寧小萌，孫晶晶，馮思雨，李天驕，任占辰，李然紅

(牡丹江師范學(xué)院 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，黑龍江牡丹江 157012)

白樺(Betulaplatyphylla)為樺木屬落葉喬木，也被稱為亞洲白樺、西伯利亞白樺，主要分布于中國東北地區(qū)，是一種具有重要應(yīng)用價(jià)值的樹種[1]。白樺在生長發(fā)育過程中常遭受到許多病原菌的侵害，如立枯病、葉枯病、根腐病等。立枯病嚴(yán)重危害處于生長期的幼苗，致死率達(dá)到30%～60%[2]；葉枯病是一種葉部病害，能使葉片產(chǎn)生大量壞死性病斑，導(dǎo)致葉片枯萎甚至提前脫落，致使大量苗木死亡[3]；根腐病主要危害植株根部，使植株底部葉片發(fā)黃脫落，植株產(chǎn)生矮化現(xiàn)象，最后整株葉片死亡[4]?；瘜W(xué)農(nóng)藥是防治白樺病害的有效措施，但副作用也尤為明顯，會(huì)對(duì)生態(tài)環(huán)境造成不可逆轉(zhuǎn)的破壞。白樺抗病品種的培育，可減少白樺病害的發(fā)生，并可避免農(nóng)藥使用的不良影響，因而成為重要的研究課題。

轉(zhuǎn)錄因子是某些能和基因的特定序列專一結(jié)合從而保證目的基因能夠以特定的強(qiáng)度在特定的時(shí)間和空間表達(dá)的蛋白質(zhì)分子，也被稱為反式作用因子，在植物的生長發(fā)育及對(duì)外界環(huán)境的反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用[5-6]。Trihelix家族是植物特有的轉(zhuǎn)錄因子家族[7]，其特點(diǎn)是在DNA結(jié)合域中含有一個(gè)典型的螺旋-環(huán)-螺旋-環(huán)-螺旋的三螺旋結(jié)構(gòu)[8]，該結(jié)構(gòu)域可以特異地與DNA序列中的光響應(yīng)所需的GT元件結(jié)合，所以該家族也被稱為GT家族[9]。在早期研究中，Trihelix家族功能主要與光反應(yīng)調(diào)節(jié)有關(guān)[10]，近些年，Trihelix家族的其他生物學(xué)功能逐漸被發(fā)現(xiàn)，它們能夠調(diào)控一系列植物器官如胚胎、氣孔、種子及花的發(fā)育過程[11-15]，更重要的是它們能對(duì)植物中不同的非生物及生物脅迫做出反應(yīng)，如OsGTγ1可以被鹽脅迫強(qiáng)烈誘導(dǎo)，過表達(dá)該基因的水稻(Oryzasativa)耐鹽性有所增強(qiáng)[16]。大豆(Glycinemax)GmGT2A和GmGT2B在擬南芥(Arabidopsisthaliana)中過表達(dá)，轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)鹽、冷凍和干旱脅迫的抗性提高，且GmGT2B會(huì)賦予轉(zhuǎn)基因植株對(duì)ABA的耐受性[17]。在大豆受到丁香假單胞菌番茄致病變種 DC3000(Pseudomonassringaepv.tomato)的侵染30 min內(nèi)，SCaM-4的轉(zhuǎn)錄被迅速誘導(dǎo)，經(jīng)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)GT-1順式作用元件是該基因的核心順式作用元件，GT-1-like轉(zhuǎn)錄因子——AtGT-3b也能與該順式作用元件結(jié)合，并在NaCl和病原菌處理30 min內(nèi)也被迅速誘導(dǎo)[18]，說明AtGT-3b在大豆抗DC3000的侵染反應(yīng)中起作用。毛果楊(Populustrichocarpa)受到鏈格孢霉菌(Alternariaalternata)侵染后，除了3個(gè)Trihelix家族成員表達(dá)量下調(diào)，其他成員表達(dá)量均上調(diào)，且將PtrGT10在秋子梨(Pyrusussuriensis)中抑制表達(dá)后，活性氧和MDA的含量均下降，細(xì)胞死亡率有所降低[19]。有關(guān)Trihelix家族功能的研究主要集中在光反應(yīng)、對(duì)植物生長發(fā)育的調(diào)控及抵抗各種非生物脅迫上，在抗病反應(yīng)中的研究鮮見報(bào)道。本研究采用生物信息學(xué)方法，對(duì)白樺Tihelix家族成員進(jìn)行鑒定比較，并分析白樺Trihelix家族成員組織表達(dá)特異性及病原菌脅迫響應(yīng)情況，為進(jìn)一步了解Trihelix家族成員的結(jié)構(gòu)與功能提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料和處理

