吳亞芳，亢崇仰，陳悅?cè)A，陸兆豐

創(chuàng)傷引起的出血性腦損傷在臨床上較為常見，具有較高發(fā)病率、致死率，較多存活病人可遺留不同程度后遺癥，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量[1]。出血性腦損傷的發(fā)生與腦血管病變密切相關(guān)，且發(fā)病后易出現(xiàn)較多并發(fā)癥，其中血腦屏障通透性增加較嚴(yán)重[2]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療出血性腦損傷多以藥物止血、降顱壓、血腫清除術(shù)為主，但仍無法直接解決大量神經(jīng)元壞死引發(fā)的神經(jīng)功能缺損[3]。沉默信息調(diào)節(jié)因子2(silent-mating information regulater 2，Sirt2)是一種NAD+依賴的蛋白去乙?；割?，在細(xì)胞周期控制、細(xì)胞分化、DNA修復(fù)等多重生物學(xué)調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮重要作用[4]。研究發(fā)現(xiàn)，Sirt2抑制劑具有神經(jīng)保護(hù)作用，可減輕神經(jīng)功能受損[5-6]，但其對出血性腦損傷大鼠神經(jīng)功能改善及血腦屏障通透性影響方面的研究較少，作用機(jī)制不明確?；诖耍狙芯块_展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，著重分析Sirt2抑制劑對出血性腦損傷大鼠的改善作用及對血腦屏障通透性的影響，并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取45只健康SD雄性大鼠，8周齡，體質(zhì)量260～280 g，購自北京科興生物制品有限公司，許可證號(hào)SYXK(京)2019-0053。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，環(huán)境溫度(22±2)℃，相對濕度45%～60%，光照周期12 h/12 h，自由獲得飲水、飼料。本研究經(jīng)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，動(dòng)物處置符合“3R”原則。

1.1.2 藥物、試劑和儀器 Sirt2抑制劑AK-7(美國Gene Operation公司)，戊巴比妥鈉(美國Sigma公司)，伊文思藍(lán)染料(美國Amerso公司)，白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(湖北武漢塞維爾公司)，蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin staining，HE)試劑盒(美國Genmed公司)，蛋白質(zhì)印跡法檢測試劑盒(美國KPL公司)，二喹啉甲酸法(BCA)蛋白試劑盒(湖北武漢富鑫遠(yuǎn)科技有限公司)，兔抗大鼠Sirt2、核轉(zhuǎn)錄因子-κB p65(nuclear factor-κB，NF-κB p65)、磷酸化NF-κB p65(phosphorylate-NF-κB p65，p-NF-κB p65)一抗及山羊抗兔IgG二抗(美國Santa Cruz公司)。HN550型冷凍切片機(jī)(德國Microtome Cryostat)，XB51-32H01型病理圖像分析系統(tǒng)(日本奧林巴斯株式會(huì)社)，XSZ-H-9507285顯微鏡(重慶光學(xué)儀器廠)，DG5031酶聯(lián)免疫酶標(biāo)儀(華東電子醫(yī)療公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 模型制備及分組 從45只大鼠中隨機(jī)取15只作為假手術(shù)組，另30只建立出血性腦損傷模型[7]：大鼠以2%戊巴比妥鈉50 mg/kg(0.25 mL/100 g)腹腔注射麻醉，仰臥位固定在手術(shù)臺(tái)上。頂毛剃除，75%乙醇消毒。于頭皮正中作1 cm切口，骨膜剪開，前囟暴露。鉆孔點(diǎn)為前囟前0.2 mm、中線旁開2 mm處，用1 mL注射器沿鉆孔口緩慢進(jìn)針至尾狀核。以0.28 μL含0.5 U/μL的Ⅶ型膠原酶及6.25 U/μL肝素的生理鹽水緩慢注射，注射時(shí)間3 min，留針10 min后緩慢拔針，后骨蠟填充鉆孔，生理鹽水沖洗干凈，縫合皮膚。大鼠清醒后，采用神經(jīng)功能缺陷評分(Neurological Severity Scores，NSS)評估神經(jīng)功能損傷情況[8]，神經(jīng)功能無異常，計(jì)0分；提尾時(shí)左前肢明顯屈曲，計(jì)1分；大鼠行走時(shí)不自主向左側(cè)轉(zhuǎn)圈，計(jì)2分；大鼠行走時(shí)不自主向左側(cè)傾斜，計(jì)3分；大鼠意識(shí)減退，無自發(fā)行走，計(jì)4分。以NSS評分1～3分為建模成功。30只大鼠建模成功24只，成功率為80%。24只大鼠隨機(jī)分為模型組與Sirt2抑制劑組，每組12只。假手術(shù)組術(shù)中僅注射等量生理鹽水，其余操作步驟同模型組、Sirt2抑制劑組，術(shù)后NSS評分0分入選，15只大鼠均納入研究。

