毛多斌，黃曉玉，周利峰，劉 強(qiáng)，陳芝飛，馮穎杰，黃 申，張俊嶺*

1.鄭州輕工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)科學(xué)大道136號(hào) 450001 2.河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，鄭州經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)區(qū)第三大街8號(hào) 450002 3.山西昆明煙草有限責(zé)任公司，太原市小店區(qū)大昌南路21號(hào) 030000

芽孢桿菌屬（Bacillus）是土壤和植物生態(tài)環(huán)境的優(yōu)勢(shì)菌屬之一，具有生長(zhǎng)快、抗逆性強(qiáng)以及生物安全性高等特點(diǎn)［1-2］。研究發(fā)現(xiàn)，多種芽孢桿菌屬（Bacillus）微生物能夠釋放揮發(fā)性物質(zhì)，并對(duì)植物病原菌具有抑制作用［3-4］?？莶菅挎邨U菌（Bacillus subtilis），是芽孢桿菌屬的一種，因生物安全性高、無致病性以及具有產(chǎn)蛋白酶、淀粉酶等特性，被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究［5］、醫(yī)藥生產(chǎn)、植物抗病［6］及畜牧養(yǎng)殖等領(lǐng)域中。

在煙葉陳化進(jìn)程中芽孢桿菌屬（Bacillus）多為煙葉表面優(yōu)勢(shì)菌屬［7-9］，用該類微生物發(fā)酵烤煙［10］、雪茄煙［11］以及煙草浸提液［12］后，香氣量和吸食品質(zhì)都有明顯提高。梁開朝等［13］篩選到一株蠟樣芽孢桿菌（Bacilluscereus），用其發(fā)酵煙草浸提液5 d后，煙葉中2,3-丁二醇、苯乙酮以及乙酸丁酯等香氣成分增加。呂欣等［14-15］篩選到包括芽孢桿菌（Bacillus sp.）在內(nèi)的多株微生物，發(fā)酵55 g煙葉48 h后，煙葉感官品質(zhì)明顯提升。瞿嬌嬌等［16］從豆豉中分離出枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis），發(fā)酵煙葉15 d后，可減少雜氣、降低刺激性。王芳等［17］從茅臺(tái)酒致香微生物中篩選出枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis），發(fā)酵中、下部煙葉各1 kg，發(fā)酵20～25 d后增香效果明顯。陳興等［18］通過嗅香及感官評(píng)吸，從煙葉表面分離得到一株產(chǎn)香西姆芽孢桿菌（Bacillussiamensis），發(fā)酵煙葉48 h能有效改善煙葉的吸味品質(zhì)。然而，利用上述芽孢桿菌屬（Bacillus）微生物發(fā)酵煙葉存在發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)、處理量小等問題，且其發(fā)酵機(jī)制尚未明確。為此，借助平板涂布法從初烤后煙葉表面分離篩選菌株，利用嗅香變化挑選出菌株H11，采用分子生物學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行鑒定，再將此菌株用于低等級(jí)煙葉的發(fā)酵處理，分析其對(duì)煙葉化學(xué)成分和吸味品質(zhì)的影響，旨在開發(fā)新菌株并縮短發(fā)酵時(shí)間，為微生物發(fā)酵低等級(jí)煙葉提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

供試煙葉產(chǎn)地為平頂山，采收年份為2017年，等級(jí)為DCFB，由河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心提供。

Taq酶、DNA Marker DL10000購(gòu)自日本Takara公司；DNA提取試劑盒RNeasy Mini Kit購(gòu)自北京麥克羅科技有限公司；瓊脂粉、酵母粉和蛋白胨購(gòu)自英國(guó)Oxoid公司；氯化鈉和無水乙醇等常規(guī)分析純?cè)噭┵?gòu)自上海麥克林生化科技有限公司。