(1)供試植物及病原真菌：用于鏈格孢霉菌侵染的白樺植株為40～50 cm的白樺幼苗，用于立枯絲核菌侵染的植株為無菌土培苗，高度為6～8 cm。供試植株均為組織培養(yǎng)所得無性系。培養(yǎng)條件為28 ℃、光照/黑暗為16 h/8 h，光照強(qiáng)度1 500 Lx。致病菌鏈格孢霉菌(Alternariaalternata)和立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)為本實(shí)驗(yàn)室保存。

(2)培養(yǎng)基：使用馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(potato dextrose agar，PDA)培養(yǎng)兩種病原菌，培養(yǎng)基成分為馬鈴薯300 g/L+葡萄糖20 g/L+瓊脂20 g/L。白樺擴(kuò)繁培養(yǎng)基：WPM 2.14 g/L+瓊脂7 g/L+蔗糖20 g/L+Ca(NO3)20.56 g/L+6 BA 1.5 mg/L+NaOH 1 mL/L；生根培養(yǎng)基：WPM 2.14 g/L+瓊脂7 g/L+蔗糖20 g/L+Ca(NO3)20.56 g/L+NAA 0.2 mg/L+NaOH 1mL/L；無菌土培苗的培養(yǎng)：草炭土和蛭石比例為1∶1，將二者混勻后加入蒸餾水至潮濕狀態(tài)。

(3)病原菌侵染：將鏈格孢霉菌(Alternariaalternata)菌株接種于PDA斜面上擴(kuò)大培養(yǎng)，于25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6～7 d，在長滿菌絲的斜面中加入無菌水后震蕩，再用雙層紗布過濾掉菌絲，收集孢子懸浮液，無菌水沖洗濾渣2～3次，將濾液定容至10 mL。用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，孢子懸浮液稀釋濃度至105個(gè)/mL。采用噴霧法將孢子懸浮液均勻噴到植株葉片上，將植株置于透明的塑料箱中密閉保濕24 h，然后轉(zhuǎn)移至光照培養(yǎng)箱中，28℃、光照/黑暗16 h/8 h、光照強(qiáng)度1 500 Lx條件下培養(yǎng)，每天觀察植株染病情況；將立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)接種于PDA平板上，置于25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6～7 d，待菌絲長滿整個(gè)培養(yǎng)皿，用無菌刀片刮取0.05 g菌絲，加入20 mL無菌水配制成菌懸液，采用注射法，將菌懸液注射到白樺幼苗根部。分別在侵染6、12、24和48 h，以及3、5、7 d后，取鏈格孢霉菌侵染的植株葉片以及立枯絲核菌侵染的整個(gè)植株作為樣品，液氮速凍后于-80 ℃中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 白樺Trihelix家族成員的鑒定利用COGE數(shù)據(jù)庫(https://genomevolution.org/coge/)篩選白樺基因組序列中Trihelix基因序列，篩選掉序列中的重復(fù)序列，并在NCBI中進(jìn)行同源比對(duì)及保守結(jié)構(gòu)域分析，保留含有Trihelix結(jié)構(gòu)域的序列，確定為白樺Trihelix家族成員。

1.2.2 白樺Trihelix家族生物信息學(xué)分析利用Phytozome v12.1數(shù)據(jù)庫(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#)查詢毛果楊和擬南芥Trihelix家族蛋白序列；利用Clustal X軟件進(jìn)行基因家族氨基酸序列的多序列比對(duì)，利用MEGA7.0軟件并采用鄰接法構(gòu)建進(jìn)化樹；從COGE數(shù)據(jù)庫中獲得白樺每個(gè)Trihelix家族成員啟動(dòng)子上游1 500 bp的基因序列，并用Plant CARE(http:// bioinformatics.psb.ugent.bewebtoolsplantcarehtml)預(yù)測(cè)其順式作用元件。使用Origin8.5制作折線圖。其他分析網(wǎng)站及軟件見表1。

表1 生物信息學(xué)分析的軟件及網(wǎng)址Table 1 Software and website for bioinformatic analysis

