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        冠心病病人外周血單個(gè)核細(xì)胞AIM2表達(dá)水平及其與炎性因子的相關(guān)性

        2022-08-19 08:15:14王玉燕鐵虎光金麗山馬萬(wàn)程
        關(guān)鍵詞:貨號(hào)外周血炎性

        王玉燕,鐵虎光,金麗山,馬萬(wàn)程

        冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病簡(jiǎn)稱冠心病,隨著飲食結(jié)構(gòu)的改變及生活水平的不斷進(jìn)步,該病發(fā)病率和死亡率呈增加趨勢(shì),引發(fā)的心源性死亡等嚴(yán)重不良預(yù)后成為重大的公共問(wèn)題[1]。冠心病主要包括穩(wěn)定型心絞痛(stable angina pectoris,SAP)、不穩(wěn)定型心絞痛(unstable angina pectoris,UAP)、急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI),冠心病是一種慢性炎癥性疾病,與腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-1、IL-6、IL-8、單核細(xì)胞趨化因子-1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)等炎性因子均有密切聯(lián)系[2-3]。黑色素瘤缺乏因子2(absent in melanoma 2,AIM2)是位于細(xì)胞質(zhì)中的一種蛋白質(zhì),可間接誘導(dǎo)炎癥體組裝,進(jìn)而在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用[4]。本研究旨在分析SAP、UAP、AMI病人外周血單個(gè)核細(xì)胞AIM2表達(dá)水平及其與血漿炎性因子的相關(guān)性,以期進(jìn)一步明確冠心病的發(fā)病機(jī)制。

        1 資料與方法

        1.1 一般資料 選取2019年7月—2020年5月于我院住院治療的221例冠心病病人,將冠心病病人分為SAP組(69例)、UAP組(74例)和AMI組(78例);同期選取健康體檢者79名作為對(duì)照組。

        1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn):AMI符合急性ST段抬高型心肌梗死診斷及治療指南[5],SAP符合慢性穩(wěn)定型心絞痛診斷與治療指南中的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6],UAP符合相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[7];病人病例資料齊全;符合倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn),所有研究對(duì)象均為自愿參與本研究;近1個(gè)月內(nèi)無(wú)手術(shù)治療史。排除標(biāo)準(zhǔn):伴有感染性疾病、惡性腫瘤;伴有原發(fā)性心肌病或嚴(yán)重肝、腎功能不全;6個(gè)月內(nèi)發(fā)生過(guò)腦卒中及急性腦血管疾?。话橛衅渌合到y(tǒng)及自身免疫疾??;近1周內(nèi)使用免疫抑制劑、抗炎藥物。

        1.3 觀察指標(biāo) 查閱門診及住院病歷,收集病人入院時(shí)臨床資料,包括性別、年齡、體質(zhì)指數(shù)(body mass index,BMI)、吸煙史、高血壓、糖尿病、三酰甘油(triglyceride,TG)、總膽固醇(total cholesterol,TC)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、血糖水平。

        1.4 主要試劑與儀器 RNA提取試劑盒(貨號(hào):YT9197)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號(hào):YT9036)購(gòu)自北京伊塔生物科技有限公司;SYBR?Green Master Mix(貨號(hào):11202ES)購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司;TNF-α酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒(貨號(hào):ABE10038)、IL-1 ELISA試劑盒(貨號(hào):ABE10470)、IL-8 ELISA試劑盒(貨號(hào):ABE10308)均購(gòu)自上海瓦蘭生物科技有限公司;IL-6 ELISA試劑盒(貨號(hào):SEKH-0013)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;MCP-1 ELISA試劑盒(貨號(hào):FT-P31471R)購(gòu)自上海梵態(tài)生物科技有限公司。實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative real-time PCR,RT-qPCR)儀(型號(hào):7500)購(gòu)自美國(guó)ABI公司;酶標(biāo)儀(型號(hào):INSTSUN-1)購(gòu)自瑞士Tecan公司。