每升液體LB培養(yǎng)基含酵母粉5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉10 g；固體LB培養(yǎng)基含酵母粉5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉10 g，瓊脂粉20 g；再造煙葉濃縮液培養(yǎng)基含再造煙葉濃縮液200 mL。上述3種培養(yǎng)基經(jīng)121℃高壓滅菌25 min后用于菌種培養(yǎng)和發(fā)酵。

恒溫培養(yǎng)箱DHP-9162（太倉(cāng)市科教器械廠）；恒溫?fù)u床TH2-C（太倉(cāng)市試驗(yàn)設(shè)備廠）；GC-MS色譜聯(lián)用儀6890a（美國(guó)Agilent公司）；連續(xù)流動(dòng)分析儀AA3（德國(guó)SEAL公司）；PCR儀2720 thermal cycler（美國(guó)Applied Biosystems公司）；顯微鏡DM6B（德國(guó)徠卡公司）。

1.2 方法

1.2.1 菌株篩選

采集河南省三門峽市陜州區(qū)煙葉種植基地不同品種的初烤后煙葉樣品30個(gè)，各取5 g煙葉，加入100 mL無菌水，在30℃、150 r/min條件下震蕩培養(yǎng)2～4 h，將其按照體積分?jǐn)?shù)1%接種至液體LB培養(yǎng)基培養(yǎng)6～8 h。將得到的富集菌液按照6個(gè)稀釋梯度（10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6）稀釋后分別涂布到固體LB培養(yǎng)基平板上，28℃倒置培養(yǎng)2 d。從平板上挑選單菌落，采用平板劃線法獲得純菌。將分離到的微生物接種至再造煙葉濃縮液培養(yǎng)基中，28℃、150 r/min震蕩培養(yǎng)24 h，利用嗅香變化篩選菌株。

1.2.2 菌種鑒定

用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取菌株的基因組DNA。以該基因組DNA為模板，利用通用引物27-F/1492-R和gyrB-34-F/gyrB-977-R分別對(duì)16S rDNA基因和gyrB基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。隨后將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與pMD18-T載體進(jìn)行連接，將陽性克隆送生工生物工程（上海）有限公司測(cè)序。將測(cè)序得到的序列提交NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，使用NCBIBlast在線工具與數(shù)據(jù)庫(kù)中已有的細(xì)菌16SrDNA序列以及gyrB序列進(jìn)行比對(duì)分析，獲得相似性較高的序列信息，并建立系統(tǒng)發(fā)育樹，最終明確篩選微生物的分類地位。

1.2.3 煙葉發(fā)酵處理

經(jīng)篩選鑒定的菌株在液體LB培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，當(dāng)OD600nm為0.8～1.2時(shí)將菌液于4℃、10 000 r/min條件下離心10 min，棄上清，用等量無菌水重懸，獲得種子液。按照接種量6.3×107CFU/g將3 L種子液均勻噴灑到20 kg煙葉表面，裝于密封袋，放置于溫度為35℃濕度80%的恒溫恒濕房中發(fā)酵30 h。不做任何處理的煙葉為CK 1，加等量無菌水相同條件處理的煙葉為CK 2。

1.2.4 感官評(píng)價(jià)

樣品和對(duì)照煙葉的切絲、烘絲在鄭州煙草研究院中試車間進(jìn)行，單料煙樣品在河南中煙駐馬店卷煙廠制作。由河南中煙技術(shù)中心13名專業(yè)評(píng)吸人員組成評(píng)吸小組，采用對(duì)比評(píng)吸方式和九分制單料煙評(píng)吸標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行感官評(píng)價(jià)［18］。

1.2.5 煙葉常規(guī)成分測(cè)定

參照YC/T 160—2002［19］、YC/T 161—2002［20］、YC/T 159—2002［21］、YC/T 217—2007［22］以及YC/T 162—2011［23］的標(biāo)準(zhǔn)，用連續(xù)流動(dòng)分析儀分別測(cè)定發(fā)酵前后煙葉中的化學(xué)成分（煙堿、總氮、水溶性總糖、還原糖、鉀和氯）。每個(gè)待測(cè)樣品各指標(biāo)測(cè)定3次，取平均值。

