圖5 各組細胞侵襲能力檢測(×40)Fig.5 Cell invasion in each group(×40)

2.5 丙泊酚處理或過表達VEGF對細胞VEGF及MMP-9陽性表達的影響

免疫熒光結果顯示，VEGF及MMP-9在對照組HTR8-SVneo滋養(yǎng)細胞胞質中呈強陽性表達。與對照組比較，丙泊酚組VEGF及MMP-9陽性表達減弱(均P<0.05)；ad-VEGF組細胞VEGF及MMP-9陽性表達增強(均P<0.05)。與丙泊酚組相比，丙泊酚+ad-VEGF組細胞VEGF及MMP-9陽性表達增強(均P<0.05)。ad-NC組及丙泊酚+ad-VEGF組與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)，見圖6、表3。

圖6 各組細胞VEGF及MMP-9免疫熒光染色圖(×200)Fig.6 Immunofluorescence staining of VEGF and MMP-9 in cells in each group(×200)

表3 細胞VEGF及MMP-9陽性表達的比較Table 3 Comparison of VEGF and MMP-9 expression in

2.6 丙泊酚處理或過表達VEGF對細胞CD34陽性表達的影響

CD34為微血管密度升高的標志蛋白，CD34可在對照組細胞胞質中呈強陽性表達。與對照組(0.99±0.05)相比，丙泊酚組細胞CD34陽性表達(0.35±0.03)減弱(P<0.05)；ad-VEGF組細胞CD34陽性表達(1.68±0.13)增強(P<0.05)。與丙泊酚組相比，丙泊酚+ad-VEGF組細胞CD34陽性表達(0.92±0.05)增強(P<0.05)。ad-NC組(0.93±0.06)及丙泊酚+ad-VEGF組與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)，見圖7。

A：對照組；B：丙泊酚組；C：ad-VEGF組；D：丙泊酚+ad-VEGF組；E:ad-NC組圖7 各組細胞CD34免疫細胞化學染色圖(×400)Fig.7 Immunocytochemical staining of CD34 cells in each group(×400)

2.7 丙泊酚處理或過表達VEGF對細胞HLA-G、MDH、prefoldin 1蛋白表達的影響

與對照組比較，丙泊酚組細胞HLA-G、MDH、prefoldin 1蛋白表達降低(均P<0.05)；ad-VEGF組細胞HLA-G、MDH、prefoldin 1蛋白表達升高(均P<0.05)。與丙泊酚組相比，丙泊酚+ad-VEGF組細胞HLA-G、MDH、prefoldin 1蛋白表達升高(均P<0.05)。ad-NC組及丙泊酚+ad-VEGF組，與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)，見圖8、表4。

A：對照組；B：丙泊酚組；C：ad-VEGF組；D：丙泊酚+ad-VEGF組；E：ad-NC組圖8 各組細胞HLA-G、MDH、prefoldin 1蛋白表達(Western blot)Fig.8 HLA-G，MDH and prefoldin 1 protein expression in cells in each group(Western blot)

表4 各組細胞HLA-G、MDH、prefoldin 1蛋白表達的比較Table 4 Comparison of HLA-G，MDH and prefoldin 1 protein expression in cells in each group

3 討論

正常情況下，絨毛外滋養(yǎng)層細胞在囊胚著床后開始分化，遷移、侵襲至子宮脫膜層及基層血管，啟動螺旋動脈重塑，建立母胎循環(huán)，維持妊娠進行[9]。Heidari等[10]發(fā)現(xiàn)，絨毛外滋養(yǎng)層細胞侵入過度可引起絨毛膜癌、妊娠糖尿病等疾病的發(fā)生；Ding等[11]發(fā)現(xiàn)絨毛外滋養(yǎng)層細胞增殖能力降低、凋亡增加、侵襲能力不足，可引起胎盤功能障礙，導致流產(chǎn)、子癇前期等妊娠期疾病的發(fā)生，證實滋養(yǎng)層細胞增殖和侵襲過深或者過淺均可引起各種妊娠疾病的發(fā)生。故探究滋養(yǎng)層細胞增殖、侵襲的調(diào)控機制，對闡明多種妊娠疾病的發(fā)生發(fā)展機制具有重要意義。

丙泊酚為子癇前期剖宮術[12]、人工流產(chǎn)術[13]等妊娠疾病手術過程中的常用麻醉劑，大量研究證實，其對腫瘤增殖、侵襲能力有抑制作用[14-15]，但丙泊酚是否能影響絨毛外滋養(yǎng)層細胞的增殖、侵襲能力，并影響妊娠疾病的發(fā)生發(fā)展，還未見報道。本研究發(fā)現(xiàn)，在0～100 μmol/L濃度的丙泊酚培養(yǎng)條件下，絨毛外滋養(yǎng)層細胞HTR8-SVneo增殖能力、與侵襲相關蛋白VEGF及MMP-9表達均呈劑量及時間依賴性降低，提示丙泊酚也可抑制絨毛外滋養(yǎng)層細胞增殖、侵襲能力。

VEGF及MMP-9為絨毛外滋養(yǎng)層細胞入侵子宮內(nèi)壁過程中的重要調(diào)控因子。滋養(yǎng)層細胞中的HLA-G可促進MMP-9降解細胞外基質，調(diào)控與糖代謝有關的酶——MDH及與細胞骨架運動有關蛋白prefoldin 1的表達，來促進滋養(yǎng)層細胞的入侵、粘附及運動[16]。Zhong等[17]在子癇前期及胎兒宮內(nèi)生長受限等妊娠疾病的胎盤組織中檢測到MMP-9表達的降低。黑色素瘤轉移抑制基因編碼的肽類激素，能刺激胞外調(diào)節(jié)激酶磷酸化，抑制滋養(yǎng)層細胞MMP及VEGF表達來抑制滋養(yǎng)層細胞向子宮內(nèi)壁侵襲及植入[18]。Pan等[19]發(fā)現(xiàn)，胎盤中VEGF表達降低可引起滋養(yǎng)層細胞侵入缺陷、胎盤淺表著床、胎盤絨毛缺血低氧、胎盤血管重塑障礙，導致流產(chǎn)的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)，用丙泊酚處理后，HTR8-SVneo細胞胞質中VEGF及MMP-9陽性表達及微血管密度生成標志蛋白CD34表達降低的同時，細胞增殖、侵襲能力顯著降低，與侵襲功能相關的蛋白HLA-G、MDH、prefoldin 1表達也明顯降低。這與Xu等[20]發(fā)現(xiàn)的丙泊酚通過抑制VEGF/MMP-9通路蛋白表達來抑制食管癌的增殖及侵襲相一致。本研究進一步發(fā)現(xiàn)過表達VEGF可明顯促進絨毛外滋養(yǎng)層細胞HTR8-SVneo增殖及侵襲能力，逆轉丙泊酚對絨毛外滋養(yǎng)層細胞增殖及侵襲的抑制作用。

綜上所述，丙泊酚可能通過抑制VEGF/MMP-9通路蛋白表達，抑制滋養(yǎng)層細胞增殖活力及侵襲能力。這可能為妊娠糖尿病、絨毛膜癌等因滋養(yǎng)層細胞過度侵入引起的妊娠疾病的治療提供一定依據(jù)。但滋養(yǎng)層細胞增殖活力及侵襲能力的調(diào)控機制復雜，體內(nèi)與體外研究差異可能較大，丙泊酚在多種妊娠疾病治療中的作用及機制，還需進一步探究。