張兆林 徐 虹 陳凍伢 劉 敏 陳建永

結腸黑變病（melanosis coli，MC）多見于長期便秘以及服用蒽醌類藥物的患者[1-2]，如番瀉葉、大黃、蘆薈、鼠李等，它是一種黑色素或脂褐素沉積在結腸黏膜固有層的非炎癥性腸道病變。MC 可能與結腸非腺瘤性息肉和低級別腺瘤的高發(fā)病率及數(shù)量有關[3-4]。一項動物實驗研究顯示，MC 豚鼠結腸組織中原癌基因c-myc 的表達顯著升高，表明該疾病具有癌變傾向[5]。因此早期治療MC，有著非常重要的意義。有研究表明，白及水煎劑可以改善MC，其機制可能是通過調節(jié)結腸組織Bcl-2 和Bax 表達，從而抑制細胞凋亡而發(fā)揮作用[6]。本次研究通過制備MC 模型豚鼠，同時給予10%白及水煎劑灌腸干預，觀察腸黏膜特殊染色、超微結構以及流式細胞儀檢測細胞凋亡率，探討白及水煎劑對MC 的改善作用機制。

1 材 料

1.1 動 物 健康清潔級豚鼠40 只，雌雄各半，體質量（400±20）g，均由浙江中醫(yī)藥大學動物實驗研究中心提供。動物合格證號：SYXK（浙）2013-0184。采用架式籠養(yǎng)，每籠4 只，雌雄分籠，普通飼料喂養(yǎng)，自由飲水，環(huán)境條件為20 ℃左右的室溫維持，相對濕度40%～60%，12 h 光照周期的屏障環(huán)境。符合動物實驗倫理要求。

1.2 藥 物 大黃、白及均采購自浙江省醫(yī)藥公司（杭州桐君堂中藥飲片廠，批號20150713，大黃提取工藝：大黃飲片機械粉碎成粗粉，經70%乙醇回流提取液過濾，60 ℃減壓濃縮，制成大黃提取液（每1 mL相當于3 g 大黃藥液）。10%白及水煎劑制取工藝：白及飲片干燥、粉碎成粗粉，加入蒸餾水中煎煮過濾雜質，合并濾液水浴濃縮成10%白及水煎劑（每1 mL相當于0.1 g 白及藥液）。以上實驗藥物制取均委托浙江中醫(yī)藥大學藥學院完成。

1.3 主要試劑及儀器 甲醛（批號20150623）、無水乙醇（批號20140812）、戊二醛（批號20150422）、二甲苯（批號20150211）、高錳酸鉀（批號20150510）、草酸（批號20150322）、25%烏拉坦（批號20140614）等購自上海試劑一廠；PBS（批號20150123）、Harris 蘇木精液（批號20150313）、伊紅染色液（批號20150718）等購自福州邁新生物技術有限公司；Annexin V-FITC 購自杭州聯(lián)科生物技術有限公司。Becton Dickinson Facscalibour 流式細胞儀（美國BD公司）、FEITECNAI-10 電鏡（飛利浦）等。

2 方 法

2.1 動物模型制備 40 只豚鼠適應性喂養(yǎng)1 周后，采用隨機數(shù)字表法分為正常組8 只，模型組16 只和白及組16 只。全部豚鼠均放在鐵籠中，每4 只單籠喂養(yǎng)，造模前禁食不禁水24 h。造模開始，模型組、白及組豚鼠均予大黃提取液6 g/（kg·d）連續(xù)灌胃60 d。灌胃第15 d 起，白及組予10%白及水煎劑灌腸，每周3 次，模型組予等量生理鹽水灌腸；正常組常規(guī)飲水進食，同步喂養(yǎng)60 d。