        1.5 研究方法

        1.5.1 樣品采集及保存 抽取所有研究對(duì)象清晨空腹外周靜脈血樣置于離心管中,加同等體積生理鹽水;將混勻的血樣加入含有人外周血淋巴細(xì)胞分離液的離心管中;將上述樣品以3 000 r/min離心30 min后取出,此時(shí)離心管最上層為血漿(收集血漿待測(cè)),血漿層下的一白色薄層為外周血單個(gè)核細(xì)胞層;收集單個(gè)核細(xì)胞層,2 000 r/min離心5 min后取出,棄上清液,收集乳白色細(xì)胞;EP管中加入磷酸緩沖鹽溶液(PBS)吹懸數(shù)次,以2 000 r/min離心5 min后取出,棄上清液,重復(fù)2次或3次。

        1.5.2 外周血單個(gè)核細(xì)胞AIM2水平測(cè)定 采用試劑盒提取外周血單個(gè)核細(xì)胞總RNA后反轉(zhuǎn)錄得cDNA,操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。采用RT-qPCR儀擴(kuò)增AIM2及內(nèi)參GAPDH。AIM2及內(nèi)參GAPDH的引物序列見(jiàn)表1,引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)體系:cDNA模板(50 ng/μL)2 μL,SYBR?Green Master Mix 10 μL,上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL,ddH2O 6.4 μL。設(shè)3個(gè)重復(fù)孔,采用2-△△CT法計(jì)算外周血單個(gè)核細(xì)胞AIM2 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

        表1 RT-qPCR引物序列(5′-3′)

        1.5.3 血漿炎性因子水平檢測(cè) 采用ELISA檢測(cè)血漿TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、MCP-1水平,操作步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

        2 結(jié) 果

        2.1 4組臨床資料比較 對(duì)照組、SAP組、UAP組、AMI組性別、年齡、BMI、吸煙史比例、高血壓比例、糖尿病比例、TC、LDL-C、TG、血糖水平比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);HDL-C水平比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。詳見(jiàn)表2。

        表2 4組臨床資料比較

        2.2 4組外周血單個(gè)核細(xì)胞AIM2 mRNA水平比較 對(duì)照組、SAP組、UAP組、AMI組外周血單個(gè)核細(xì)胞AIM2 mRNA水平依次上升,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)表3、圖1。

        表3 4組外周血單個(gè)核細(xì)胞AIM2 mRNA水平比較(±s)

        圖1 4組外周血單個(gè)核細(xì)胞AIM2 mRNA水平比較

        2.3 4組血漿炎性因子水平比較 對(duì)照組、SAP組、UAP組、AMI組血漿TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、MCP-1水平均依次上升,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)表4。

        表4 4組血漿炎性因子水平比較(±s) 單位:pg/mL

        2.4 冠心病病人AIM2 mRNA水平與炎性因子的相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示:冠心病病人AIM2 mRNA水平與TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、MCP-1均呈正相關(guān)(P<0.05)。詳見(jiàn)表5。

        表5 冠心病病人AIM2 mRNA水平與炎性因子的相關(guān)性分析

        2.5 影響冠心病發(fā)生的多因素Logistic回歸分析 將是否發(fā)生冠心病作為因變量,以AIM2、TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、MCP-1、HDL-C作為自變量進(jìn)行Logistic回歸分析,結(jié)果顯示:AIM2是冠心病發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.01),HDL-C是冠心病發(fā)生的保護(hù)因素(P<0.01)。詳見(jiàn)表6。

