楊志敏，岳宏忠，張海強，李玉紅*

(1 西北農(nóng)林科技大學 園藝學院，陜西楊陵 712100；2 甘肅農(nóng)業(yè)科學院 蔬菜研究所，蘭州 730070)

雄性不育不僅作為重要的農(nóng)藝性狀多用于作物雜交育種和雜種優(yōu)勢利用[1-2]，而且也是研究花藥發(fā)育的重要材料。擬南芥[3-4]、水稻[5-6]等模式植物關(guān)于雄性不育的報道較多且研究相對較深入，已克隆了多個雄性不育基因。葫蘆科作物的雄性不育材料較少，且研究多集中于雄性不育突變體表型鑒定、生理生化指標測定、細胞學觀察及突變體在育種中的應(yīng)用方面[7-13]，關(guān)于雄性不育基因定位與克隆的報道較少[14-15]。因此，很有必要對葫蘆科作物雄性不育材料開展基因挖掘研究，為育種提供可利用的基因資源。

黃瓜(CucumissativusL.)是世界上最重要的蔬菜作物之一[16-17]。中國是全球黃瓜生產(chǎn)面積最大、產(chǎn)量最高的國家。2020年中國黃瓜種植面積達127萬hm2，占全球的56.4%(http://www.fao.org/faostat/en/)。據(jù)此估算，需要的黃瓜生產(chǎn)用種量達到1.3×103t。人工雜交制種是中國黃瓜種子生產(chǎn)的主要方法[18]，且栽培面積較大的華北型黃瓜很少有雌性系品種[1]，因此，雄性不育材料在黃瓜人工雜交育種生產(chǎn)中的應(yīng)用會降低成本。對黃瓜雄性不育的研究，早期多集中于表型鑒定如無花瓣ap、多向性花粉敗育ms-1、雄花敗育ms-2、花朵閉合cl等雄性不育突變體的研究[10-13]，因這些突變體具有不良的農(nóng)藝學性狀，未應(yīng)用于育種實踐。近年來，對黃瓜雄性不育的研究有了新的進展。Zhang等[19]對花粉不育突變體ps進行遺傳研究，發(fā)現(xiàn)與雄花敗育突變體ms-2等位，但并未克隆MS-2雄性不育基因。Han等[14]克隆了黃瓜雄性不育突變體ms-3的候選基因，該基因編碼homeodomain (PHD) finger蛋白。Niu等[20]發(fā)現(xiàn)了一個與葉型相關(guān)的“mango”突變體，該突變體也具有雄性不育的性狀，圖位克隆了其候選基因CsWOX1，該基因編碼WUSCHEL-related homeobox1蛋白。此外，研究發(fā)現(xiàn)敲除擬南芥SPOROCYTELESS(AtSPL)的同源基因CsSPL可使黃瓜雄性和雌性育性均降低[21]；沉默擬南芥GLABRA2(AtGL2)同源基因CsGL2-LIKE會降低黃瓜雄性育性、延遲雄花開花[22]；反義抑制營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運相關(guān)基因HexoseTransporter1(CsHT1)會使黃瓜雄性育性降低、種子發(fā)育異常，下調(diào)SucroseTransporter1(CsSUT1)的表達會延遲黃瓜雄花發(fā)育、雄性育性降低甚至敗育[23-24]。

盡管已有上述研究，但通過正向遺傳學的方法僅克隆了ms-3候選基因，挖掘的雄性不育基因嚴重不足，非常有必要利用新的雄性不育突變體，開展黃瓜雄性不育基因的挖掘研究。本課題組從黃瓜EMS突變體庫中篩選到的1個性狀穩(wěn)定遺傳的新雄性不育突變體C0128，本研究以該突變體為材料，對其不育特征及遺傳規(guī)律進行了分析，利用分子標記對突變體的不育基因(暫命名MS-4)進行初步定位，為進一步克隆目標基因、研究該基因功能及在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

本研究以雄性不育突變體C0128及野生型CCMC、育性正常的北美腌漬型黃瓜Gy14為試驗材料。以雄性不育突變體C0128作為母本，分別與CCMC和Gy14雜交，構(gòu)建F1及相應(yīng)的F2遺傳群體進行表型觀察、遺傳規(guī)律分析和基因定位。所有黃瓜材料種植于西北農(nóng)林科技大學園藝場的塑料大棚里，常規(guī)管理。

1.2 試驗方法

1.2.1 突變體C0128的雄花表型觀察分別隨機選5株突變體C0128與野生型植株，取開放前同一時期的雄花花芽和開放當天的雄花，于冰盒中帶回實驗室，在體式顯微鏡下觀察雄花發(fā)育情況。

