曹晶晶， 李居怡， 曾 娟， 李 軍， 王 奕， 唐 求△

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢中心醫(yī)院 1腫瘤科 2藥學(xué)部，武漢 430024

膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見(jiàn)、具高度侵襲性及較高死亡率惡性腫瘤[1]。膠質(zhì)瘤具有易遷移和侵襲、凋亡抵抗和基因組不穩(wěn)定等特點(diǎn)，雖然目前在治療策略上取得了一定進(jìn)展，如免疫治療、立體定向放療、新型化療藥物等已應(yīng)用于臨床，但由于膠質(zhì)瘤易轉(zhuǎn)移、易復(fù)發(fā)導(dǎo)致其死亡率仍較高[2-3]。因發(fā)病機(jī)制尚未明確，膠質(zhì)瘤的治療效果仍不理想[4]。此外，膠質(zhì)瘤干細(xì)胞(glioma stem cells，GSCs)是具有自我更新能力的膠質(zhì)瘤細(xì)胞亞群[5-6]，因其對(duì)化療和放療的強(qiáng)抗性而增加了膠質(zhì)瘤的治療難度[7]。因此，在細(xì)胞水平上探索膠質(zhì)瘤的發(fā)生過(guò)程及復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移機(jī)制是非常有必要的。

NHE5是一種鈉-氫交換蛋白，其mRNA和蛋白表達(dá)最早在腦組織中被發(fā)現(xiàn)，是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)pH和細(xì)胞體積的重要膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，主要在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系C6中表達(dá)，在正常的星形膠質(zhì)細(xì)胞中沒(méi)有被檢測(cè)到，在C6細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)過(guò)程中起關(guān)鍵作用[8-9]。NHE5通過(guò)在再循環(huán)內(nèi)體和細(xì)胞質(zhì)膜之間循環(huán)并酸化再循環(huán)內(nèi)體囊泡而發(fā)揮作用[10]。已有研究表明，在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系C6中NHE5的表達(dá)水平明顯升高，在膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲中發(fā)揮重要作用[11]。關(guān)于NHE5與不同分子信號(hào)通路之間的關(guān)系已受到廣泛關(guān)注[12]，但是其在膠質(zhì)瘤轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制仍然有待深入研究。

微小RNA(microRNAs，miRNA)是一種小的非編碼RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)節(jié)基因表達(dá)，參與腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移[13-14]。miR-22-3p是位于17號(hào)染色體上的含有22個(gè)核苷酸的非編碼RNA，在不同的癌癥中調(diào)控多種腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)[15]。但是miR-22-3p與神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲的關(guān)系仍然不清楚。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)是一組含有200個(gè)核苷酸以上的RNA序列，在細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲、凋亡和其他生物學(xué)過(guò)程中扮演重要角色[16]。lncRNA NEAT1(lncRNA nuclear enriched abundant transcript 1)在不同種類的腫瘤中作為癌基因發(fā)揮著重要作用，可以調(diào)控多種miRNAs的表達(dá)[17-18]。經(jīng)過(guò)生物信息學(xué)軟件DIANA的預(yù)測(cè)，lncRNA NEAT1與miR-22-3p存在潛在的結(jié)合位點(diǎn)。因此，本研究旨在探討lncRNA NEAT1影響膠質(zhì)瘤侵襲和遷移等過(guò)程的相關(guān)分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料

膠質(zhì)瘤細(xì)胞系C6，正常星形膠質(zhì)細(xì)胞(ATCC，美國(guó))，PCR引物和試劑盒(TaKaRa，日本)，si-NHE5、si-NEAT1、miR-22-3p模擬物(mimic)和抑制劑(inhibitor)及相關(guān)引物(Invitrogen，美國(guó))，lipofectamine 2000(Invitrogen，美國(guó))，DMEM、胎牛血清(Gibco，美國(guó))，Trizol(Invitrogen，美國(guó))，結(jié)晶紫染色液(Sinopharm Chemical Reagent，中國(guó))，Matrigel(BD，美國(guó))，RIPA、BCA蛋白檢測(cè)試劑盒、PVDF膜(Invitrogen，美國(guó))，NHE5抗體(Abcam，美國(guó))，β-actin抗體(Sigma，美國(guó))，辣根過(guò)氧化物酶二抗(Abcam，美國(guó))。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，在37℃，5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染依據(jù)lipofectamine使用說(shuō)明進(jìn)行操作。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 運(yùn)用Trizol法提取細(xì)胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用一步法試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，檢測(cè)miR-22-3p、NHE5和NEAT1的相對(duì)表達(dá)量。相對(duì)表達(dá)量運(yùn)用2-ΔΔCt法計(jì)算，引物序列分別為：miR-22-3p，5′-AA-GCTGCCAGTTGAAGAACTGT-3′；NHE5，5′-AAC-ATCTCTGGTCCCTGA-3′，5′-CACGGTGACAG-CATCGTTGAGC-3′；NEAT1，5′-GAGTTAAGGCGCCATCCTCA-3′，5′-AGCACTGCCACCTGGAAAAT-3′。