1.2.3 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄使用植物總RNA提取試劑盒(BioTeke, 無錫)提取白樺根、莖、葉部位的總RNA及兩種病菌侵染后各時(shí)間段樣品的總RNA。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA提取質(zhì)量，超微量分光光度計(jì)測(cè)量RNA濃度。以1 μg的RNA為模板，利用反轉(zhuǎn)錄酶(Vazyme, 南京)將其反轉(zhuǎn)錄合成為cDNA。

1.2.4 熒光定量PCR以白樺持家基因18S rRNA、肌動(dòng)蛋白基因Actin和泛素基因Ubiquitin為內(nèi)參基因，以莖中BpTrihelix1基因?yàn)閷?duì)照，計(jì)算根和葉片中各基因的相對(duì)表達(dá)量；以未感病時(shí)葉片中BpTrihelix1基因?yàn)閷?duì)照，計(jì)算鏈格孢霉感染后各基因的相對(duì)表達(dá)量；以未感病時(shí)整株的BpTrihelix1基因?yàn)閷?duì)照，計(jì)算立枯絲核菌感染后各基因的相對(duì)表達(dá)量；使用引物序列見表2。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 15 s，58 ℃ 45 s，共45個(gè)循環(huán)。每個(gè)處理進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)，以2-ΔΔCT法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

表2 熒光定量所用的基因引物序列Table 2 Primer sequences of the genes used for quantitative real-time PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 白樺Trihelix家族成員蛋白理化性質(zhì)分析

經(jīng)過篩選重復(fù)序列、保守結(jié)構(gòu)域鑒定以及同源性比對(duì)，最終獲得了8個(gè)Trihelix家族成員(表3)。根據(jù)其在染色體上的位置，將其命名為BpTrihelix1-BpTrihelix8(圖1)。在8個(gè)家族成員中，長度最長的序列為BpTrihelix5 (8 934 bp)，長度最短的為BpTrihelix8(2 049 bp)；氨基酸的數(shù)量在307～591 aa之間(表3)；氨基酸分子量在35 633.96～81 871.27 Da之間；等電點(diǎn)在5.32～8.67之間，且均為疏水性氨基酸；亞細(xì)胞定位結(jié)果表明，所有家族成員均定位在細(xì)胞核中。

表3 白樺Trihelix家族成員基本信息Table 3 Basic information of Trihelix family members in birch

2.2 白樺Trihelix家族蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析

系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示(圖2)，8條白樺Trihelix家族氨基酸序列被分為4個(gè)分支，分別為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ。其中Ⅲ中包含白樺Trihelix蛋白序列最多，含有3條；Ⅰ和Ⅱ均含有2條白樺Trihelix蛋白序列；Ⅳ中包含1條白樺Trihelix蛋白序列，數(shù)量最少。

2.3 白樺Trihelix基因結(jié)構(gòu)分析及蛋白結(jié)構(gòu)分析

基因結(jié)構(gòu)如圖3所示，白樺Trihelix家族成員含有2～5個(gè)外顯子，其中，BpTrihelix1含有的外顯子數(shù)量最多為5個(gè)，BpTrihelix5和BpTrihelix7均含有3個(gè)外顯子，BpTrihelix2、BpTrihelix3、BpTrihelix4、BpTrihelix6和BpTrihelix8均含有2個(gè)外顯子。利用DNAMAN軟件對(duì)白樺Trihelix家族成員的氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)(圖4)，結(jié)果表明Trihelix家族成員都具有螺旋-環(huán)-螺旋-環(huán)-螺旋這一特殊構(gòu)象。利用MEME網(wǎng)站對(duì)白樺Trihelix家族成員蛋白序列進(jìn)行Motif搜索，設(shè)置搜索數(shù)量為10個(gè)，結(jié)果如圖5所示，所有家族成員均含有數(shù)量不等的保守基序，且所有家族成員均含有Motif 1基序。不同亞家族間保守基序也有差異，如Motif 10僅存在于第Ⅱ亞家族中，Motif 9僅存在于第Ⅲ亞家族中。

2.4 白樺Trihelix家族啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件預(yù)測(cè)