1.2.6 煙葉中性香味成分測(cè)定

采用同時(shí)蒸餾萃取法分離中性香味成分。稱取煙葉粉末30 g放入1 000 mL的圓底燒瓶中，加入4粒沸石和400 mL去離子水，將100 mL的二氯甲烷倒入圓底燒瓶中。同時(shí)蒸餾萃取2.5 h后，將得到的萃取液進(jìn)行酸堿萃取，得到中性萃取液后，加入適量的無水硫酸鈉進(jìn)行干燥過夜，再加入100μL 2,6-二氯甲苯作為內(nèi)標(biāo)，蒸餾濃縮至1 mL，進(jìn)行GC/MS檢測(cè)分析。分析條件為：色譜柱：HP-5MS毛細(xì)管柱（60 m×250μm×0.25μm）；進(jìn)樣口溫度：240℃；進(jìn)樣量1.0μL；載氣：He；流速：1.0 mL/min；分流比：不分流；升溫程序：50℃下保持4 min，3℃/min升至70℃并保持5 min，2℃/min升至100℃并保持17 min后，繼續(xù)升溫至120℃保持10 min，再以6℃/min升至280℃。質(zhì)譜條件：電離方式為電子轟擊（EI），電子能量70 eV；溶劑延遲10 min；全掃描檢測(cè)，掃描質(zhì)量范圍（m/z）35～500 amu。煙葉中性香味成分的GC檢測(cè)結(jié)果利用NIST20標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)進(jìn)行檢索，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)樣品的GC保留時(shí)間和煙草中化學(xué)成分進(jìn)行定性分析。對(duì)有標(biāo)準(zhǔn)樣品的香味成分采用GC內(nèi)標(biāo)工作曲線法定量，沒有標(biāo)準(zhǔn)樣品的香味成分采用峰面積相對(duì)定量法（化合物峰與內(nèi)標(biāo)峰面積之比）定量。

1.2.7 菌株基因組測(cè)定及分析

將篩選得到的菌株從-80℃冰箱中取出進(jìn)行活化，將活化好的菌液離心，棄去上清液，保留沉淀。PCR引物合成和DNA測(cè)序均由生工生物工程（上海）有限公司完成。使用HiSeq測(cè)序儀（美國(guó)Illumina公司）進(jìn)行測(cè)序。為了校正原始數(shù)據(jù)中序列，首先用SPAdes軟件對(duì)原始序列進(jìn)行校正，然后綜合Kmer值，填補(bǔ)拼接后重疊群并對(duì)其矯正。采用Blast算法比較兩段核酸或者蛋白序列之間的相似性。將蛋白序列與CAZy數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較。

1.2.8 煙葉表面微生物宏基因組測(cè)定及分析

將用到的量筒、紗布、三角瓶和剪刀等器材全部進(jìn)行高溫滅菌處理（121℃，20 min）。稱取樣品煙葉和對(duì)照煙葉各40 g剪碎后置于500 mL的磷酸鹽緩沖溶液（PBS，0.1 M、pH 7.0）中，在37℃、200 r/min的搖床上震蕩30 min。震蕩結(jié)束后，在超凈工作臺(tái)中將震蕩后的PBS溶液用雙層紗布過濾，重復(fù)兩次，去除PBS中的雜質(zhì)。將過濾后的PBS溶液在4℃、10 000 r/min的條件下離心10 min，將微生物富集到離心管底部，棄去上清，沉淀置于-80℃低溫冷凍保存。

