趙明奇，劉曉潔，梁玉青，楊瑞瑞，李小雙,3*

(1 新疆抗逆植物基因資源保育與利用重點實驗室，烏魯木齊 830011；2 中國科學院 吐魯番沙漠植物園，新疆吐魯番 838008；3 中國科學院大學，北京 100049)

在植物中轉(zhuǎn)錄因子參與諸多信號轉(zhuǎn)導過程，調(diào)控其生長發(fā)育和逆境脅迫響應[1-3]。到目前為止，在植物體內(nèi)至少鑒定到58類轉(zhuǎn)錄因子家族[4-6]。AP2/ERF(APETALA2 and ethylene responsive element binding proteins)轉(zhuǎn)錄因子家族是植物中數(shù)量最多的轉(zhuǎn)錄因子家族之一[7]。該轉(zhuǎn)錄因子家族的共同特征為均含有AP2保守結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域由4個二級蛋白結(jié)構(gòu)構(gòu)成，包括3個β折疊和1個α螺旋。根據(jù)AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族經(jīng)典分類法[8]，即保守結(jié)構(gòu)域的數(shù)量和種類，將AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族分為5個亞家族，包括AP2、DREB、ERF、RAV和Soloist，其中AP2亞家族一般含有2個AP2結(jié)構(gòu)域，DREB和ERF亞家族含有1個AP2結(jié)構(gòu)域，RAV亞家族含有一個AP2和一個B3 domain，Soloist也只含有一個AP2結(jié)構(gòu)域，但與其他亞家族進化距離較遠，單獨為一個亞家族[9-10]。許多AP2/ERF類轉(zhuǎn)錄因子在植物生長發(fā)育和逆境響應信號轉(zhuǎn)導過程中處于分子調(diào)控網(wǎng)絡的關鍵節(jié)點[11]。AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子首次在擬南芥(Arabidopsisthaliana)中被鑒定和分離(AP2亞家族)，主要參與調(diào)控植物的生長發(fā)育[12]；隨后又在煙草(Nicotianatabacum)中鑒定到了與乙烯響應元件結(jié)合的ERF轉(zhuǎn)錄因子，主要在植物抵抗生物脅迫過程中發(fā)揮作用[13]；后續(xù)通過干旱和低溫脅迫在擬南芥中分離出DREB轉(zhuǎn)錄因子(DREB1和DREB2)[14]；較為相似的ERF和DREB根據(jù)保守結(jié)構(gòu)域的序列比對發(fā)現(xiàn)內(nèi)部的第14位和第19位氨基酸是區(qū)分ERF與DREB兩個亞家族的關鍵位點，分別為丙氨酸、天冬氨酸(A14、D19)和纈氨酸、谷氨酸(V14、E19)[8]；RAV和Soloist亞家族成員的首次發(fā)現(xiàn)同樣是在擬南芥中(RAV1和RAV2)，其中RAV亞家族廣泛參與多類生物進程，而Soloist響應植物激素水楊酸的抗病過程[15-16]。在模式植物擬南芥中，AP2/ERF家族共有175個成員，其中AP2亞家族31個，ERF亞家族77個，DREB亞家族57個，RAV亞家族7個，Soloist亞家族3個。

新疆野蘋果(Malussieversii)，又名塞威氏蘋果，主要分布在中亞地區(qū)的天山山脈[17],在中國境內(nèi)則集中分布在新疆伊犁的新源、霍城、鞏留及裕民等地[18]。新疆野蘋果受生存環(huán)境影響，能耐受低溫[19]、高溫[20]和干旱環(huán)境[21-23]，且具有抵抗多種病原菌引起的果木病害的能力，如蘋果火疫病(fire blight)[24]和青霉病(blue mold)[25-27]。隨著基因組學的發(fā)展，有研究表明新疆野蘋果是現(xiàn)代栽培蘋果(Malusdomestica)的祖先，具有重要的科研和保護價值[28-29]。但近年來新疆野蘋果種群分布面積不斷減少，已被列為國家瀕危二級保護植物[30]。最近研究表明人為干擾、蘋果小吉丁蟲(Agrilusmali)和蘋果腐爛病(Valsacanker)直接導致了新疆野蘋果大面積集中死亡[31]，因此保護新疆野蘋果種群的研究刻不容緩。

