王錦鋒

(隴東學院 農林科技學院，甘肅慶陽 745000)

SHI-relatedsequence(SRS)作為植物激素反應的重要調節(jié)因子，亦稱短節(jié)間(SHI)基因家族[1]，可通過控制GA和生長素的反應或信號轉導來調節(jié)植株的生長或發(fā)育，編碼一類具有2個不同保守區(qū)域的植物特異性轉錄因子[2]，分別為RING結構域和IGGH結構域[3]。RING結構域編碼C-X2-C-X7-C-X-H-X2-C-X2-C-X7-C-X2-H[4]，鋅指結構域(C3H2C3或C3HC4)是一大類與RNA、蛋白質和脂質底物結合后可發(fā)揮作用的環(huán)狀結構域，參與細胞許多生理生化過程[5]。另一個區(qū)域稱為IGGH結構域，是SRS基因家族的特異結構域[6]，其功能目前未知，需要進一步研究。

研究發(fā)現，許多SRS家族成員通過調節(jié)激素合成、信號轉導或反應來影響植物器官的發(fā)育。例如，STY1蛋白上調生長素生物合成，而SHI則通過轉錄控制作為GA反應的抑制因子[2]。此外，SHI通過GA調控大麥糊粉細胞中a-淀粉酶的表達，表明SHI可以負調控異源物種中的GA反應。另外，當SRS7基因過表達時，茉莉酸(JA)信號中斷，花藥開裂延遲[7]。對SRS家族基因突變植物進行廣泛研究表明，SRS轉錄因子可控制植物多種發(fā)育過程，如根的形成[8]、葉的發(fā)育[9]、花的誘導、花的發(fā)育[10]和光形態(tài)[11]，突變會影響雌蕊發(fā)育、花的雌性生殖結構以及花輪的葉片發(fā)育和器官特性。最近的一項研究表明，SRS5通過直接結合光形態(tài)建成促進基因的啟動子來促進光形態(tài)建成[11]。SRS基因參與植物器官發(fā)育的研究在其他植物中也有報道。例如，已經發(fā)現SRS轉錄因子通過玉米生長素信號調節(jié)大麥(HordeumvulgareL.)的激素、花序模式[12]和根系發(fā)育[13]。SRS轉錄因子控制生長素的生物合成，進而影響植物生長[14]，并塑造水稻(OryzasativaL.)的植物結構[15]。

AtSRS基因家族表達模式及系統(tǒng)發(fā)育，已進行了全基因組鑒定和功能分析，相比之下，對蘋果(MalusdomesticaBorkh.)SRS基因家族(MdSRS)的研究少之又少。蘋果是世界性果品，其產量和品質易受環(huán)境影響，特別是干旱、鹽和激素等非生物脅迫已成為影響蘋果生長發(fā)育的最主要問題之一[16]。本研究鑒定了蘋果的SRS基因，明確各個基因的系統(tǒng)發(fā)育進化關系、理化性質、Motif預測、亞細胞定位及在不同脅迫后的表達水平，并研究了其在蘋果對各種刺激反應中的潛在功能，這些研究結果將為蘋果育種提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

選取生長狀態(tài)良好、長勢基本一致的3周齡‘長富’蘋果組培苗作為試驗材料，用10% PEG6000、1 mmol·L-1ABA和150 mmol·L-1NaCl分別模擬干旱脅迫、激素脅迫和鹽脅迫，收集處理(0、12、24、48和72 h)后的葉片。每個處理3個重復，錫箔紙包裹標記，液氮速凍后保存于-80 ℃保存?zhèn)溆茫糜诤罄m(xù)的定量反轉錄PCR (quantitative reverse transcription PCR，qRT-PCR)分析。

1.2 方 法

1.2.1MdSRS家族成員鑒定與理化性質分析蘋果SRS家族基因的蛋白質序列通過蘋果基因組數據(https://iris:angers.inra.fr/gddh13/)獲得，擬南芥SRS蛋白數據從TAIR(https://www.arabidopsis.org)獲得。從Pfam(http://pfam.xfam.org/)網站下載隱馬爾可夫模型，通過在線軟件SMART(https://smart.embl-heide-lberg.de/)對初步篩選得到的候選基因家族進行結構域驗證，最終篩選得到11個蘋果MdSRS家族成員。采用ExPASy Proteomics Server(http://web.expasy.org /protparam)分析蘋果MdSRS氨基酸序列的分子量、長度、等電點及不穩(wěn)定系數等。利用在線網站(http://www.genscript.com/psort/wolf-psort.html)進行亞細胞定位預測。

1.2.2 蘋果MdSRS家族基因結構分析利用在線軟件MEME(http://meme-suite.org/tools/meme)預測蘋果MdSRS基因家族的保守基序，最大保守序列鑒定數目設置為10。利用TBtools繪制蘋果MdSRS基因家族基因結構和保守基序圖。