將白樺Trihelix家族各成員上游1 500 bp的序列確定為啟動(dòng)子序列，利用PLANT Care進(jìn)行順式作用元件預(yù)測(cè)，結(jié)果如表4所示。白樺Trihelix家族含有種類較為豐富的順式作用元件，除了一些真核啟動(dòng)子的必需元件，如CAAT-box、TATA-box外，還有一些與植物脅迫、生長發(fā)育、激素響應(yīng)及光應(yīng)答相關(guān)的元件。其中BpTrihelix2、BpTrihelix3、BpTrihelix4和BpTrihelix7含有脅迫相關(guān)元件的數(shù)量和種類較多，推測(cè)它們可能在不同的脅迫下起關(guān)鍵作用；BpTrihelix4、BpTrihelix5和BpTrihelix6含有激素響應(yīng)相關(guān)元件種類較多，推測(cè)它們能夠?qū)Σ煌N類激素有響應(yīng)；BpTrihelix4含有的光響應(yīng)元件種類最多，推測(cè)BpTrihelix4可能對(duì)光響應(yīng)過程起調(diào)控作用。

表4 白樺Trihelix家族啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件預(yù)測(cè)Table 4 Prediction of cis-acting elements of Trihelix family promoters in birch

2.5 白樺Trihelix家族成員組織表達(dá)分析

瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)表明，RNA提取無降解(圖6)，且OD260/280在1.7～2.0之間，符合實(shí)驗(yàn)要求。根據(jù)相對(duì)定量的結(jié)果,用Clustvis制作熱圖(圖7)，結(jié)果表明，所有基因在不同組織中均有表達(dá)，其中的BpTrihelix3在葉片中表達(dá)量最高，隨后依次是BpTrihelix4、BpTrihelix7、BpTrihelix1、BpTrihelix5、BpTrihelix8、BpTrihelix6，BpTrihelix2的表達(dá)量最低；BpTrihelix3在莖中表達(dá)量最高，然后是BpTrihelix7、BpTrihelix1、BpTrihelix4、BpTrihelix5、BpTrihelix8、BpTrihelix2，BpTrihelix6的表達(dá)量最低；BpTrihelix3在根中表達(dá)量最高，然后是BpTrihelix1、BpTrihelix7、BpTrihelix5、BpTrihelix4、BpTrihelix6、BpTrihelix8，BpTrihelix2的表達(dá)量最低。

2.6 鏈格孢霉菌侵染后Trihelix基因家族的表達(dá)

為研究白樺Trihelix基因家族成員對(duì)鏈格孢霉的響應(yīng)情況，分別對(duì)侵染不同時(shí)間的白樺植株葉片中各基因的表達(dá)量進(jìn)行分析，結(jié)果(圖8)顯示：BpTrihelix3、BpTrihelix4和BpTrihelix7的表達(dá)量有明顯的變化，且三者的表達(dá)量均呈先上升后下降的趨勢(shì)。在感病24 h時(shí)，三者的表達(dá)量開始上升，BpTrihelix3和BpTrihelix4的表達(dá)量均在2 d時(shí)達(dá)到峰值，此時(shí)，相對(duì)表達(dá)量分別為對(duì)照的31.1和38.7倍，BpTrihelix7的表達(dá)量在感染5 d時(shí)達(dá)到峰值，相對(duì)表達(dá)量為對(duì)照的6倍；BpTrihelix1和BpTrihelix5的表達(dá)量在2 d時(shí)開始有微弱的變化，其余基因的表達(dá)量幾乎無變化。

2.7 立枯絲核菌侵染后Trihelix基因家族成員的表達(dá)

為研究白樺Trihelix基因家族成員對(duì)立枯絲核菌的響應(yīng)情況，分別對(duì)侵染不同時(shí)間的白樺幼苗整株中各基因的表達(dá)量進(jìn)行分析，結(jié)果如圖9所示。其中，BpTrihelix3、BpTrihelix4和BpTrihelix7表達(dá)量的變化最為明顯，且三者的表達(dá)量均是在感病后開始下降，直到12 h開始上升，在24 h達(dá)到峰值，相對(duì)表達(dá)量分別為對(duì)照的10.3倍、6.7倍和9.4倍；BpTrihelix1和BpTrihelix5的表達(dá)量也有不同變化，二者的表達(dá)量也在感病后呈下降趨勢(shì)，不同的是，BpTrihelix5的表達(dá)量在感病6 h時(shí)開始升高，在12 h達(dá)到峰值；BpTrihelix1的表達(dá)量在12 h時(shí)才開始上升，在24 h達(dá)到峰值；其余基因的表達(dá)量無明顯變化。