1.2.3 細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn) 將C6細(xì)胞按照每孔1×103的密度接種于6孔板并在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，每4天換液1次。2周后，將細(xì)胞用PBS沖洗并用甲醇固定和結(jié)晶紫溶液染色，在顯微鏡下計(jì)數(shù)克隆數(shù)。

1.2.4 劃痕實(shí)驗(yàn) 在6孔板中按照每孔1×104的密度接種C6細(xì)胞，然后轉(zhuǎn)染miR-22-3p mimic，si-NHE5及相應(yīng)的對(duì)照核酸序列。用吸頭劃出痕跡后開(kāi)始觀察0到48 h細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。

1.2.5 Transwell實(shí)驗(yàn) 在C6細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染miR-22-3p mimic，miR-22-3p inhibitor及對(duì)照核酸序列。72 h后收集細(xì)胞，將3×104個(gè)細(xì)胞接種于覆蓋了Matrigel的上層小室中，加入100 μL無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)液。在下層小室中加入含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液。24 h后細(xì)胞通過(guò)Matrigel遷移到下層后用甲醇固定并用結(jié)晶紫溶液染色15 min。對(duì)細(xì)胞遷移能力的檢測(cè)除未在上層覆蓋Matrigel外，其它步驟同上。最后用Image J軟件計(jì)數(shù)遷移和侵襲的細(xì)胞數(shù)。

1.2.6 蛋白質(zhì)免疫印跡 轉(zhuǎn)染結(jié)束后，收集細(xì)胞用RIPA裂解緩沖液裂解，BCA蛋白檢測(cè)試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。定量蛋白用12%的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，將電泳條帶轉(zhuǎn)到PVDF膜上，用5%的脫脂奶粉封閉2 h。按照1∶1000的比例配制一抗并將膜密封于4℃振蕩過(guò)夜，第2天經(jīng)3次洗膜后孵育二抗2 h。最后在ChemiDoc MP圖像系統(tǒng)上進(jìn)行顯影。以β-actin為內(nèi)參。

2 結(jié)果

2.1 lncRNA NEAT1、miR-22-3p在C6細(xì)胞系中的表達(dá)

既往研究表明，lncRNA NEAT1在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，為了進(jìn)一步確認(rèn)lncRNA NEAT1和miR-22-3p在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中的表達(dá)情況，運(yùn)用qRT-PCR檢測(cè)了lncRNA NEAT1和miR-22-3p在正常星形膠質(zhì)細(xì)胞和C6細(xì)胞系中的表達(dá)。與正常星形膠質(zhì)細(xì)胞相比，C6細(xì)胞系中的lncRNA NEAT1表達(dá)明顯升高(圖1A)，而miR-22-3p的表達(dá)明顯降低(圖1B)。lncRNA NEAT1和miR-22-3p在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中差異化表達(dá)。

NC:正常星形膠質(zhì)細(xì)胞;A：lncRNA NEAT1的表達(dá)；B：miR-22-3p的表達(dá)；與NC組比較，**P< 0.01圖1 lncRNA NEAT1和miR-22-3p在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中的表達(dá)Fig.1 Expression of lncRNA NEAT1 and miR-22-3p in glioma cell lines

2.2 過(guò)表達(dá)miR-22-3p抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系遷移和侵襲

為了進(jìn)一步確認(rèn)miR-22-3p對(duì)C6細(xì)胞系的作用，通過(guò)直接轉(zhuǎn)染miR-22-3p mimic到C6細(xì)胞系中，檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞遷移和侵襲的影響。首先在C6細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染miR-22-3p mimic，結(jié)果提示轉(zhuǎn)染后細(xì)胞系中miR-22-3p的相對(duì)表達(dá)量明顯增加(圖2A)；細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)證明，轉(zhuǎn)染miR-22-3p mimic后細(xì)胞克隆數(shù)明顯減少(圖2B)；細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示轉(zhuǎn)染miR-22-3p mimic后細(xì)胞的遷移能力明顯降低(圖2C)；進(jìn)一步通過(guò)Transwell實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證轉(zhuǎn)染miR-22-3p mimic后對(duì)細(xì)胞遷移和侵襲的影響，結(jié)果表明C6細(xì)胞的遷移和侵襲能力均受到抑制(圖2D)。綜上，miR-22-3p對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的增殖、侵襲和遷移能力具有抑制作用。