蘋果腐爛病不僅是天山野果林中新疆野蘋果的主要病害，也是中國乃至世界栽培蘋果的主要病害之一。蘋果腐爛病是一種由黑腐皮殼菌(Valsamali)侵染所致的嚴重的真菌型果樹病害，主要發(fā)病于樹干皮層、韌皮部和木質(zhì)部，造成腐爛壞死[32]。蘋果腐爛病是中國各主要蘋果產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生且危害嚴重的一種枝干型病害[33]，可使蘋果樹勢衰弱、產(chǎn)量降低，嚴重至樹枝枯死或全樹死亡[34]。目前，蘋果腐爛病的防治主要采用人工刮治和化學防治結(jié)合的方法，但存在一定問題，如費工費時和污染環(huán)境。新疆野蘋果是世界栽培蘋果的祖先種，具有較高的遺傳多樣性和豐富優(yōu)良的基因資源，在原始生境中表現(xiàn)出抵抗多種脅迫的良好適應能力，可為世界栽培蘋果的新種質(zhì)創(chuàng)制和培育提供基因資源。AP2/ERF家族中不同的亞家族均能夠參與和響應不同的生物和非生物脅迫過程，是植物脅迫響應最為關鍵的轉(zhuǎn)錄因子家族之一[35]，本研究基于已獲得的新疆野蘋果響應腐爛病病原菌侵染的全長轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對新疆野蘋果AP2/ERF基因家族進行鑒定、分類、表達模式分析以及驗證。通過對新疆野蘋果抗性基因資源的鑒定和挖掘，為新疆野蘋果腐爛病的防治研究建立堅實的理論基礎，也為栽培蘋果抗性分子育種提供候選基因。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)源及材料處理

1.1.1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)本研究基于新疆野蘋果響應腐爛病病原菌侵染全長轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(PRJNA687214)[36]，對MsAP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子基因家族進行鑒定與研究。

1.1.2 植物材料與菌株qRT-PCR試驗的植物材料為新疆野蘋果組織培養(yǎng)1月齡幼苗[37]，用于接種腐爛病病原菌為本實驗室保存的菌株EGI1(Valsamali)[38]。

1.1.3 實驗處理與樣本收集采用劃布輪法對新疆野蘋果組培苗整株進行接菌處理[39]，分別在感染后不同時間點(0、1、2和5 d)取樣并進行液氮速凍保存，每個樣本均為3個生物學重復。

1.2 MsAP2/ERFs轉(zhuǎn)錄因子鑒定

1.2.1 新疆野蘋果AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族基因檢索與鑒定從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫Pfam(http://pfam.xfam.org/)下載蛋白數(shù)據(jù)庫文件Pfam-A，并搜索AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族的Pfam編號PF00847，利用生物信息學軟件TBtools[40]進行HMM-search，從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中檢索出初步篩選蛋白序列。利用CD-hit軟件包在Linux系統(tǒng)環(huán)境下去除冗余(一致性> 95%)。

1.2.2 新疆野蘋果AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子鑒定新疆野蘋果AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子保守結(jié)構(gòu)域與保守motif分析利用NCBI-CDD batch(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi)對篩選后的蛋白序列進行保守結(jié)構(gòu)域的鑒定，利用在線motif分析網(wǎng)站MEME(http://meme-suite.org)進行保守motif的分析。

1.2.3 新疆野蘋果AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族基因系統(tǒng)進化分析加入擬南芥AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子蛋白序列，用于新疆野蘋果AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族系統(tǒng)進化分析。利用MEGA6.0軟件對新疆野蘋果AP2/ERF和擬南芥AP2/ERF保守結(jié)構(gòu)域序列進行多重比對分析，使用相鄰連接法(neighbor-joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，bootstrap設為1000。利用EvolView(https://www.evolgenius.info)對系統(tǒng)進化樹進行編輯。擬南芥AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族數(shù)據(jù)來自于植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫PlantTFDB(planttfdb.gao-lab.org)。