采用Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒［生工生物工程（上海）股份有限公司］對(duì)其沉淀微生物進(jìn)行DNA提取。以提取的總DNA為模板，利用通用引物27-F/765-R對(duì)DNA的V區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR的最終產(chǎn)物用1%的瓊脂凝膠電泳檢測(cè)。并用熒光試劑對(duì)PCR擴(kuò)增回收產(chǎn)物進(jìn)行定量分析。根據(jù)熒光定量結(jié)果，按照每個(gè)樣本的測(cè)序量需要，對(duì)各樣本按相應(yīng)比例進(jìn)行混合。使用MiSeq測(cè)序儀（美國(guó)Illumina公司）進(jìn)行雙端測(cè)序。測(cè)序完成后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，首先獲得拼接成的Tags數(shù)據(jù)，將拼接的Tags經(jīng)過優(yōu)化后，在97%相似度下將序列聚類為操作分類單元（Operational taxonomic units，OTUs）。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種的篩選與鑒定

2.1.1 菌株的篩選

共從初烤后煙葉中分離篩選出16株菌株，編號(hào)分別為H1、H2、H3～H16，分別接種至再造煙葉濃縮液培養(yǎng)基中，在28℃，150 r/min條件下培養(yǎng)24 h，根據(jù)發(fā)酵前后嗅香變化，發(fā)現(xiàn)菌株H11嗅香變化明顯，因此選定H11為煙草發(fā)酵候選菌株。

2.1.2 菌株的鑒定

2.1.2.1 菌株的形態(tài)鑒定

將菌株H11接種至LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)36 h后（圖1A），菌落表面有光澤、邊緣整齊，染色后在普通光學(xué)顯微鏡（×100油鏡）下觀察，菌體呈絲狀，菌體長(zhǎng)為2μm左右（圖1B），為革蘭氏陽性菌。

圖1 菌株H11菌落及細(xì)胞形態(tài)Fig.1 Colony and cell morphology of strain H11

2.1.2.2 菌株H11的系統(tǒng)發(fā)育分析

擴(kuò)增測(cè)序得到菌株H11的16SrDNA基因長(zhǎng)度為1 427 bp，經(jīng)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中同源分析后發(fā)現(xiàn)，菌株H11與枯草芽孢桿菌亞種（B.subtilis subsp.）的同源性在94%以上。下載相似度較高的相關(guān)菌株序列并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2），結(jié)果表明，菌株H11與枯草芽孢桿菌亞種（B.subtilis subsp.）的多個(gè)已知菌株序列聚類為一個(gè)獨(dú)立分支，表明菌株H11屬于芽孢桿菌屬（Bacillus）。

圖2 菌株H11 16Sr DNA區(qū)域序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of 16S r DNA region sequence of strain H11

擴(kuò)增測(cè)序獲得菌株H11的gyrB基因，長(zhǎng)度為907 bp。將該序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源分析后發(fā)現(xiàn)，菌株H11與枯草芽孢桿菌枯草亞種（B.subtilis subsp.subtilis）的同源性為100%。構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹后分析結(jié)果（圖3）表明，菌株H11與枯草芽孢桿菌枯草亞種（B.subtilis subsp.subtilis）聚為一個(gè)單獨(dú)分支，初步鑒定該菌株屬于枯草芽孢桿菌枯草亞種（B.subtilis subsp.subtilis）。

圖3 菌株H11基于gyr B基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain H11 based on gyr B gene sequence

2.2 發(fā)酵前后單料煙的評(píng)吸結(jié)果

發(fā)酵前后煙支感官評(píng)吸結(jié)果見表1。與對(duì)照相比，H11菌株發(fā)酵后香氣質(zhì)有所改善，甜感和香氣量得分都有所增加，刺激性明顯下降，勁頭有所減少，余味尚干凈。發(fā)酵后煙葉總體得分比CK 1高1.2分，比CK 2高1.4分，說明H11發(fā)酵后煙葉的整體品質(zhì)有所提升。

表1 感官質(zhì)量評(píng)吸結(jié)果Tab.1 Results of sensory quality assessment（分）

CK 2相比CK 1刺激性略大，整體評(píng)分少0.2分，可能是煙葉自身微生物作用的結(jié)果，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)樣品不再與CK 2進(jìn)行比較。

