唐 碧， 高 琦， 周 彤， 唐銘銘， 宣 玲，劉進軍， 康品方， 吳士禮， 張 恒

蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院心血管科，蚌埠 233004

房顫(atrial fibrillation，AF)是臨床上常見的一類持續(xù)性心律失常疾病，常常合并高血壓、冠狀動脈粥樣硬化等心血管疾病[1-2]。近些年的研究發(fā)現(xiàn)，在高血壓、慢性炎癥等應激刺激下，心臟成纖維細胞經過活化、遷移和過度增殖，纖維化表型轉化，導致心房結構重構和纖維化的發(fā)生，并最終影響心臟舒張功能[3]。因此，研究心臟成纖維細胞增殖和纖維化的調控機制，發(fā)現(xiàn)新的治療藥物和干預策略，對防治房顫發(fā)病，改善患者生存條件具有重要意義。血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，Ang Ⅱ)可以促進心臟成纖維細胞增殖、侵襲和遷移及纖維化表型轉化[4]，因而成為研究心房纖維化的重要細胞實驗模型。

大黃酚(chrysophanol，CP)，化學名為1，8-二羥基-3-甲基蒽醌(1，8-dihydroxy-3-methylanthraquinone)，最早是從蓼科植物大黃(Rheumrhabarbarum)分離出的活性成分[5]。近年來，大黃酚被發(fā)現(xiàn)具有抗炎、保護心血管的藥理作用[6-7]，此外還有研究報道大黃酚具有抗腎臟纖維化的功能[8]。然而，大黃酚是否影響心臟成纖維細胞增殖、侵襲和遷移及向肌成纖維細胞表型轉化還不清楚。本研究利用Ang Ⅱ誘導的小鼠心臟成纖維細胞模型，探究大黃酚對心房纖維化的影響及作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑

大黃酚(CAS：481-74-3)、選擇性SIRT1抑制劑EX527(CAS：49843-98-3)購自上海阿拉丁生化科技公司；IMDM培養(yǎng)液、胎牛血清、Trizol裂解液購自美國賽默飛世爾科技公司；CCK-8細胞增殖檢測試劑盒購自日本同仁化學研究所；Ang Ⅱ購自美國MCE科技公司；M-MLV逆轉錄酶試劑盒、SYBR Green qPCR Super Mix購自北京天根生化科技公司；RIPA細胞裂解液、結晶紫染液、ECL化學發(fā)光底物購自上海碧云天生物科技公司；6孔細胞培養(yǎng)板、24孔細胞培養(yǎng)板、96孔細胞培養(yǎng)板、Transwell細胞培養(yǎng)小室購自美國BD公司；PVDF膜購自美國密理博科技公司；兔抗基質金屬蛋白酶2(MMP-2)、基質金屬蛋白酶9(MMP-9)、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、纖維連接蛋白(fibronectin)、結締組織生長因子(CTGF)、沉默信息調節(jié)因子1(SIRT1)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子-1α(PGC-1α)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體購自美國CST公司；HRP山羊抗兔IgG購自美國Santa Cruz公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

原代小鼠心臟成纖維細胞(mouse cardiac fibroblasts，MCFs)購自美國Sciencell科技公司。細胞貼壁培養(yǎng)在含10%胎牛血清的IMDM完全培養(yǎng)液中，放置于37℃ CO2培養(yǎng)箱中，每隔2天換液，待細胞匯合度達到約80%時用胰酶消化傳代。

1.3 儀器設備

CO2細胞培養(yǎng)箱(日本三洋電氣)；超低溫冰箱(青島海爾)；SDS-PAGE凝膠電泳系統(tǒng)(美國伯樂公司)；全波長酶標儀(美國賽默飛世爾科技公司)；凝膠成像儀(上海勤翔科學儀器公司)；Real-time qPCR儀(美國Applied Biosystems科技公司)；高級正置顯微鏡(美國萊卡公司)。