1.2.2 突變體C0128育性鑒定在盛花期早晨8:00～10:00分別取野生型和突變體各10朵開放雄花于冰盒中，帶回實驗室進行TTC(質(zhì)量濃度百分比為2%)染色觀察和花粉管體外萌發(fā)試驗。在載玻片中央滴1滴2%的TTC溶液，輕輕抖動雄蕊，使花粉均勻散在溶液中，蓋上蓋玻片置濕潤濾紙上，在35 ℃恒溫培養(yǎng)箱中染色10～15 min。用光學顯微鏡觀察染色情況，每張載玻片取花粉粒均勻的3個視野統(tǒng)計花粉敗育情況并進行顯著性分析。

在顯微鏡下觀察突變體和野生型的花粉萌發(fā)情況，花粉管的體外萌發(fā)方法參照王潔[25]，野生型和突變體各取5朵當天開放的雄花，每張載玻片在顯微鏡下選取花粉粒均勻的3個視野用于數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析，花粉管長度大于或等于花粉粒直徑的花粉粒表明其具有萌發(fā)能力[26]。

以野生型CCMC和突變體C0128作為親本，分別進行自交和正反交，即4種組合：CCMC?、C0128?、CCMC(♂)×C0128(♀)、C0128(♂)×CCMC(♀)，每個組合在不同植株上選10朵當天開放的雌花授粉。授粉后及時掛吊牌標明所做的雜交組合及雜交時間。授粉24 h后，次日同一時間點每個組合各取5組雌花和子房，放在冰盒中帶回實驗室。具體試驗方法參照Cheng[23]，染色后將組織放到載玻片上在熒光顯微鏡紫外光(405 nm)下觀察花粉管體內(nèi)萌發(fā)情況并拍照分析。余下的5組授粉果，在授粉35 d后采收成熟的果實，剖開并觀察果實內(nèi)部種子的發(fā)育情況。

1.2.3 不育性狀遺傳規(guī)律分析分別在田間觀察CCMC×C0128的F1、F2和Gy14×C0128的F1、F2共4個群體的單株表型，統(tǒng)計各群體的可育株與不育株的性狀分離比，用卡方測驗分析雄性不育性狀的遺傳規(guī)律。

1.2.4 目的基因的初步定位采用CTAB法分別提取兩親本C0128和Gy14的DNA，利用實驗室已有的、均勻分布在黃瓜7條染色體上的SSR引物和InDel引物，以兩親本的DNA為模板進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，觀察分析電泳條帶結(jié)果，從而篩選出在兩親本間具有多態(tài)性的引物。采用混合分組分析法(Bulked Segregant Analysis，BSA)，在作圖群體中分別隨機選取7株雄性可育株和不育株，提取基因組DNA(質(zhì)量濃度均控制在50 ng/μL)，等量分別混勻構(gòu)建雄性可育池和雄性不育池。

利用在兩親本間篩選出的多態(tài)性引物，分別以兩池的DNA為模板，進行PCR擴增和PAGE電泳，在兩池間進一步篩選具有多態(tài)性的標記，確定雄性不育基因MS-4所在染色體。利用兩池間具有多態(tài)性的引物在Gy14×C0128 F2的64株作圖小群體中，以每個單株的DNA為模板進行PCR擴增和PAGE電泳，電泳帶型與突變體C0128帶型一致的記為A，與野生型Gy14帶型一致的記為B，與F1帶型一致的記為H。觀察分析小群體植株表型和電泳帶型結(jié)果，篩選交換單株，進行MS-4初步定位。然后在此基礎(chǔ)上，繼續(xù)擴大定位群體和開發(fā)新的標記，逐步縮小MS-4定位區(qū)間。

PCR反應(yīng)和PAGE電泳分析參考Weng等[27]，連鎖分析參見Rong等[28]。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體C0128的雄花表型觀察

突變體除雄花發(fā)育存在差異外，在其他主要農(nóng)藝性狀如株高、莖粗等方面與野生型植株無差異。突變體的雄花具有正常形態(tài)的花萼(圖1，A-B)，花瓣和花藥小于野生型，花藥顏色與野生型一樣呈現(xiàn)金黃色，但花藥上無明顯的花粉粒(圖1，C-D)。

2.2 突變體C0128花粉育性分析

花粉粒的TTC染色和花粉體外萌發(fā)試驗結(jié)果表明，野生型的花粉粒大多數(shù)可以被染成紅色(圖2，B)，且多數(shù)花粉粒經(jīng)過25 ℃孵育2 h后花粉管明顯伸長(圖2，D)，花粉活力和萌發(fā)率均在80%以上(圖2，E-F)；而突變體雄花在視野下無花粉及花粉粒萌發(fā)(圖2，A、C)，說明突變體的雄性不育是由于花粉粒的缺失造成的。