1.3 新疆野蘋果AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)理化性質(zhì)和亞細胞定位預測

利用在線工具ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)預測AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子的理化性質(zhì)，包括蛋白質(zhì)分子質(zhì)量和等電點。利用BUSCA(http://busca.biocomp.unibo.it)對AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子的亞細胞定位進行預測。

1.4 新疆野蘋果AP2/ERF差異表達轉(zhuǎn)錄因子篩選

使用轉(zhuǎn)錄組測定的基因差異表達數(shù)據(jù)，以Padj≤0.05，|log2Foldchange|≥1為標準進行AP2/ERF家族的差異基因篩選。

1.5 新疆野蘋果AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族基因在腐爛病菌侵染脅迫下的基因表達模式分析

提取腐爛病病原菌侵染0、1、2和5 d后的新疆野蘋果整株組培苗的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用熒光定量qRT-PCR進行目標基因相對表達量的測定?？俁NA提取使用OMEGA bio-tec公司植物RNA提取試劑盒(R6827-01)；反轉(zhuǎn)為cDNA過程使用寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司生產(chǎn)的反轉(zhuǎn)錄反應試劑盒(RR047Q)；qRT-PCR定量使用寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司生產(chǎn)的嵌合熒光法檢測酶(定量試劑盒)(RR820Q)。定量引物使用Primer5軟件進行設計，引物由上海生工生物工程公司合成，引物序列見表1。qRT-PCR定量采用Bio-Rad CFX96型熒光定量PCR儀，反應程序設定：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，循環(huán)40次。以0 d做對照，用MsERF基因作為內(nèi)參[35]，每個基因的相對表達量以平均值±標準差來顯示，采用2-ΔΔCt計算[41]。所有基因在每個時間點的相對表達量為3個生物學重復和3個技術(shù)重復?；蛳鄬Ρ磉_量數(shù)據(jù)的顯著性分析方法采用單因素方差分析和LSD多重檢驗?；赗NA-seq數(shù)據(jù)的差異表達基因的表達量分析使用每個時間點3個生物學重復的FPKM值進行計算。使用軟件GraphPad Prism 9.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析作圖。

表1 MsAP2/ERF實時熒光定量實驗引物Table 1 qRT-PCR primers for MsAP2/ERF genes

2 結(jié)果與分析

2.1 MsAP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子的鑒定及理化性質(zhì)分析

本研究基于新疆野蘋果響應腐爛病菌侵染全長轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(PRJNA687214)[36]，使用生物信息學分析軟件TBtools將轉(zhuǎn)錄組中的159 249條序列進行開放閱讀框區(qū)域查找預測，基于最長開放閱讀框原則輸出氨基酸序列結(jié)果；EMBL-EBI網(wǎng)站下載pfam-A文件，使用TBtools中的HMM Search功能，輸入AP2/ERF基因隱馬可夫模型序號PF00847進行Hmmer-search，得到初篩結(jié)果206條序列；在Linux系統(tǒng)編譯環(huán)境下，使用CD-hit軟件包，以重復度95%為標準去冗余后，再去除保守結(jié)構(gòu)域不完整序列，最終獲得106個新疆野蘋果AP2/ERF基因。

利用在線工具Expasy對新疆野蘋果106個AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子進行基本理化性質(zhì)預測，核酸長度在747～5 926 bp之間，氨基酸鏈長度在144～662 aa之間，蛋白質(zhì)分子量大小在15.3～73.5 kD之間，等電點在4.66～11.81之間，其中等電點≥7.0以上的AP2/ERF家族成員有54個，<7.0以下的成員有52個。利用在線BUSCA工具進行蛋白質(zhì)亞細胞定位預測，發(fā)現(xiàn)MsAP2/ERF蛋白主要定位在細胞核內(nèi)(86%)，其余分別定位在葉綠體(10%)、線粒體(2%)、內(nèi)膜系統(tǒng)(1%)和細胞間隙(1%)。