1.4 CCK-8法檢測細胞活性和增殖水平

取對數(shù)生長期的MCFs細胞，用胰酶消化后收集，將細胞密度調整為2×105個/mL，取100 μL細胞懸液接種于96孔細胞培養(yǎng)板中。培養(yǎng)24 h后，分別根據實驗需要加入1 μmol/L Ang Ⅱ、1 μmol/L EX527或指定濃度的大黃酚，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μL CCK-8工作液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，取出孔板，使用全波長酶標儀讀取450 nm處的吸光度值。

1.5 免疫熒光染色

經超聲清洗后的無菌蓋玻片預先放置在6孔細胞培養(yǎng)板中，每孔接種2×105個細胞，培養(yǎng)過夜，待細胞充分貼壁后，棄掉培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液漂洗2次，加入4%多聚甲醛溶液室溫固定15 min，隨后加入0.2% Triton X-100室溫孵育15 min，透化細胞膜。使用預冷的2% BSA按1∶400比例稀釋α-SMA抗體，并加入到細胞中室溫孵育60 min，再加入FITC偶聯(lián)的熒光二抗室溫孵育60 min，最后用終濃度2 μg/mL的DAPI室溫染色5 min，充分漂洗后用封片機封片，在熒光顯微鏡下拍攝。

1.6 細胞劃痕實驗

MCFs細胞接種于細胞培養(yǎng)板，待細胞匯合度達到100%，用移液器吸頭輕輕做一道劃痕，棄掉培養(yǎng)液，并用磷酸鹽緩沖液洗掉剝離細胞，換液后放在培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。于劃痕后0 h、24 h對劃痕區(qū)域進行拍照，用Image J軟件計算劃痕面積，計算劃痕愈合率。

1.7 Transwell實驗

MCFs細胞經胰酶消化、離心并用IMDM完全培養(yǎng)液重懸，制備成為2×106個/mL的細胞懸液。取200 μL細胞懸液加入到Transwell上層小室，并將小室置于24孔細胞培養(yǎng)板中，每孔加入600 μL無血清IMDM培養(yǎng)液。細胞放置在37℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，取出小室，用棉簽擦去上層小室中的細胞，后用4%多聚甲醛固定，放入結晶紫染色液中染色15 min。充分漂洗后，取下小室膜，在顯微鏡下拍照，用Image J軟件統(tǒng)計遷移的細胞數(shù)。

1.8 Western blot檢測

MCFs細胞加入RIPA細胞裂解液，冰上裂解15 min，在4℃，12000 r/min離心10 min，后加入5×SDS上樣緩沖液，100℃沸水加熱10 min。用SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白樣品，電壓100 V，恒壓電泳90 min。隨后用轉印槽將蛋白樣品轉印到PVDF膜上，冰浴100 V恒壓轉印2 h。PVDF膜首先用5%脫脂奶粉室溫封閉30 min，隨后分別與稀釋后的抗MMP-2(1∶1000)、MMP-9(1∶1000)、collagenⅠ(1∶2000)、fibronectin(1∶2000)、CTGF(1∶1000)和GAPDH(1∶3000)抗體室溫孵育1 h，最后用稀釋后的二抗孵育液(1∶5000)室溫孵育45 min，加入ECL發(fā)光底物，用凝膠成像儀獲取蛋白印跡。

1.9 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 大黃酚處理抑制Ang Ⅱ誘導的MCFs細胞增殖

用不同濃度的大黃酚處理MCFs細胞24 h后，CCK-8實驗結果表明，低劑量大黃酚(1 μmol/L)和中劑量大黃酚(10、50 μmol/L)對細胞存活率沒有顯著影響，而高劑量大黃酚(100 μmol/L)處理細胞存活率為(86.5±3.9)%，與Control組相比下降(P<0.05，圖1A)。這表明高濃度大黃酚具有一定細胞毒性，會抑制細胞生長。

聯(lián)合使用1 μmol/L Ang Ⅱ和大黃酚共處理MCFs細胞，并在處理后的24、48和72 h檢測細胞增殖活性，實驗結果表明，與Control組相比，Ang Ⅱ可以促進細胞增殖(均P<0.01)。而Ang Ⅱ聯(lián)合大黃酚處理可以抑制細胞增殖活性(均P<0.01)，且抑制程度隨著大黃酚濃度升高而增加，見圖1B。