2.3 煙葉發(fā)酵前后理化指標(biāo)變化

2.3.1 煙葉常規(guī)成分

發(fā)酵前后煙葉化學(xué)成分測(cè)定結(jié)果如表2所示。相比CK 1，經(jīng)H11菌株發(fā)酵后，煙葉常規(guī)化學(xué)成分中的水溶性總糖、還原糖含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）變化明顯，煙堿、總氮、鉀和氯的含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）變化不明顯。水溶性總糖增加可能是淀粉水解的結(jié)果所致。其中水溶性總糖含量和還原糖含量分別上升了2.52%和1.92%。還原糖含量的增加，使得H11菌株發(fā)酵后煙葉中的糖堿比增加，吸味品質(zhì)提升。水溶性總糖和還原糖含量增加可提升煙氣醇和度。

表2 H11發(fā)酵前后煙葉常規(guī)成分變化Tab.2 Variations of routine components in tobacco leaves from Pingdingshan before and after H11 fermentation（%）

2.3.2 煙葉中性香味成分

發(fā)酵前后煙葉的中性香味成分結(jié)果見表3，檢測(cè)到中性香味成分26種，其按官能團(tuán)分類結(jié)果見圖4。

圖4 煙葉發(fā)酵前后香味成分含量變化Fig.4 Variations of aroma components in tobacco leaves before and after fermentation

表3 H11發(fā)酵對(duì)香味成分的影響Tab.3 Effects of H11 fermentation on aroma components

表3（續(xù)）

由表3可見，多種香味成分含量均有不同程度的提升。發(fā)酵前后茄酮含量分別為41.916 9μg/mL和45.739 2μg/mL，增加了9.12%；（E）-β-大馬酮含量分別為5.864 8μg/mL和7.385 1μg/mL，增加了25.92%；二氫獼猴桃內(nèi)酯含量分別為7.728 2μg/mL和8.544 9μg/mL，增加了10.57%；巨豆三烯酮C含量分別為13.056 5μg/mL和14.642 9μg/mL，增加了12.15%；法尼基丙酮含量分別為47.053 6μg/mL和53.785 2μg/mL，增加了14.31%。這些成分含量的增加提升了煙氣品質(zhì)，與感官評(píng)吸結(jié)果一致。

由圖4可見，發(fā)酵后煙葉的醇類、酮類和醛類香味成分含量均有不同程度增加。醛類、酮類、醇類和呋喃類香味成分含量分別增加了6.5%、8.5%、8.2%和10.7%，上述成分的提高有利于提高煙葉的吸味品質(zhì)。

2.4 煙葉表面微生物變化分析

2.4.1 煙葉表面微生物OTU豐度分析

為探究發(fā)酵前后煙葉表面微生物的群落變化，采用OTU統(tǒng)計(jì)工具中的維恩（Venn）圖進(jìn)行群落分析。如圖5所示，2個(gè)樣品中細(xì)菌在多樣性O(shè)TU聚類后有253（15.14%）個(gè)是共有的，對(duì)照樣品CK1有844（50.51%）個(gè)為獨(dú)有；H11發(fā)酵的樣品有574（34.35%）個(gè)為獨(dú)有。H11菌發(fā)酵后的樣品細(xì)菌種類數(shù)量減少270個(gè)，占OTUs總數(shù)的24.61%。

圖5 煙葉表面微生物操作分類單元（OTU）Venn圖Fig.5 Venn diagram of microbial operational taxonomic units（OTUs）on tobacco leaves