利用苯胺藍染色法對花粉在體內(nèi)萌發(fā)情況進行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)野生型CCMC作為父本的組合，柱頭上附著的花粉粒(圖3，A、C)及在子房中已萌發(fā)伸長的花粉管(圖3，B、D)均可以被苯胺藍染色，而突變體C0128作為父本的組合檢測不到柱頭上的花粉粒(圖3，E、G)及子房中萌發(fā)的花粉管(圖3，F(xiàn)、H)，再次驗證了突變體C0128是花粉缺失型突變體。

對上述4種組合的果實進行留種觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)野生型CCMC作為父本的組合均可以獲得正常發(fā)育且飽滿的種子(圖4，A-B)，而突變體C0128作為父本的組合內(nèi)部全為癟種子，剝開種皮發(fā)現(xiàn)沒有胚和胚乳(圖4，C-D)。該結(jié)果表明突變體作為父本子代不育，但作為母本子代可育，說明突變體C0128雄性不育，但雌性可育。

2.3 突變體雄性不育表型的遺傳規(guī)律分析

CCMC×C0128和Gy14×C0128的F1代植株雄花和雌花發(fā)育均表現(xiàn)正常。在CCMC×C0128的146株F2群體中，可育株∶不育株為103∶43，分離比約為3∶1(P=0.214 1)；在Gy14×C0128的1 231株F2群體中，可育株∶不育株為908∶323，分離比也約為3∶1(P=0.315 5)。經(jīng)卡方測驗符合孟德爾遺傳定律，表明突變體C0128的雄性不育性狀可能由1對隱性核基因調(diào)控。

2.4 突變體雄性不育基因MS-4定位

利用實驗室已合成的均勻分布在黃瓜7條染色體上的SSR引物和InDel引物，在兩親本之間篩選出110對具有多態(tài)性的引物，進一步在雄性可育池/不育池之間篩選，共篩選出8對在兩池間具有多態(tài)性的引物(表1)，且這8對多態(tài)性SSR引物都位于黃瓜第3染色體上。

表1 突變體C0128雄性不育基因MS-4定位所用標記Table 1 Markers for MS-4 mapping of mutant C0128 male sterile gene

利用這8對多態(tài)性引物在64株的作圖小群體中進行MS-4的初步定位，構(gòu)建初定位遺傳圖譜(圖5，A)，將MS-4定位在Chr3的Li162和Li172兩個標記之間的5.1 Mb區(qū)間內(nèi)。在該定位區(qū)間開發(fā)sf06、sf14、sf46和sf43共4對與MS-4緊密連鎖的SSR分子標記，并擴大定位群體至1 231株，最終將MS-4定位在sf14和sf46兩個標記之間1.21 Mb區(qū)間內(nèi)(圖5，B)。

通過葫蘆科基因組網(wǎng)站對MS-4定位的1.21 Mb區(qū)間基因進行分析，發(fā)現(xiàn)該區(qū)間內(nèi)共有149個基因，主要編碼轉(zhuǎn)錄因子(如MYB、bHLH等轉(zhuǎn)錄因子)、各種酶類(如激酶、轉(zhuǎn)移酶、合成代謝酶)和蛋白質(zhì)等。149個基因中有8個基因可能會影響黃瓜雄性育性，分別是CsaV3_3G015960、CsaV3_3G016780、CsaV3_3G016880、CsaV3_3G017010、CsaV3_3G017120、CsaV3_3G017190、CsaV3_3G017210、CsaV3_3G017220，分別編碼轉(zhuǎn)錄因子RF2a(Transcription factor RF2a)、雙組分響應(yīng)調(diào)節(jié)器ARR14-like(Two-component response regulator ARR14-like)、雄蕊特異蛋白FIL1-like(Stamen-specific protein FIL1-like)、皮瓣核酸內(nèi)切酶GEN-Like(Flap endonuclease GEN-like)、假定的肌動蛋白解聚因子(Actin depolymerizing factor, putative)、細胞色素P450(Cytochrome P450)、信號肽類肽酶3(Signal peptide peptidase-like 3)、裂解和多聚腺苷酸化特異性因子亞基2(Cleavage and polyadenylation specificity factor subunit 2)。

3 討 論

黃瓜上目前已鑒定的雄性不育突變體主要有6個：1)無花瓣敗育ap，該突變體花冠缺失，花藥向花萼方向生長轉(zhuǎn)化；2)多向性花粉敗育ms-1，其雄花不能開放、花粉不育率為30%～90%，且雌花育性降低；3)雄花敗育ms-2，極少數(shù)的雄花開放，但花藥發(fā)育異常，不能產(chǎn)生花粉；4)花朵閉合cl，雌雄花都不能開放；5)花粉敗育ps，雌雄花的花冠正常，雌花可育，雄蕊花藥退化、無花粉；6)雄性不育ms-3，雌雄花都有正常的花冠，雌花的育性正常，但雄花花藥淡綠色、花粉缺失[10-14,19]。此外，還有Niu等[20]發(fā)現(xiàn)的葉子皺縮不平展、花瓣變窄、果實形似芒果的“mango”突變體也具有雄性不育的特征。而在本研究中突變體C0128花瓣變小但形狀正常，花藥變小、顏色正常，雌花正?？捎＿@些形態(tài)特征表明突變體C0128與之前已報道的黃瓜雄性不育突變體不同，是一個新的黃瓜雄性不育突變體材料。