1.2.3 蘋果MdSRS基因家族染色體定位及SRS系統(tǒng)發(fā)育和進化分析利用MapChart2.2軟件和TBtools對蘋果MdSRS家族基因進行染色體定位。為了分析多物種SRS基因間的進化關系，從PlantTFDBv5.0(http://planttfdb.gao-lab.org/)數據庫中下載擬南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻(Oryzasativa)和楊樹(Populustrichocarpa)等SRS基因蛋白序列構建進化樹(參數設置默認)，利用AI軟件對SRS進化樹進行修飾。

1.2.4 蘋果MdSRS基因家族順式作用元件分析通過PlantCARE對MdSRS家族成員啟動子上游2 000 bp的順式作用元件進行分析，然后對激素誘導、環(huán)境適應及逆境誘導表達元件的數量進行分析。

1.2.5 蘋果MdSRS基因家族定量表達分析用于qRT-PCR分析的蘋果材料如1.1所述。RNA提取試劑盒和cDNA第一條鏈合成所采用的反轉錄試劑盒購自寶生物工程有限公司(TaKaRa)。MdSRS熒光定量引物如表1所示，選用MdActin作為內參基因。反應體系為：TB GreenⅡ10 μL，上、下游混合引物各2 μL，6 μL ddH2O，cDNA 2 μL，總體積20 μL。反應條件為：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性5 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個循環(huán)。樣品均為3次重復。并采用2-ΔΔCT計算基因的相對表達量。采用SPSS軟件的單因素分析法進行差異顯著性分析。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 qRT-PCR primer sequences

2 結果與分析

2.1 蘋果MdSRS家族成員理化性質分析

利用蘋果基因組數據庫，經過Blast同源比對及SMART分析共得到11個蘋果MdSRS基因。MdSRS基因家族蛋白的理化性質如表2所示，包括等電點、分子質量、不穩(wěn)定系數和親和指數等指標。蘋果MdSRS基因家族氨基酸殘基為229～414 aa，MdSRS3最長，MdSRS7最短；等電點范圍在6.38～9.36之間；蛋白分子量介于25.40～43.04 kD之間；均為不穩(wěn)定蛋白；亞細胞定位顯示，11個家族成員在細胞膜上都有分布，個別分布于葉綠體上，MdSRS3和MdSRS8分布最廣。

表2 蘋果MdSRS基因家族理化性質分析Table 2 Analysis of physicochemical properties of apple MdSRS gene family

2.2 蘋果MdSRS基因家族成員系統(tǒng)進化及基因結構分析

MdSRS基因家族成員的基因結構分析結果顯示(圖1)，7個基因均含外顯子和內含子。保守基序分析發(fā)現，11個MdSRS基因的保守基序數量在3～8之間不等，其中保守基序數量最少的MdSRS2只有3個保守基序，且Motif 1為該家族所共有，同一類群中的大多數成員具有相似的motif，說明同一類群中的基因存在著功能上的相似性。根據Motif數量和種類的不同，可將進化樹大致劃分為3組，進化樹中同一亞家族內成員間基因結構較相似，但并不完全相同，可能是由于SRS基因功能的多樣性且在進化過程中發(fā)生了變異。

2.3 蘋果SRS染色體定位分析

MdSRS染色體定位結果顯示(圖2)，蘋果的11個SRS家族成員不均勻地分布在其中9條染色體中，2號和15號染色體(Chr 02，Chr15)分布2個SRS成員，其他染色體上各分布1個。

2.4 蘋果MdSRS基因家族系統(tǒng)發(fā)育和進化分析

為揭示SRS蛋白在植物中的系統(tǒng)發(fā)育關系，以蘋果(Malusdomestica)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)和水稻(Oryzasativa)等的SRS基因家族成員的蛋白序列通過NJ法構建系統(tǒng)進化樹。結果(圖3)表明，所有SRS蛋白被分為5個亞家族(A1

-A5)，每個亞家族所包含的SRS成員不等。MdSRSs在5個亞家族中均有分布，其中在A4中分布最多(3)，其他亞家族分布數目一樣，均為2個。

2.5 蘋果MdSRS基因家族啟動子順式作用元件分析

通過PlantCARE對MdSRS家族翻譯起始位點上游2 000 bp順式作用元件進行分析，結果(圖4)顯示，蘋果SRS基因家族成員啟動子上游2 000 bp序列存在著逆境脅迫響應[低溫響應元件(LTR)]、激素響應[生長素反應元件(TGA-element)、水楊酸反應元件(TCA-element)、脫落酸反應元件(ABRE)]、防御和應激反應順式作用元件(TC-rich repeats)等。啟動子區(qū)域順式作用元件分析表明，蘋果SRS基因家族的11個基因大多含有防御和應激反應順式作用元件(TC-rich repeats)和脫落酸響應元件(ABRE)，這表明MdSRS能夠參與調控一系列非生物逆境脅迫。