2.2 新疆野蘋果AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族系統(tǒng)進化分析

將106個MsAP2/ERF預測蛋白序列與175個AtAP2/ERFs轉(zhuǎn)錄因子構(gòu)建Neighbor-Joining(NJ)進化樹，結(jié)果表明MsAP2/ERFs各亞家族成員可與AtAP2/ERFs各亞家族成員有規(guī)律地聚集，根據(jù)擬南芥的亞家族分類，將106個MsAP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子成員分為5個亞家族(圖1)，分別為AP2亞家族(17個)、ERF亞家族(57個)、DREB亞家族(25個)、RAV亞家族(5個)、Soloist亞家族(2個)。

2.3 新疆野蘋果AP2/ERF家族蛋白保守結(jié)構(gòu)域和保守基序分析

在本研究中，利用NCBI-CDD-Batch對AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子蛋白序列進行保守結(jié)構(gòu)域分析,表明MsAP2/ERFs的保守結(jié)構(gòu)域種類、數(shù)量與系統(tǒng)發(fā)育進化分析結(jié)果一致。此外，ERF亞家族B1組的成員MsERF04和MsERF05，不僅含有AP2結(jié)構(gòu)域，且在C端具有TIR結(jié)構(gòu)域(圖2，a)。AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子不同亞家族之間不僅在保守結(jié)構(gòu)域種類和數(shù)量上不同，在AP2保守結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列和組成上也不同。利用MEME進行結(jié)構(gòu)域motif組成分析，共獲得8個保守基序(圖2，b、c)，結(jié)果表明所有MsAP2/ERFs轉(zhuǎn)錄因子均含有AP2保守結(jié)構(gòu)域，但不同亞家族AP2結(jié)構(gòu)域的motif組成有差異，如DREB中的AP2結(jié)構(gòu)域由motif 1、motif 2和motif 3組成，RAV亞家族的AP2結(jié)構(gòu)域主要由motif 1和motif 3組成。同時，不同亞家族含有特異性的motif，如motif 4在DREB亞家族中特異地存在，且分布緊鄰AP2結(jié)構(gòu)域；motif 6在ERF亞家族的B2組中特異地存在。

2.4 ERF/DREB亞家族成員鑒定與分析

ERF與DREB亞家族是AP2/ERF家族中數(shù)量最多、占比最大且在植物脅迫響應過程中發(fā)揮非常重要作用的亞家族。在本研究中，利用AtERF亞家族(86個)、AtDREB亞家族(45個)、MsERF亞家族(57個)和MsDREB亞家族(25個)進行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建和進一步細化分類分析。系統(tǒng)進化分析結(jié)果顯示新疆野蘋果25個DREB亞家族中缺少A1和A3組；數(shù)量上主要以A6組為主，有21個成員；A2組、A4組和A5組分別有1、2和1個成員。57個MsERF亞家族成員包括齊全了6個組，數(shù)量上主要由B2、B3和B4為主，各組成員數(shù)量如下：B1組8個，B2組15個，B3組12個，B4組17個，B5組3個和B6組2個(圖3)。

在本研究中，利用MsERFs和MsDREBs的AP2結(jié)構(gòu)域序列進行多序列比對，結(jié)果表明新疆野蘋果的AP2結(jié)構(gòu)域氨基酸組成與擬南芥一致，3個β折疊區(qū)中，β1中的第2位至第6位是AP2結(jié)構(gòu)域的保守氨基酸位點YRGV，β2區(qū)域存在AEIR 4個保守氨基酸位點，β3區(qū)域存在WLG 3個保守氨基酸位點(圖4)。新疆野蘋果和擬南芥的ERFs在第14位和19位兩個保守位點氨基酸一致，均為A14和D19(圖4)。MsDREBs和AtDREBs在第14位保守位點的氨基酸種類一致，均為纈氨酸(V14)，但擬南芥第19位氨基酸為谷氨酸(E19)，而新疆野蘋果則為亮氨酸(L19)(圖4)。