1.2.2 干預(yù)方法 建模成功后立即給藥，Sirt2抑制劑組以25 mg/kg體質(zhì)量Sirt2抑制劑AK-7(用生理鹽水稀釋至0.25 mL)腹腔注射，假手術(shù)組、模型組以等體積生理鹽水腹腔注射，均給藥1次。

1.2.3 取材、處理 各組給藥后24 h，采用NSS評分法評估神經(jīng)功能損傷。完成評估后，以2%戊巴比妥鈉50 mg/kg(0.25 mL/100 g)腹腔注射麻醉，斷頭處死。各組分別選擇4只大鼠，取腦組織，分為3份，2份置于液氮保存，用于炎性因子、蛋白表達(dá)檢測；1份置于4%多聚甲醛固定，用于HE染色。各組剩余大鼠中隨機(jī)選擇4只，剝?nèi)⊥暾X組織，置于干凈濾紙，表面滲液、血跡去除，稱重，記為濕重；置于60 ℃烘箱烘烤48 h，取出稱重，記為干重。以干濕法測定腦組織濕重/干重(wet/dry weight ratio，W/D)值。各組剩余大鼠取4只行血腦屏障通透性檢測。

1.2.4 炎性因子IL-6、TNF-α水平檢測 采用ELISA法檢測炎性因子IL-6、TNF-α水平。取液氮保存腦組織，生理鹽水沖洗，冰浴下制備10%組織勻漿。4 ℃、12 000 r/min離心，離心半徑8 cm，10 min，取上清液。嚴(yán)格按照IL-6、TNF-α試劑盒說明書步驟操作：相應(yīng)反應(yīng)孔內(nèi)加不同程度標(biāo)準(zhǔn)品100 μL、標(biāo)本100 μL，37 ℃，溫育，2 h。甩干板內(nèi)液體，洗滌4次。各孔加100 μL一抗工作液，混勻，37 ℃，溫育，1 h。甩干板內(nèi)液體，洗滌4次。各孔加100 μL酶標(biāo)工作液，混勻，37 ℃，溫育，30 min。甩干板內(nèi)液體，洗滌4次。各孔加100 μL底物工作液，混勻，37 ℃，溫育，15 min。各孔加100 μL終止液，反應(yīng)10 min。20 min內(nèi)觀察酶標(biāo)儀450 nm波長處吸光度值。將標(biāo)準(zhǔn)品濃度作為橫坐標(biāo)，吸光度值作為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)本吸光度值獲得濃度值。

1.2.5 腦組織病理形態(tài)學(xué)檢測 采用HE染色法檢測腦組織病理形態(tài)。取4%多聚甲醛固定腦組織，生理鹽水沖洗，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)浸泡12 h。脫水，石蠟包埋，切片，厚度4 μm，烤干。二甲苯透明，梯度乙醇脫蠟，水洗。蘇木精染色5 min，1%鹽酸乙醇分化，流水沖洗，共30 min。伊紅染色，流水沖洗，梯度乙醇脫蠟。二甲苯透明，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察大鼠腦組織病理形態(tài)學(xué)。

1.2.6 血腦屏障通透性檢測 采用伊文思藍(lán)灌注染色法檢測血腦屏障通透性。各組所選大鼠以2%溶于生理鹽水的伊文思藍(lán)染料4 mL/kg靜脈注射，靜待2 h，觀察大鼠四肢末梢、結(jié)膜、齒齦、尾部呈藍(lán)色后，以2%戊巴比妥鈉50 mg/kg(0.25 mL/100 g)腹腔注射麻醉。自大鼠左心室插入灌注針，止血鉗固定。右心耳剪破，以250 mL生理鹽水緩慢自左心室灌注，清除腦血管內(nèi)殘留血液，以右心耳流出清亮液體為止。大鼠斷頭處死，快速將出血側(cè)腦半球組織取出，腦表面以生理鹽水沖洗，避免雜質(zhì)、血跡影響吸光度值。出血側(cè)腦半球組織稱重，置入1 mL/100 mg甲酰胺，37 ℃，48 h。低溫離心，觀察酶標(biāo)儀620 nm波長處吸光度值。通過倍比稀釋法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，將所得吸光度值轉(zhuǎn)換為伊文思藍(lán)染料含量，進(jìn)行血腦屏障通透性評估。