2.2 標本取材 造模結束后，各組豚鼠均禁食、禁飲24 h，予25%烏拉坦按0.7 mL/100 g 的劑量腹腔注射麻醉處死。剖腹后立即剪取盲腸及全段結腸，沿縱軸剖開，留取適量結腸標本，用4 ℃生理鹽水反復沖洗干凈后，置于戊二醛、甲醛、液氮保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 檢測指標與方法

2.3.1 褪黑色素染色 結腸組織石蠟包埋3～5 μm切片，脫蠟；蒸餾水洗2～3 次；入0.25%高錳酸鉀水溶液內2 h，水洗后再用1%草酸水溶液漂白水洗；鏡下控制至細胞內外黑色素完全消失；常規(guī)HE 染色后，脫水、透明及封片，光學顯微鏡下觀察。

2.3.2 透射電子顯微鏡 將結腸組織切成1 mm3大小，置于2.5%磷酸緩沖戊二醛固定液中2 h，PBS 沖洗，1%四氧化餓固定2 h，PBS 再次沖洗；依次用乙醇、丙酮作梯度脫水處理，經低粘度Spurr 包埋劑包埋后，切片機半薄切片，甲苯胺藍染色定位后切成厚度70 nm 的超薄切片，最后用檸檬酸鉛及醋酸鈾雙重染色，置于透射電子顯微鏡下觀察。

2.3.3 流式細胞儀 將凍于液氮中的結腸塊用眼科彎剪刀放在60 μm 孔徑的尼龍網上剪碎，PBS 沖洗，收集成單細胞后用95%乙醇固定，PBS 再次清洗，離心后棄上清液；加入1 mL Tritonx-100，室溫下靜置10 min；離心后棄上清液，加PBS 清洗后棄上清液；加1 mL RNASE 酶，置37 ℃水浴恒溫箱振蕩10 min；離心后棄上清液，加入10 μL Annexin V-FITC 和5 μL PI 混勻，避光室溫放置15 min；加入300 μL Binding Buffer，1 h 內上機檢測，應用流式細胞儀離子激發(fā)光波長488 nm，選定每樣本計數(shù)10000 個細胞，所得資料輸入BDISCONSORT30 計算機后應用相應程序軟件處理，計算細胞凋亡率。

2.4 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 21.0 軟件包對數(shù)據進行統(tǒng)計處理，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析。所有檢驗結果以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 各組豚鼠結腸黏膜肉眼觀改變 肉眼觀察各組結腸組織樣本，正常組豚鼠結腸黏膜形態(tài)、顏色正常，MC 模型組結腸黏膜顏色明顯加深，呈彌漫性黑褐色色素沉著，且由結腸近端向結腸遠端逐漸變淺，而白及組豚鼠結腸黏膜顏色較模型組淺，見圖1。

圖1 各組豚鼠的結腸黏膜

3.2 各組褪黑色素染色比較 正常組褪黑色素染色陰性，模型組及白及組特殊染色均呈陽性改變，但模型組染色范圍較白及組大。見圖2。

圖2 各組豚鼠結腸組織褪黑色素染色光鏡圖（×200）

3.3 各組豚鼠組織透射顯微鏡下比較 正常組：微絨毛排列緊密，形態(tài)規(guī)則，可見較多杯狀細胞，嵴結構清晰，粗面內質網未見異常。模型組：微絨毛結構紊亂，可見多數(shù)上皮細胞胞漿內大小不等空泡樣改變，細胞核形態(tài)不規(guī)則，變性空泡為腫脹的線粒體，內部結構雜亂不清晰，胞漿中細胞器的密度增加，偶可見凋亡上皮細胞。白及組：微絨毛排列較緊密，上皮細胞凋亡不明顯，可見較多杯狀細胞，個別線粒體輕度空泡樣改變，核膜清晰，染色質無聚集，新生黏液空泡輕度增多，粗面內質網的整體結構排列不規(guī)則。見圖3。