2.5 腐爛病誘導下新疆野蘋果AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子的表達

基于RNA-seq數(shù)據(jù)，以|log2Foldchange|≥1，padj < 0.05為標準進行差異基因的篩選，從106個MsAP2/ERF基因中篩選出29個差異表達基因，其中MsERF亞家族成員19個，MsDREB亞家族成員4個，MsRAV亞家族成員3個，MsAP2亞家族成員2個，MsSoloist亞家族1個。MsERF亞家族差異表達基因主要分布在B1、B2、B3、B4等4個亞組，19個MsERF基因全部受腐爛病誘導上調(diào)表達，其表達模式可聚為3類：早期(1 d)上調(diào)表達、中期(2 d)上調(diào)表達和晚期(5 d)上調(diào)表達3種表達模式(圖5，a)。MsAP2亞家族2個差異表達基因在響應腐爛病感染后均為下調(diào)表達；MsDREB亞家族成員2個基因為上調(diào)表達，2個為下調(diào)表達；差異表達RAV亞家族成員中，1個基因為上調(diào)表達，2個基因為下調(diào)表達(圖5，b)。此外，RNA-seq的FPKM值數(shù)據(jù)顯示，具有TIR保守結(jié)構(gòu)域的兩個ERF亞家族的基因表達量完全不同，其中MsERF05在4個時間點之間的表達量有明顯差異，而MsERF04則幾乎沒有檢測到表達(FPKM值為0)。因此，挑選12個受腐爛病誘導高表達或表達模式不同的差異表達基因，包含4個DREB和8個ERF基因進行了基因相對表達量的驗證。結(jié)果(圖6)顯示，在腐爛病感染后1～5 dDREB亞家族A6組基因MsDREB05相對表達量均顯著降低；其余3個基因的相對表達量在腐爛病感染5 d后顯著升高。而ERF亞家族則在1或5 d顯著上調(diào)，響應植物抵抗腐爛病過程(圖6)。其中，B4類基因MsERF40在腐爛病感染5 d后相對表達量上調(diào)了138倍，以及含TIR結(jié)構(gòu)域的MsERF05在腐爛病感染1 d后上調(diào)69倍(圖6)。

3 討 論

AP2/ERF作為植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，在植物生長發(fā)育和逆境響應過程中發(fā)揮重要作用[35，42-44]。根據(jù)對擬南芥和水稻(Oryzasativa)中的AP2/ERF基因家族研究，已建立了AP2/ERF基因家族成員經(jīng)典分類原則。首先根據(jù)成員所含保守結(jié)構(gòu)域的類型(AP2和B3結(jié)構(gòu)域)和數(shù)量來進行初步分類[8-9]，再根據(jù)與擬南芥或其他模式植物的AP2/ERF蛋白質(zhì)序列共同構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹進行亞家族分類，該分類原則已在不同物種中被廣泛使用[45-49]。本研究基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對新疆野蘋果的AP2/ERF家族進行鑒定，結(jié)果表明新疆野蘋果中涵蓋齊全了AP2/ERF基因家族的5個亞家族，且MsERF亞家族數(shù)量最多，共有57個，占比為53.77%，MsSoloist亞家族數(shù)量最少，僅有2個成員(1.89%)。我們通過進一步的亞家族分類發(fā)現(xiàn)MsERF亞家族包含了B1～B6組的全部類型，而MsDREB亞家族缺少A1和A3組，且A2、A4和A5組的成員數(shù)量相對于AtDREB亞家族都很少。由于DREB亞家族主要涉及植物抗非生物脅迫，如干旱、高鹽脅迫中起主要作用，而ERF亞家族則是在植物抗生物脅迫如抵御病原菌入侵中起主要作用[42]，推測本研究中MsDREB亞家族成員不全且數(shù)量較少的現(xiàn)象，可能為使用抗病轉(zhuǎn)錄組鑒定AP2/ERF基因家族的局限性導致。此外，與擬南芥相比，AP2、RAV和Soloist 3個亞家族成員數(shù)量占比在兩個物種間相似，而MsERF亞家族成員數(shù)量存在擴張。