2.6 蘋果MdSRS基因家族在鹽脅迫、干旱脅迫及ABA脅迫下的表達特點

為了進一步研究MdSRS基因家族的功能，本研究對蘋果分別進行了非生物脅迫和激素處理，結果如圖5所示。在鹽脅迫下經過不同處理時間(0、12、24、48、72 h)后，MdSRS家族11個成員均有表達且主要為下調表達。在同一脅迫時間下，大部分基因的表達大致為降-升-降趨勢且差異顯著，其中MdSRS1、MdSRS5、MdSRS5、MdSRS7及MdSRS10表達量在各時期表達量相對最高，均介于0.6～1.2之間。而同一基因隨脅迫時間的延長呈多樣性變化，以MdSRS1為典型的先降后升型(MdSRS4、MdSRS7、MdSRS8、MdSRS9、MdSRS11)，以MdSRS6為代表的持續(xù)降低型(MdSRS2、MdSRS3、MdSRS5、MdSRS6、MdSRS10)，說明SRS基因在蘋果生長發(fā)育過程中對鹽脅迫有明顯響應，其中MdSRS6隨鹽脅迫變化最明顯且在72 h后降至最低值。

為了揭示MdSRS家族基因在干旱脅迫下的表達模式，利用10%滲透壓PE6000溶液模擬干旱脅迫，本研究對11個MdSRS基因在PEG脅迫下的基因表達進行qRT-PCR驗證。結果表明(圖5)，隨脅迫時間的延長，PEG模擬干旱脅迫促進大多數MdSRS基因發(fā)生差異表達。MdSRS1、MdSRS3、MdSRS6和MdSRS10隨脅迫時間的延長呈先升后降的趨勢且大多在12 h達到最高，表達量介于1.2～1.6之間；MdSRS7在24 h數值最高，為1.538；MdSRS2、MdSRS5、MdSRS8和MdSRS9隨脅迫時間的延長呈下降趨勢；MdSRS4呈先降后升趨勢，24 h降至最低值后在72 h上升，但還是低于0 h的表達量；MdSRS11隨脅迫時間的延長呈逐漸上升趨勢，72 h的表達量是0 h的1.54倍。而在同一脅迫時間下，大多數基因呈降-升趨勢，除12 h的MdSRS1-MdSRS11，48和72 h的MdSRS1-MdSRS6(呈降-升-降-升)，表達量最高時可達1.6，以MdSRS1、MdSRS6及MdSRS7為代表。

MdSRS基因在ABA處理下不同時間的表達量變化結果顯示，各基因的表達模式均有不同，有以MdSRS2為代表的先升后降型，但表達量達到最高的時間點不同(24、48 h)且在72 h的表達量要高于0 h；以MdSRS3為代表的持續(xù)升高型；以MdSRS1為代表的升-降-升-降型等；以MdSRS5為代表的升-降-升型等，在24 h上升后開始下降，72 h達到最大值。不同基因在同一脅迫時間下的結果表明，ABA脅迫顯著提高了MdSRSs的表達量，11個基因在同一時間下呈降-升-降-升的趨勢，其中MdSRS3在72h表達量為2.99，顯著高于同一時間下其他基因的表達量，表示這11個蘋果MdSRS基因能積極響應ABA脅迫相關生物學過程。

3 討 論

作為傳統(tǒng)大眾果品，蘋果銷量突出，前景廣闊，其優(yōu)質高產一直是果樹栽培生產追求的最終目標[17]，但種植過程中多種環(huán)境脅迫通過影響植株體內的激素含量及比例分布而嚴重影響產量和品質[18]。有研究認為SRS基因家族參與維持生長素體內平衡，例如在器官形成時期生長素合成增加，下調KNOX基因的表達，而KNOX基因的表達量增加或減少到一定闕值，都會抑制GA20ox基因表達，從而抑制赤霉素生物合成，另外，SRS可通過調節(jié)激素的生物合成、信號轉導或反應來影響植物器官的發(fā)育[19]。因此如何提高蘋果的抗性，緩解嚴重環(huán)境脅迫對蘋果產量質量的影響，是目前栽培過程中亟需解決的問題。緩解產量損失的一種方法是發(fā)現抗脅迫基因，培育出非生物脅迫下的強健品種。在本研究中，我們對蘋果SRS家族進行了全基因組分析，并探討了蘋果對各種刺激反應的潛在功能。我們鑒定了MdSRS在干旱、鹽和ABA響應中的作用，這些結果將為我們對蘋果SRS家族提供新的認識，并為蘋果育種提供候選抗性基因。