為進(jìn)一步分析維恩圖中各個(gè)區(qū)域的物種豐度組成，在門和屬水平上統(tǒng)計(jì)每個(gè)區(qū)域相應(yīng)OTU的豐度。由圖6可見，對(duì)照煙葉中優(yōu)勢(shì)菌門為變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes），分別占總的高質(zhì)量序列的81%、11%和4%，其中變形菌門為主要的優(yōu)勢(shì)菌門。用H11發(fā)酵后的煙葉中厚壁菌門（Firmicutes）相對(duì)豐度最高，為90%。由圖7可見，對(duì)照煙葉中優(yōu)勢(shì)菌屬為假單胞菌屬（Pseudomonas），但用H11發(fā)酵后煙葉中芽孢桿菌屬（Bacillus）成為豐度最高的屬，其相對(duì)豐度為76%。由此可見，用H11發(fā)酵可明顯改變煙葉表面微生物的多樣性，其中厚壁菌門和芽孢桿菌屬微生物占優(yōu)勢(shì)。

圖6 發(fā)酵前后煙葉表面微生物門水平的相對(duì)豐度柱狀圖Fig.6 Relative abundances（phylum level）of microorganisms on tobacco leaves before and after fermentation

圖7 發(fā)酵前后煙葉表面微生物屬水平的相對(duì)豐度柱狀圖Fig.7 Relative abundances（genus level）of microorganisms on tobacco leavesbeforeand after fermentation

2.4.2 煙葉表面微生物物種組成熱圖分析

在屬水平上將細(xì)菌群落組成按照其在樣品中的相對(duì)豐度大小排序，并選擇排名前20的屬繪制物種豐度聚類熱圖（圖8）。經(jīng)H11發(fā)酵后的煙葉表面大多數(shù)細(xì)菌屬的相對(duì)豐度都有所減少，而芽孢桿菌屬（Bacillus）的相對(duì)豐度增加較為明顯，說明H11對(duì)煙葉表面微生物組成有較大的影響，并對(duì)其他菌屬有抑制作用。

圖8 屬水平上發(fā)酵前后煙葉表面微生物分布熱圖Fig.8 Heat map of distribution（genus level）of microorganisms on tobacco leaves before and after fermentation

2.5 枯草芽孢桿菌枯草亞種碳水化合物活性酶分析

分析菌株H11基因組后發(fā)現(xiàn)，該菌株基因組中具有725 520 bp堿基，共編碼7 960個(gè)基因。將菌株H11的蛋白序列與CAZy數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，得到其對(duì)應(yīng)的碳水化合物活性酶注釋信息共284條（圖9）。推測(cè)參與煙葉增香提質(zhì)的關(guān)鍵酶主要為糖苷水解酶（GH）、氧化還原酶（AA）和糖類酯解酶（CE）（表4）。

圖9 枯草芽孢桿菌枯草亞種碳水化合物活性酶（CAZy）分類統(tǒng)計(jì)Fig.9 Classification and statistics of carbohydrate active enzymes（CAZy）in Bacillus subtilis subsp.subtilis

由表4可見，菌株H11具有過氧化氫酶、過氧化物酶、4-羥基苯乙酮單加氧酶、α-淀粉酶以及纖維素酶等碳水化合物活性酶。在酶促作用下，煙葉中的大分子物質(zhì)如淀粉、蛋白質(zhì)、β-胡蘿卜素、葉黃素和西柏烯發(fā)生降解，生成香味物質(zhì)，對(duì)吸味品質(zhì)的提升起到重要的作用。

表4 枯草芽孢桿菌枯草亞種關(guān)鍵碳水化合物活性酶信息Tab.4 Information of key carbohydrate activity enzymes in Bacillus subtilis subsp.

常規(guī)成分分析結(jié)果顯示，發(fā)酵后煙葉中水溶性糖和還原糖的含量增加。與對(duì)照相比，發(fā)酵后煙氣更醇和，香氣質(zhì)也有提升。原因可能是H11中存在α-淀粉酶將淀粉水解成水溶性糖和還原糖，有利于提高煙氣醇和度，且糖類成分與氨基酸縮合生成煙葉香氣前體物，還能提升煙葉香氣品質(zhì)［25］；對(duì)比分析發(fā)酵前后煙葉中性香味成分變化，發(fā)酵后煙葉中的茄酮、二氫大馬酮、二氫獼猴桃內(nèi)酯、巨豆三烯酮和金合歡基丙酮等香味成分含量增加。評(píng)吸結(jié)果顯示，H11發(fā)酵后香氣質(zhì)提升、香氣量增加。