3 討 論

轉(zhuǎn)錄因子能夠與基因啟動(dòng)子上的順式作用元件結(jié)合，在細(xì)胞核中調(diào)控下游靶基因的表達(dá)[20]。Trihelix家族是一類轉(zhuǎn)錄因子家族，最早在豌豆中被發(fā)現(xiàn)[10]，隨后，在擬南芥、水稻中陸續(xù)鑒定出多個(gè)該家族成員[21-22]。本研究在白樺中共鑒定到8個(gè)Trihelix家族成員，均定位在細(xì)胞核中，符合轉(zhuǎn)錄因子的細(xì)胞定位特征。Trihelix家族基因發(fā)揮作用主要通過與GT元件結(jié)合得以實(shí)現(xiàn)，GT元件屬于順式作用元件，最初的研究證明該元件與光反應(yīng)有關(guān)。近些年不同功能的GT元件被鑒定出來[23]，如大豆中的SBF-1因子能與Box1、Box2及Box3元件結(jié)合，從而參與植物生長發(fā)育過程[24]。GT-1-like轉(zhuǎn)錄因子——AtGT-3b可以與GT-1元件結(jié)合，在擬南芥病原菌脅迫中發(fā)揮作用[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，白樺Trihelix家族各成員均含有典型的三螺旋結(jié)構(gòu)，具備與GT元件結(jié)合的結(jié)構(gòu)特征，且其啟動(dòng)子上具有與抗脅迫、生長發(fā)育和激素調(diào)節(jié)有關(guān)的順式作用元件，推測(cè)白樺Trihelix家族成員可能參與白樺的生長發(fā)育以及各種非生物脅迫和生物脅迫響應(yīng)等生命過程。

研究表明，Trihelix家族基因在不同組織和器官中均有不同程度的表達(dá)。大豆中，GmGT2A在莖中的表達(dá)量最高，在種子中表達(dá)量則為0[25]；棉花GhGTs基因在棉花的根、莖、葉、花、胚珠及纖維均有表達(dá)，但表達(dá)程度有所不同[26]。本研究發(fā)現(xiàn)，白樺Trihelix家族成員在根、莖、葉中均有不同程度的表達(dá)，如BpTrihelix1、BpTrihelix4和BpTrihelix7在葉中的表達(dá)量較高，在根中的表達(dá)量卻極低，而BpTrihelix3在根、莖、葉中的表達(dá)量均為最高?；蛟诓煌鞴僦械牟町惐磉_(dá)暗示著它們?cè)谥参锏牟煌M織、器官中各自發(fā)揮著不同的調(diào)節(jié)作用。Trihelix家族被分為GT-1、GT-2、GTγ、SH4和SIP1五個(gè)亞家族，其中，GT-2亞家族被證明包含兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域[27]，并具有抗非生物脅迫及生物脅迫功能。如擬南芥AtGT2L基因受到低溫、高鹽和ABA脅迫時(shí)，其表達(dá)量被迅速誘導(dǎo)[28]；楊樹中的PtaGTL1是一種Ca2+-CaM結(jié)合蛋白，能通過調(diào)節(jié)植物氣孔密度影響其蒸騰作用，從而提高植物耐旱性[29]；AtGTL1是擬南芥GT-2亞家族成員之一，研究發(fā)現(xiàn)它屬于AtMPK4信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的一部分，能協(xié)調(diào)水楊酸的代謝，賦予植物對(duì)丁香假單胞菌的免疫力[30]。本研究使用兩種病原菌侵染白樺幼苗，發(fā)現(xiàn)BpTrihelix3、BpTrihelix4和BpTrihelix7的表達(dá)量變化最為明顯，氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，這3個(gè)基因均具有N端的TN和C端的TC結(jié)構(gòu)域，符合GT-2亞家族的結(jié)構(gòu)特征，說明它們屬于GT-2亞家族成員，并可能在白樺的抗病反應(yīng)過程中具有積極作用。

本研究利用生物信息學(xué)方法篩選鑒定出8個(gè)白樺Trihelix家族成員，并對(duì)該家族成員的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行了初步研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BpTrihelix3、BpTrihelix4和BpTrihelix7在白樺各組織中表達(dá)量均較高，且都具備GT-2亞家族成員的結(jié)構(gòu)特征，并顯著響應(yīng)兩種病原菌的侵染，說明它們?cè)诎讟蹇共∵^程中可能發(fā)揮重要作用，但具體作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。本研究為Trihelix家族基因在白樺抗病過程中的功能研究提供了參考。