NC:對(duì)照C6細(xì)胞;A：C6細(xì)胞系轉(zhuǎn)染miR-22-3p mimic后miR-22-3p的表達(dá)量；B：細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR-22-3p mimic對(duì)C6細(xì)胞系增殖的影響；C：細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR-22-3p mimic對(duì)C6細(xì)胞系遷移的影響；D：Transwell法檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR-22-3p mimic對(duì)C6細(xì)胞系遷移及侵襲的影響；與NC組比較，**P< 0.01圖2 miR-22-3p抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲Fig.2 miR-22-3p inhibits proliferootion，migration and invasion of glioma cells

2.3 過(guò)表達(dá)NHE5降低miR-22-3p對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲的抑制作用

運(yùn)用生物信息學(xué)軟件(Targetscan和DIANA)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)與神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲相關(guān)的基因包括FOXG1、NHE5、IGF1R、RAB1A、ATF3、HMGB1等，進(jìn)一步通過(guò)GEO查詢發(fā)現(xiàn)在C6細(xì)胞中NHE5起主要作用。在C6細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染miR-22-3p mimic可以明顯降低NHE5的mRNA和蛋白表達(dá)水平(圖3A、3B)；而過(guò)表達(dá)NHE5則可促進(jìn)C6細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲的作用(圖3C、3D)。因此，NHE5在促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的遷移和侵襲過(guò)程中起到重要作用。

NC:對(duì)照C6細(xì)胞;A：轉(zhuǎn)染miR-22-3p mimic對(duì)C6細(xì)胞NHE5 mRNA表達(dá)的影響；B：轉(zhuǎn)染miR-22-3p mimic對(duì)C6細(xì)胞NHE5蛋白表達(dá)的影響；C：過(guò)表達(dá)NHE5對(duì)C6細(xì)胞遷移的影響；D：過(guò)表達(dá)NHE5對(duì)C6細(xì)胞侵襲的影響；與NC組比較，**P<0.01；與mimic+NHE5-NC組比較，##P<0.01圖3 過(guò)表達(dá)NHE5對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲的影響Fig.3 The effect of overexpression of NHE5 on migration and invasion of glioma cell lines

2.4 lncRNA NEAT1負(fù)向調(diào)控miR-22-3p的表達(dá)而促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移和侵襲

根據(jù)生物信息學(xué)軟件DIANA預(yù)測(cè)，lncRNA NEAT1與miR-22-3p存在結(jié)合位點(diǎn)，因此本研究設(shè)計(jì)并合成了lncRNA NEAT1的沉默序列和miR-22-3p的抑制物，檢測(cè)轉(zhuǎn)染到細(xì)胞系后對(duì)lncRNA NEAT1、miR-22-3p表達(dá)量的影響及對(duì)C6細(xì)胞系遷移和侵襲的影響。

如圖4所示，轉(zhuǎn)染沉默序列后lncRNA NEAT1表達(dá)降低，而miR-22-3p表達(dá)升高(圖4A)，共轉(zhuǎn)染si-NEAT1和miR-22-3p抑制物后，C6細(xì)胞系的遷移和侵襲能力增強(qiáng)(圖4B、4C)?？傊?，lncRNA NEAT1可以負(fù)向調(diào)控miR-22-3p，從而促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。

A：轉(zhuǎn)染si-NEAT1對(duì)NEAT1和miR-22-3p表達(dá)的影響；B：si-NEAT1和miR-22-3p抑制物對(duì)C6細(xì)胞遷移能力的影響；C：si-NEAT1和miR-22-3p抑制物對(duì)C6細(xì)胞侵襲能力的影響;與si-NC組比較，**P<0.01；與si-NEAT1+NC組比較，##P<0.01圖4 lncRNA NEAT1調(diào)控miR-22-3p的表達(dá)影響神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移和侵襲Fig.4 lncRNA NEAT1 affects the migration and invasion of glioma by regulating the expression of miR-22-3p