AP2/ERF基因家族具有多樣的生物學功能，參與了植物諸多生物過程，其中ERF亞家族和DREB亞家族分別在植物生物和非生物脅迫響應過程中起重要作用[8，50-51]。近年來，部分DREB亞家族基因也被報道參與植物病原菌響應功能研究。如在馬鈴薯中過表達StDREB1能夠增加PR2蛋白質(zhì)、幾丁質(zhì)酶、過氧化酶等相關基因的表達量，從而提高植物對腐皮鐮孢菌(Fusariumsolani)的抗性[52]。而在擬南芥中過表達MsDREB2C則減弱了植株對兩種常見病原細菌的抵抗力[53-54]。在本研究中，RNA-seq和qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，新疆野蘋果響應腐爛病菌侵染后差異表達基因多集中(約65%)在MsERF亞家族，這與已有文獻報道ERF家族在植物免疫防御病原菌過程中起關鍵作用的觀點一致。19個差異表達的MsERF基因分為早、中和晚期3種表達模式，暗示不同的MsERF基因在調(diào)控新疆野蘋果抵御腐爛病菌過程中可能分工不同。此外，本研究共鑒定到25個MsDREB基因，其中4個MsDREB基因受腐爛病病原菌誘導表達，且都在感染后5 d顯著差異表達，推測MsDREB基因可能在新疆野蘋果腐爛病響應晚期中發(fā)揮作用。另外，前人研究表明Soloist基因能夠增強植株對灰霉菌的抗性[55]，而在本研究中共鑒定到2個MsSoloist基因，其中1個MsSoloist(MsSoloist02)在腐爛病菌侵染后1、2和5 d均呈現(xiàn)上調(diào)表達趨勢，證明MsSoloist在新疆野蘋果對腐爛病菌響應的早中晚期均起作用。

TIR結(jié)構(gòu)域(Toll/interleukin-1 receptor domain)是一類存在于動、植物中的受體蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域在植物病原菌響應中發(fā)揮了重要的作用。SARM1(sterile alpha and TIR motif containing 1)蛋白質(zhì)通過TIR結(jié)構(gòu)域識別病原菌效應蛋白從而啟動宿主的免疫反應，也可通過介導NAD+的裂解活性參與宿主的細胞壞死過程，從而參與植物免疫反應[56]。在擬南芥中含有TIR結(jié)構(gòu)域的AtTPR1可通過抑制負向調(diào)節(jié)因子從而激活R蛋白所介導的免疫反應[57]。但目前關于同時存在AP2和TIR兩類保守結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子及其功能尚未見報道。本研究中，MsERF亞家族的2個B1組成員(MsERF04和MsERF05)同時含有AP2結(jié)構(gòu)域和TIR結(jié)構(gòu)域。此外，這兩個MsERF基因的C-末端還含有EAR motif(ERF-associated amphiphilic repression)。EAR motif一般認為在負調(diào)控植物逆境響應中起作用[58-59]。而RNA-seq數(shù)據(jù)顯示，兩個具有TIR保守結(jié)構(gòu)域的基因在表達模式上完全不同，MsERF05在4個時間點之間的表達量有明顯差異，而MsERF04則幾乎沒有檢測到表達(FPKM值為0)，表明只有MsERF05受腐爛病病原菌誘導表達，而且qRT-PCR數(shù)據(jù)也證明MsERF05在1 d上調(diào)表達69倍。由此推測，TIR和EAR兩個結(jié)構(gòu)域在該基因的抗病響應中起到關鍵作用，下一步將圍繞這個特殊的ERF基因(MsERF05)開展抗病功能的研究。

綜上所述，基于MsAP2/ERF家族基因的特殊保守結(jié)構(gòu)域和基因表達模式的結(jié)果分析，初步靶定MsERF40和MsERF05這兩個ERF基因作為重點研究對象，將展開后續(xù)基因功能鑒定和調(diào)控抗病分子機制研究。通過對新疆野蘋果基因資源的挖掘與利用，有助于建立新疆野蘋果腐爛病的防治研究的理論基礎，為世界栽培蘋果抗性分子育種提供優(yōu)質(zhì)候選基因。