1：Control；2：1 μmol/L CP；3：10 μmol/L CP；4：50 μmol/L CP；5：100 μmol/L CP；A：CCK-8檢測大黃酚細胞毒性；B：CCK-8檢測大黃酚對Ang Ⅱ誘導MCFs細胞增殖的影響；與Control組比較，*P<0.05 **P<0.01；與Ang Ⅱ組比較，##P<0.01;Ang Ⅱ:血管緊張素Ⅱ，CP：大黃酚圖1 大黃酚抑制Ang Ⅱ誘導的MCFs細胞增殖Fig.1 Chrysophanol inhibits Ang Ⅱ-induced proliferation of MCFs

2.2 大黃酚抑制Ang Ⅱ誘導的MCFs細胞遷移和侵襲

聯(lián)合使用Ang Ⅱ和大黃酚處理MCFs細胞24 h后，利用劃痕實驗和Transwell實驗檢測細胞遷移能力。細胞劃痕實驗結果表明，與Control組相比，Ang Ⅱ組劃痕愈合面積增加(P<0.01)，與Ang Ⅱ組相比，大黃酚聯(lián)合用藥組劃痕愈合面積隨著大黃酚濃度的升高逐漸減小(P<0.05)，見圖2A。Transwell實驗結果表明，與Control組相比，Ang Ⅱ組侵襲到下層小室細胞數(shù)增加(P<0.01)，與Ang Ⅱ組相比，大黃酚聯(lián)合用藥組侵襲細胞數(shù)隨著大黃酚濃度的升高逐漸減少(P<0.01)，見圖2B。Western blot實驗結果表明，Ang Ⅱ組MMP-2和MMP-9蛋白表達水平升高，而隨大黃酚濃度增加，大黃酚聯(lián)合用藥組細胞MMP-2和MMP-9蛋白表達水平逐漸降低(圖2C)。

1：Control；2：Ang Ⅱ；3：Ang Ⅱ+1 μmol/L CP；4：Ang Ⅱ+10 μmol/L CP；5：Ang Ⅱ+50 μmol/L CP；A：劃痕實驗檢測MCFs細胞遷移能力；B：Transwell實驗檢測MCFs細胞侵襲能力；C：Western blot檢測MMP-2、MMP-9蛋白的表達水平；與Control組比較，**P<0.01；與Ang Ⅱ組比較，#P<0.05 ##P<0.01圖2 大黃酚抑制Ang Ⅱ誘導的MCFs細胞遷移和侵襲Fig.2 Chrysophanol inhibits Ang Ⅱ-induced MCFs migration and invasion

2.3 大黃酚抑制Ang Ⅱ誘導的MCFs細胞纖維化因子的分泌

免疫熒光染色實驗結果表明，與Control組相比，Ang Ⅱ組細胞內源α-SMA染色熒光強度增加，而大黃酚聯(lián)合用藥組細胞α-SMA熒光強度隨大黃酚濃度升高而下降(圖3A)。Western blot實驗結果表明，與Control組相比，Ang Ⅱ組細胞collagen Ⅰ、fibronectin和CTGF表達水平升高(均P<0.05)，而與Ang Ⅱ組相比，大黃酚聯(lián)合用藥組細胞隨大黃酚濃度增加collagenⅠ、fibronectin和CTGF蛋白表達水平逐漸下降(均P<0.01)，見圖3B。

1：Control；2：Ang Ⅱ；3：Ang Ⅱ+1 μmol/L CP；4：Ang Ⅱ+10 μmol/L CP；5：Ang Ⅱ+50 μmol/L CP；A:免疫熒光染色檢測α-SMA表達；B:Western blot檢測纖維化相關蛋白表達；與Control組比較，**P<0.01；與Ang Ⅱ組比較，##P<0.01圖3 大黃酚抑制Ang Ⅱ誘導的MCFs細胞纖維化Fig.3 Chrysophanol inhibits Ang Ⅱ-induced fibrosis of cardiac fibroblasts