圖3 結腸組織透射電鏡觀察

3.4 各組豚鼠組織細胞凋亡率比較 結果顯示，與正常組相比較，模型組豚鼠的結腸上皮細胞凋亡率增高（P＜0.05）；白及組的細胞凋亡率較模型組下降（P＜0.05），見表1、圖4。

圖4 流式細胞儀檢測各組豚鼠結腸黏膜細胞凋亡率

表1 各組豚鼠結腸上皮細胞凋亡率（%，）

表1 各組豚鼠結腸上皮細胞凋亡率（%，）

注：正常組常規(guī)飲水進食60 d；模型組為大黃提取液6 g/（kg·d）60 d；白及組為大黃提取液6 g/（kg·d）第15 d 起10%白及水煎劑灌腸，3次/周；與正常組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05

3 討論

隨著結腸鏡檢查的普及與提高，MC 的檢出率也呈現(xiàn)增高趨勢。西方國家MC 的檢出率約在10%，國內資料報道其檢出率約為1.78%明顯低于西方國家[3]。MC 的發(fā)生與蒽醌類瀉藥的使用有95%的相關性，由于存在許多腸道病理狀況促使于蒽醌類瀉藥的使用，MC 正變得越來越普遍[7]。

MC 缺乏特異的臨床表現(xiàn)，它可以僅表現(xiàn)為腸鏡下結腸呈“豹紋樣”或“蟾蜍背樣”的改變，也可出現(xiàn)腹脹、便秘、排便不適或腹部隱痛等，而這些癥狀與腸易激綜合征的臨床表現(xiàn)類似，其機制可能與色素沉積所致的炎性反應以及腸道神經系統(tǒng)受累有關[9]。MC 的組織學檢查結果顯示，大量富含色素的巨噬細胞沉積在結腸固有層，其余層均正常，同時可伴見漿細胞、淋巴細胞、嗜酸性粒細胞浸潤。MC 病理組織切片的特征表現(xiàn)為結腸層存在大片的色素顆粒，固有層胞質中可見含色素顆粒的巨噬細胞，程度較輕的病變組織可無明顯黑變。本研究肉眼可見三組豚鼠結腸的不同，特殊染色方面，正常豚鼠結腸黑色素幾乎不可見，褪黑色素染色陰性，而模型組及白及組特殊染色均呈陽性改變，且白及組染色面積較MC 模型組減少，表明結腸黑變病經白及水煎劑干預后，病變程度有所減輕。

MC 的發(fā)病機制，目前普遍認為與細胞凋亡存在一定的相關性。透射電鏡能夠觀察到細胞在不同凋亡時期的特征性變化，而本研究結果亦與之相符。流式細胞儀能夠檢測細胞凋亡時細胞、亞細胞以及分子水平上所發(fā)生的特征性改變，本研究根據流式細胞術快速定性、定量的分析與分選單個細胞，檢測豚鼠結腸上皮細胞凋亡，MC 豚鼠模型結腸上皮細胞凋亡率有明顯升高，而經白及水煎劑灌腸后細胞凋亡率降低，表明藥物干預后MC 有所改善。

MC 屬于良性、可逆性病變，也有研究發(fā)現(xiàn)，MC與結腸癌存在一定的相關性，因此對于重度MC 應盡早干預。與西藥相比，中醫(yī)中藥在治療MC 方面發(fā)揮了獨特的效果和優(yōu)勢。一項數(shù)據挖掘研究顯示，中藥治療MC，用藥以益氣養(yǎng)陰、補血潤腸為主，兼以理氣祛瘀為法，必要時標本兼顧,靈活權變加減，可以取得較好的療效[9]。

本研究結果顯示，白及組結腸顏色、電鏡下超微結構、結腸細胞凋亡率較模型組均有一定程度的減輕，說明白及水煎劑確實對蒽醌類所致MC 有一定的改善作用，其作用機制可能是通過抑制結腸上皮細胞凋亡來實現(xiàn)，仍需進一步研究佐證。