3 討論

大量研究表明，lncRNA在調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起到了至關(guān)重要的作用，如腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移[19-20]。盡管已有報(bào)道NEAT1在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)明顯升高，但是其對(duì)膠質(zhì)瘤的生物學(xué)行為的影響仍然不清楚。因此，本研究將進(jìn)一步探索lncRNA NEAT1在神經(jīng)膠質(zhì)瘤轉(zhuǎn)移中可能的作用機(jī)制。本研究首先運(yùn)用生物信息學(xué)軟件DIANA預(yù)測(cè)了NEAT1可能結(jié)合的miRNA，發(fā)現(xiàn)miR-22-3p存在與之結(jié)合的位點(diǎn)。我們的研究結(jié)果表明，在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系C6中，沉默lncRNA NEAT1可以增加miR-22-3p的表達(dá)。同時(shí)，沉默lncRNA NEAT1也抑制了神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移和侵襲，而miR-22-3p inhibitor可以逆轉(zhuǎn)這種抑制效應(yīng)。這些結(jié)果表明，lncRNA NEAT1可能負(fù)向調(diào)控miR-22-3p的表達(dá)從而促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。

由于大多數(shù)惡性腫瘤主要通過(guò)糖酵解而不是線粒體氧化磷酸化產(chǎn)生大量的乳酸和次級(jí)代謝產(chǎn)物。因此，為了克服代謝的酸性物質(zhì)導(dǎo)致的細(xì)胞毒性，腫瘤細(xì)胞有著非常精細(xì)的調(diào)控機(jī)制，可以將胞內(nèi)的H+通過(guò)鈉-氫交換泵將其排到胞外，C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞含有大量的離子轉(zhuǎn)運(yùn)體，包括NHE5，因而被作為一種細(xì)胞模型廣泛用于對(duì)腫瘤細(xì)胞遷移與侵襲的研究，但是NHE5與腫瘤的遷移和侵襲的關(guān)系仍然不清楚[9]。最新研究表明，在C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中穩(wěn)定表達(dá)NHE5干擾質(zhì)?？梢杂行б种破渖L(zhǎng)[11]。有研究結(jié)果表明NHE5的消耗可以下調(diào)由EMT、EGFR和整合素介導(dǎo)的信號(hào)通路，并影響NHE1在這些通路中的作用[11]。因而通過(guò)有效手段調(diào)控NHE5或許可以作為治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤的潛在策略。

lncRNA NEAT基因可編碼2種亞型lncRNAs，3.7 kb的lncRNA NEAT1和23 kb的lncRNA NEAT2，它們均作為調(diào)控子在RNA的剪切和轉(zhuǎn)錄過(guò)程中起到關(guān)鍵作用。而最新的研究提示lncRNA NEAT1在多種腫瘤中扮演著腫瘤基因的角色[21]。lncRNA NEAT1在喉癌及其細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)，被敲減時(shí)則可抑制細(xì)胞增殖和侵襲，但是過(guò)表達(dá)時(shí)則促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖和侵襲[22]。在乳腺癌和前列腺癌等的相關(guān)研究中，lncRNA NEAT1可沉默miR-133b和miR-98-5p的表達(dá)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲[17，23]。此外，lncRNA NEAT1與癌癥治療過(guò)程中的耐藥密切相關(guān)，如在甲狀腺癌和肝癌對(duì)順鉑和索拉非尼的耐藥性中起到重要作用[24-25]。在本實(shí)驗(yàn)中，在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系C6中同樣發(fā)現(xiàn)lncRNA NEAT1與腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲密切相關(guān)。

在結(jié)直腸癌中，LNC00858作為內(nèi)源性競(jìng)爭(zhēng)RNA抑制miR-22-3p的表達(dá)而促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[26]。在肝癌中，miR-22-3p被lncRNA MIAT吸附而降低其表達(dá)，最終導(dǎo)致肝癌細(xì)胞的增殖。梓醇抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲則是通過(guò)miR-22-3p/MTA3信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)[27-28]。在本實(shí)驗(yàn)中，lncRNA NEAT1負(fù)向調(diào)控miR-22-3p的表達(dá)而促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。

本研究闡明了lncRNA NEAT1、miR-22-3p及NHE5在調(diào)控神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲的聯(lián)系，表明lncRNA NEAT1與miR-22-3p表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，而miR-22-3p過(guò)表達(dá)可降低NHE5的表達(dá)，在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中l(wèi)ncRNA NEAT1高表達(dá)負(fù)向調(diào)控miR-22-3p提高NHE5的表達(dá)，從而促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲。本研究也為膠質(zhì)瘤的靶向治療提供了新的策略。