2.4 大黃酚激活MCFs細胞SIRT1/PGC-1α信號通路

Western blot實驗結果表明，與Control組相比，Ang Ⅱ組細胞SIRT1和PGC-1α蛋白表達水平下降(均P<0.01)，而與Ang Ⅱ組相比，大黃酚聯(lián)合用藥組細胞隨著大黃酚濃度升高SIRT1和PGC-1α蛋白表達水平逐漸增加(均P<0.01)，50 μmol/L大黃酚處理組細胞中SIRT1和PGC-1α的表達水平接近Control組，見圖4。

1：Control；2：Ang Ⅱ；3：Ang Ⅱ+1 μmol/L CP；4：Ang Ⅱ+10 μmol/L CP；5：Ang Ⅱ+50 μmol/L CP；Western blot檢測SIRT1和PGC-1α蛋白表達水平，與Control組比較，**P<0.01；與Ang Ⅱ組比較，##P<0.01圖4 大黃酚激活MCFs細胞SIRT1/PGC-1α信號通路Fig.4 Chrysophanol activates SIRT1/PGC-1α signaling pathway in cardiac fibroblasts

后續(xù)實驗均選擇50 μmol/L為大黃酚作用濃度。

2.5 大黃酚通過激活SIRT1/PGC-1α信號通路抑制Ang Ⅱ誘導的細胞增殖、遷移和侵襲

細胞劃痕實驗結果表明，與Ang Ⅱ組相比，Ang Ⅱ+CP組劃痕愈合面積下降，加入EX527后，劃痕愈合面積增加(圖5A)。Transwell實驗結果表明，與Ang Ⅱ組相比，Ang Ⅱ+CP組侵襲到下層小室的細胞數(shù)減少，而Ang Ⅱ+CP+EX527組侵襲到下層小室的細胞數(shù)增加，見圖5B。

CCK-8實驗結果表明，與Ang Ⅱ組相比，Ang Ⅱ+CP組細胞增殖活性下降(P<0.01)，而加入SIRT1抑制劑EX527后，細胞增殖活性升高(P<0.01)，見圖5C。Western blot實驗結果表明，與Ang Ⅱ組相比，Ang Ⅱ+CP組細胞MMP-2和MMP-9表達水平下降(均P<0.01)，Ang Ⅱ+CP+EX527組細胞，MMP-2和MMP-9表達水平回升(均P<0.01)，見圖5D。

1：Control；2：Ang Ⅱ；3：Ang Ⅱ+CP；4：Ang Ⅱ+CP+EX527；A：劃痕實驗檢測細胞遷移能力；B：Transwell實驗檢測MCFs細胞侵襲能力；C：CCK-8檢測細胞活性；D：Western blot檢測MMP-2、MMP-9蛋白的表達水平；與Control組比較，**P<0.01；與Ang Ⅱ組比較，#P<0.05；##P<0.01；與Ang Ⅱ+CP組比較，△△P<0.01圖5 大黃酚通過激活SIRT1/PGC-1α信號通路抑制Ang Ⅱ誘導的細胞增殖、遷移和侵襲Fig.5 Chrysophanol inhibits Ang Ⅱ-induced cell proliferation、migration and invasion by activating SIRT1/PGC-1α signaling pathway

2.6 大黃酚通過激活SIRT1/PGC-1α信號通路抑制Ang Ⅱ誘導的MCFs細胞向肌成纖維細胞表型轉化

免疫熒光實驗結果表明，與Ang Ⅱ組相比，Ang Ⅱ+CP組細胞α-SMA熒光強度下降，Ang Ⅱ+CP+EX527組細胞α-SMA熒光強度升高，見圖6A。Western blot實驗結果表明，與Ang Ⅱ組相比，Ang Ⅱ+CP組細胞collagenⅠ、fibronectin和CTGF蛋白表達水平下降，Ang Ⅱ+CP+EX527組細胞，collagenⅠ、fibronectin和CTGF蛋白回升，見圖6B。