在擬南芥、水稻等模式植物上已克隆了多個雄性不育基因，涉及幾個轉(zhuǎn)錄因子和酶類。轉(zhuǎn)錄因子主要通過調(diào)控花藥發(fā)育途徑從而影響雄性育性，如MYB類轉(zhuǎn)錄因子MYB103/188、bHLH類轉(zhuǎn)錄因子DYT1、AMS等等[29]；酶類主要通過合成、轉(zhuǎn)化或降解等過程為花藥發(fā)育提供所需要的物質(zhì)，如GDSL[30]、KCS[31]、ACOS5[32]等，還有一些激酶HXK5[33]和轉(zhuǎn)移酶GPAT6[34]等也參與花藥發(fā)育。在葫蘆科作物中克隆的雄性不育基因較少，西瓜上僅克隆了2個雄性不育基因Cla006625和Cla010576，分別編碼Pollen-specific leucine-rich repeat蛋白[35]和與擬南芥的bHLH091、bHLH089、bHLH010同源的bHLH轉(zhuǎn)錄因子[36]。甜瓜上僅克隆了雄性不育突變體ms-5的候選基因CmAMS，其編碼bHLH家族的MYC類轉(zhuǎn)錄因子[37]。黃瓜上，Han等[14]圖位克隆了雄性不育基因MS-3的候選基因，其編碼homeodomain(PHD) finger蛋白；Niu等[20]圖位克隆了 “mango”突變體的目的基因Csa1M042780，編碼WUSCHEL-related homeobox1蛋白，該基因突變不僅影響葉形、果形、花形，還抑制花藥及花粉發(fā)育，導致花粉異常。上述已克隆的葫蘆科作物雄性不育基因均不在MS-4定位區(qū)間內(nèi)。

本研究MS-4定位區(qū)間內(nèi)的149個候選基因中，有8個候選基因的同源基因在其他植物上已被報道會影響植物雄性育性。CsaV3_3G015960的同源基因DRINKME(DKM)，在擬南芥過表達植株中，花藥變小、花粉量減少，降低了雄性育性[38]；CsaV3_3G016780的同源基因編碼Response Regulator2(ARR2)是花粉特異性轉(zhuǎn)錄因子，通過調(diào)控擬南芥花粉發(fā)育途徑影響花粉發(fā)育[39]；CsaV3_3G016880的同源基因編碼A9啟動子，是擬南芥最早發(fā)現(xiàn)的一個絨氈層特異性啟動子，通過與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合調(diào)控雄性生殖器官發(fā)育影響育性[40]；CsaV3_3G017010的同源基因OsGEN-Like，在水稻中沉默后大部分植株會降低雄性育性甚至敗育，其敗育是由于早期小孢子發(fā)育缺陷而不能產(chǎn)生成熟花粉[41]；CsaV3_3G017120同源基因編碼的Actin-Depolymerizing Factor 10(ADF10)在擬南芥中主要通過影響花粉管的生長從而影響雄性育性[42]；CsaV3_3G017190的同源基因CYP715A1是Cytochromes P450家族成員，在擬南芥花蕾的絨氈層和開花的花藥中特異性表達[43]，可能與雄性育性相關(guān)；CsaV3_3G017210在擬南芥中的同源基因編碼Signal Peptide Peptidases(AtSPP)，AtSPP是擬南芥雄配子體發(fā)育和花粉成熟所必需的因子[44]；CsaV3_3G017220的同源基因編碼Defective in snRNA Processing 1/4復合體(DSP1/4)，DSP1/4突變后都會影響擬南芥雄配子體的發(fā)育，且雙突變體表現(xiàn)為雄性不育[45-46]；在本研究中突變體C0128不能產(chǎn)生花粉粒，除推測CsaV3_3G015960和CsaV3_3G017120可能不是MS-4候選基因外，其余6個候選基因均有可能是MS-4的候選基因，需進一步擴大定位群體對MS-4進行精細定位和克隆才能初步確認MS-4的候選基因。

作者貢獻：楊志敏完成了本研究的主要內(nèi)容及手稿撰寫；岳宏忠參與試驗設(shè)計，提供試驗指導，引物設(shè)計與合成；張海強負責構(gòu)建雜交群體；李玉紅教授設(shè)計本研究、試驗指導及論文修改。所有作者都對文章作出了貢獻，并批準提交。