        表6 影響冠心病發(fā)生的多因素Logistic回歸分析

        3 討 論

        動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制包括脂質(zhì)浸潤(rùn)學(xué)說(shuō)、氧化刺激學(xué)說(shuō)、損傷應(yīng)答學(xué)說(shuō)、免疫炎癥學(xué)說(shuō)等,其中免疫和炎癥與動(dòng)脈粥樣硬化密切相關(guān)[8]。冠心病病人病變局部有炎性細(xì)胞浸潤(rùn),且體內(nèi)炎性因子水平與心血管事件發(fā)生有關(guān)[9]。冠心病不良預(yù)后發(fā)生率極高,給家庭帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)和醫(yī)療負(fù)擔(dān),同時(shí)影響病人生活質(zhì)量和生命健康[10]。因此,分析冠心病病人體內(nèi)炎癥反應(yīng)相關(guān)的生物指標(biāo),可能為進(jìn)一步探討冠心病發(fā)生發(fā)展提供理論基礎(chǔ),為治療提供新思路。

        目前研究證實(shí)TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、MCP-1等炎性因子與冠心病密切相關(guān),其中TNF-α主要由巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞合成,是體內(nèi)重要的炎癥介質(zhì),在炎癥反應(yīng)及免疫調(diào)節(jié)中均可發(fā)揮生物學(xué)功能,觸發(fā)冠心病發(fā)生、發(fā)展[11];IL-1通過(guò)促進(jìn)B細(xì)胞增殖及抗體分泌,發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用,可間接參與動(dòng)脈粥樣硬化的形成[12];IL-6參與炎癥反應(yīng),在炎癥早期、局限性炎癥及機(jī)體出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)等多種因素中有不同程度升高[13];IL-8在巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞合成,其他細(xì)胞可少量產(chǎn)生[14];MCP-1是趨化因子CC家族成員,可與趨化因子受體結(jié)合,從而在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊炎癥反應(yīng)中發(fā)揮作用[15]。本研究通過(guò)檢測(cè)SAP、UAP、AMI病人血漿炎性因子,結(jié)果顯示TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、MCP-1水平均高于健康人群,且AMI病人血漿炎性因子水平最高,與史麗紅等[16-17]研究結(jié)果一致。AIM2可識(shí)別細(xì)胞質(zhì)雙鏈DNA,并與其結(jié)合形成炎性復(fù)合體,之后通過(guò)與熱蛋白結(jié)構(gòu)域相互作用招募接頭蛋白,進(jìn)而調(diào)節(jié)炎性因子表達(dá)[18]。張席軍等[19]研究表明,乙型肝炎病毒相關(guān)性腎炎病人AIM2表達(dá)水平升高,且與IL-1β等多種炎性因子存在密切聯(lián)系。本研究結(jié)果顯示,健康人群、SAP病人、UAP病人、AMI病人外周血單個(gè)核細(xì)胞AIM2 mRNA水平依次上升,且AIM2是冠心病發(fā)生的影響因素。提示AIM2高表達(dá)可能與冠心病發(fā)生、發(fā)展有密切聯(lián)系。進(jìn)一步研究顯示,冠心病病人體內(nèi)AIM2 mRNA表達(dá)水平與炎性因子TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、MCP-1呈正相關(guān)。推測(cè)冠心病病人AIM2表達(dá)水平升高后,可感知并結(jié)合胞質(zhì)雙鏈DNA,形成復(fù)合體后促進(jìn)TNF-α、IL-1、IL-6等炎性因子成熟和分泌。

        綜上所述,SAP、UAP、AMI的冠心病病人外周血單個(gè)核細(xì)胞中AIM2呈高表達(dá),且與炎性因子TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、MCP-1呈正相關(guān)。AIM2可能通過(guò)促進(jìn)炎性因子表達(dá),參與冠心病發(fā)生發(fā)展,推測(cè)其可能成為冠心病潛在的治療靶點(diǎn)。臨床應(yīng)密切監(jiān)測(cè)冠心病病人AIM2及TNF-α、IL-1等炎性因子水平變化,及時(shí)制定合理有效的治療措施。今后需通過(guò)體外或體內(nèi)干預(yù)AIM2表達(dá),如建立AIM2基因敲除小鼠模型驗(yàn)證本研究結(jié)論。

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