1：Control；2：Ang Ⅱ；3：Ang Ⅱ+CP；4：Ang Ⅱ+CP+EX527；A：免疫熒光染色檢測α-SMA表達；B：Western blot檢測纖維化相關蛋白表達；與Control組比較，**P<0.01；與Ang Ⅱ組比較，##P<0.01；與Ang Ⅱ+CP組比較，△△P<0.01圖6 大黃酚激活SIRT1/PGC-1α信號通路抑制Ang Ⅱ誘導的細胞纖維化Fig.6 Chrysophanol inhibits Ang Ⅱ-induced cell fibrosis by activating SIRT1/PGC-1α signaling pathway

3 討論

心房顫動(AF)是一種非常常見的臨床心律失常疾病，患病率隨著年齡的增長而增加。房顫患病率的增加與高血壓、冠心病等心臟疾病的高發(fā)密切相關[9]。心肌纖維化是包括心房顫動在內的許多心血管疾病的病理生理基礎，是心肌重構的重要特征[10]。心臟成纖維細胞(CF)是心臟的主要細胞類型，在心肌纖維化中起主要作用[11]，在正常心臟中，成纖維細胞保持靜止，并負責細胞外基質的基礎沉積和降解[12]。在壓力條件下，心臟成纖維細胞增殖侵襲和遷移并分化為肌成纖維細胞，分泌更高水平的細胞外基質成分，導致心肌纖維化和收縮功能障礙[13]，因此有效抑制心臟成纖維細胞的增殖、侵襲和遷移及向肌成纖維細胞轉化對抑制心房顫動至關重要。

近年來一系列的研究證實，大黃酚具有抗炎和抗纖維化的作用[14-16]，同時在心肌損傷中，大黃酚通過抑制炎癥、氧化應激和纖維化阻止高脂引起的心肌損傷[17]，表明大黃酚對心肌損傷有保護作用。本研究發(fā)現(xiàn)不同劑量大黃酚能夠減輕Ang Ⅱ引起的心臟成纖維細胞增殖、侵襲和遷移及抑制MMP-2和MMP-9的表達。MMP-2和MMP-9是通過調節(jié)ECM穩(wěn)態(tài)參與心臟纖維化和肥厚的發(fā)病機制[18]。同時不同劑量大黃酚能夠減輕Ang Ⅱ引起的心臟成纖維細胞向肌成纖維細胞表型轉化，抑制Ang Ⅱ誘導的心肌成纖維細胞中α-SMA、collagenⅠ、fibronectin和CTGF的表達，α-SMA蛋白是成纖維細胞向肌成纖維細胞表型轉化的關鍵基因[19]，CTGF也被認為是纖維化的生物標志物[20]，collagenⅠ和fibronectin被認為是參與心臟纖維化的主要誘導因素[21-22]，表明不同劑量大黃酚能夠減輕Ang Ⅱ引起的心臟成纖維細胞損傷的作用。此外，通過Western blot檢測發(fā)現(xiàn)不同劑量大黃酚能夠激活SIRT1和PGC-1α的表達。SIRT1是一類NAD+依賴的組蛋白去乙?；福軌蛉ヒ阴；せ頟GC-1α的表達[23]，在Ang Ⅱ誘導的心肌組織和心臟成纖維細胞中SIRT1的表達降低[24-25]，PGC-1α干擾后能夠加重Ang Ⅱ誘導的心肌纖維化[26]，表明有效激活SIRT1/PGC-1α對恢復Ang Ⅱ引起的心臟成纖維細胞損傷具有重要的保護作用。本研究利用SIRT1選擇性抑制劑EX527逆轉大黃酚的保護作用，進一步表明大黃酚能夠通過激活SIRT1/PGC-1α信號蛋白的表達減輕Ang Ⅱ誘導的心臟成纖維細胞增殖、侵襲和遷移及向肌成纖維細胞表型轉化。

綜上所述，大黃酚可減弱Ang Ⅱ誘導的心臟成纖維細胞增殖、侵襲和遷移及向肌成纖維細胞表型轉化，其分子機制可能與SIRT1/PGC-1α信號通路激活有關。