轉錄因子在植物的生長發(fā)育中起著重要的作用，許多轉錄因子已被確定參與了一系列響應生物和非生物脅迫[20]。自2017年公布了高質量蘋果基因組序列以來[21]，越來越多的蘋果基因家族被鑒定出來，SRS家族作為一類古老的轉錄因子，已在擬南芥、玉米、大麥和水稻等物種中得以驗證，但對蘋果SRS基因家族的鑒定和分析還未見報道。在本研究中，鑒定出了11個蘋果SRS家族成員，數量少于模式植物擬南芥的16個，但多于單子葉植物玉米的6個，說明SRS基因家族在長期的進化過程中出現了擴增或縮減。通過對MdSRS基因進行理化性質分析，發(fā)現MdSRSs氨基酸個數為229～414 aa且大多屬于不穩(wěn)定蛋白；蛋白分子量范圍在25.40～43.04 kD之間，且11個家族成員在細胞膜上都有分布，個別在葉綠體上也有分布。通過理化性質預測發(fā)現不同的MdSRS編碼蛋白理化性質均存在一定差異，推測其在植物體內的功能可能也不相同。內含子是影響轉錄速率、核輸出和轉錄穩(wěn)定性、提高mRNA翻譯效率的重要結構，雖然內含子不能作為轉錄因子的結合位點，但它們可以增加基因的表達。我們對MdSRSs基因結構進行了分析，發(fā)現位于同一亞家族的成員具有相似的基因結構，證明了同一群體的成員具有相似的進化關系或功能。然后對蘋果、番茄、水稻、楊樹、擬南芥中的63個SRS蛋白構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，結果發(fā)現亞家族A1～A5中都含有MdSRS基因家族的成員，說明這些成員在進化上同源，功能上也相似，而MdSRSs位于不同的分支中，可能是在進化過程中引起的這種差異，表明該家族在植物進化過程中其功能較保守。植物在響應生物以及非生物脅迫過程中常涉及復雜的調控機制，正如在對SRS基因啟動子中的順式作用元件的分析中所述，它們包含了許多與脅迫相關的元件，如ABRE、LTR、TGA、TCA。ABRE結合蛋白(AREBs/ABFs)可以結合ABRE元件，參與ABA、脫水和高鹽脅迫等反應。在水稻中，ABRE結合因子OSBZ8可能調控水稻的耐鹽性。AtHSFA7b通過與E-BOXmoti結合，正向調控擬南芥的耐鹽性。SRS基因在蘋果中的表達模式存在差異，提示這些基因可能參與不同的生物學過程或執(zhí)行不同的生物學功能[22]。本試驗在模擬干旱、鹽脅迫和ABA脅迫的基礎上，通過實時熒光定量檢測可得，MdSRS的11個基因在鹽脅迫和干旱脅迫下總體呈下調趨勢，但表達模式不同，其中以鹽脅迫下MdSRS6為典型的持續(xù)降低型和以MdSRS7為代表的先升后降型，表達量最高維持在1.4～1.8之間，說明SRS轉錄因子家族能夠參與植物生長發(fā)育過程，并響應生物及非生物脅迫，其中可以有效調節(jié)干旱、鹽等非生物脅迫對植物造成的傷害；相對于鹽脅迫和干旱脅迫，ABA脅迫后，MdSRSs表達各異但總體呈上調表達，部分呈不規(guī)則變動，由此說明ABA對葉中MdSRS基因的表達有不同的影響，這意味著MdSRS基因可以以特異性的方式調節(jié)蘋果發(fā)育過程中的植物激素調控，可能是SRS與ABA信號通路中的核心轉錄因子ABI5存在互相作用，通過正向調控ABA的生物合成來增強植株對非生物脅迫的耐受性[23-24]。鑒于SRS在干旱脅迫和ABA脅迫中均有不可替代的作用，我們可想象MdSRS基因可能在依賴于ABA調控的干旱脅迫響應信號通路上發(fā)揮作用，具體結論還有待試驗進一步驗證。

綜上所述，本研究的結果豐富了蘋果SRS家族轉錄因子的基本信息，對其蛋白理化特征、保守基序和基因結構等進行了分析。在蘋果基因組中鑒定出了11個SRS基因。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，系統(tǒng)進化樹將63個SRSs劃分為5個亞類，同一亞組在基因結構方面具有相似性，且同一或不同亞類MdSRSs基因在脅迫處理后的表達模式彼此不同，說明這些基因可能參與了不同的生物學過程或執(zhí)行不同的生物學功能，也為蘋果進一步抗性研究提供良好資源。