3 討論

從初烤后煙葉中篩選到一株枯草芽孢桿菌枯草亞種，用其發(fā)酵河南平頂山2017年產(chǎn)DCFB煙葉后，評(píng)吸結(jié)果顯示增香提質(zhì)效果明顯，這與瞿嬌嬌等［16］對(duì)枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）煙葉增香提質(zhì)效果的研究結(jié)果一致。煙葉香氣質(zhì)的提升主要表現(xiàn)為重要致香成分的增加，另外還可能與其他成分的減少有關(guān)?？莶菅挎邨U菌發(fā)酵煙葉后對(duì)吸食品質(zhì)產(chǎn)生有益影響，發(fā)酵后煙葉中香葉基丙酮、二氫獼猴桃內(nèi)酯和巨豆三烯酮C等香味成分含量均有不同程度的增加，這可能是類胡蘿卜素、糖苷以及西柏烯等香氣前體物發(fā)生降解，增加了煙葉中小分子致香物質(zhì)的總量，進(jìn)而整體提高了感官品質(zhì)［26］。前人研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌發(fā)酵煙葉存在發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)，發(fā)酵量小的問題。楊培香等［27］在枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）Van3菌株提高煙絲品質(zhì)的研究中將40 mL菌液噴施于200 g煙葉表面，并在22℃、60%的恒溫恒濕條件下發(fā)酵煙葉，30 d后香氣量增加，品質(zhì)提升。本研究中發(fā)現(xiàn)的菌株H11發(fā)酵20 kg煙葉僅30 h時(shí)即能達(dá)到增香提質(zhì)的作用，大大縮短了發(fā)酵時(shí)間，擴(kuò)大了發(fā)酵量。

H11菌株關(guān)鍵酶有纖維素酶和α-淀粉酶等，其中α-淀粉酶可以水解淀粉，從而使水溶性糖和還原糖含量增加，糖類成分又可與氨基酸發(fā)生反應(yīng)，生成對(duì)煙葉香氣有貢獻(xiàn)的物質(zhì)，進(jìn)而改善煙葉的香氣品質(zhì)。

菌株H11發(fā)酵煙葉后，煙葉表面微生物多樣性減少，芽孢桿菌屬（Bacillus）微生物豐度顯著升高，這與黃亞麗等［28］在枯草芽孢桿菌菌劑不同施用方式對(duì)甜瓜土壤微生物多樣性及生長(zhǎng)影響的研究結(jié)果相似。

4 結(jié)論

從初烤后煙葉中篩選出一株新的增香提質(zhì)的微生物菌株H11，經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定為枯草芽孢桿菌枯草亞種（Bacillus subtilis subsp.subtilis）。對(duì)河南平頂山2017年產(chǎn)DCFB煙葉用H11發(fā)酵30 h后，煙葉甜感增強(qiáng)、香氣質(zhì)提升、香氣量增加，吸味品質(zhì)改善明顯。對(duì)比分析煙葉發(fā)酵前后常規(guī)成分、中性香味成分和煙葉表面微生物種群變化，結(jié)果表明：發(fā)酵后煙葉水溶性糖、還原糖含量分別增加了2.52%、1.92%；（E）-β-大馬酮、二氫獼猴桃內(nèi)酯和巨豆三烯酮C等香味成分含量分別增加了25.92%、10.57%和12.15%；經(jīng)H11發(fā)酵后，煙葉表面微生物多樣性有所減少，H11芽孢桿菌屬（Bacillus）微生物豐度大幅度增加。與已報(bào)道的相關(guān)煙葉發(fā)酵技術(shù)相比，菌株H11發(fā)酵工藝用時(shí)更短、發(fā)酵量更大，具有更好的工業(yè)應(yīng)用潛力。