1.2.7 腦組織Sirt2、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白相對表達(dá)量檢測 采用蛋白質(zhì)印跡法檢測腦組織Sirt2、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白相對表達(dá)量。取液氮保存腦組織，PBS沖洗2次。加RIPA裂解液，冰上裂解30 min。4 ℃，12 000 r/min離心，離心半徑10 cm，8 min，取上清液。BCA試劑盒行蛋白定量，加2×上樣緩沖液。沸水浴10 min，變性。10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離蛋白，轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，加5%脫脂奶粉封閉1 h。加兔抗大鼠Sirt2、NF-κB p65、p-NF-κB p65(1∶1 000)一抗，4 ℃搖床孵育，過夜。TBST洗膜4次，每次10 min。加二抗(1∶2 500)，室溫孵育，共2 h。TBST洗膜4次，每次10 min。加化學(xué)發(fā)光法(ECL)檢測試劑，成像儀曝光成像。經(jīng)目的蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值比值計(jì)算目的蛋白表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1 3組大鼠NSS評分比較 與模型組比較，Sirt2抑制劑組NSS評分降低(P<0.05)。詳見表1。

表1 3組大鼠NSS評分比較(±s) 單位：分

2.2 3組大鼠IL-6、TNF-α水平比較 與假手術(shù)組比較，模型組、Sirt2抑制劑組IL-6、TNF-α水平升高(P<0.05)；與模型組比較，Sirt2抑制劑組IL-6、TNF-α水平降低(P<0.05)。詳見表2。

表2 3組大鼠IL-6、TNF-α水平比較(±s) 單位：pg/mL

2.3 3組大鼠腦組織W/D值比較 與假手術(shù)組比較，模型組、Sirt2抑制劑組腦組織W/D值升高(P<0.05)；與模型組比較，Sirt2抑制劑組腦組織W/D值降低(P<0.05)。詳見表3。

表3 各組腦組織W/D值比較(±s)

2.4 3組大鼠腦組織形態(tài)比較 HE染色顯示，假手術(shù)組腦組織結(jié)構(gòu)無異常，神經(jīng)細(xì)胞有序排列，染色較均勻，無炎性細(xì)胞浸潤。模型組腦組織結(jié)構(gòu)紊亂，出現(xiàn)局部出血、水腫，損傷腦組織區(qū)伴大量炎性細(xì)胞浸潤。與模型組比較，Sirt2抑制劑組腦組織結(jié)構(gòu)紊亂、局部出血、水腫、炎性細(xì)胞浸潤等現(xiàn)象明顯改善。詳見圖1。

圖1 各組大鼠腦組織病理形態(tài)學(xué)變化比較(HE，×400)

2.5 3組大鼠血腦屏障通透性比較 與假手術(shù)組比較，模型組、Sirt2抑制劑組大腦皮層、基底節(jié)區(qū)伊文思藍(lán)含量升高(P<0.05)；與模型組比較，Sirt2抑制劑組大腦皮層、基底節(jié)區(qū)伊文思藍(lán)含量降低(P<0.05)。詳見表4。

表4 3組大鼠血腦屏障通透性比較(±s) 單位：μg/g

2.6 3組大鼠Sirt2、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白相對表達(dá)量比較 與假手術(shù)組比較，模型組、Sirt2抑制劑組Sirt2、p-NF-κB p65蛋白相對表達(dá)量升高(P<0.05)；與模型組比較，Sirt2抑制劑組Sirt2、p-NF-κB p65蛋白相對表達(dá)量降低(P<0.05)。詳見圖2、表5。

圖2 3組大鼠Sirt2、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表達(dá)條帶圖

表5 3組大鼠Sirt2、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白相對表達(dá)量比較(±s)

3 討 論

腦出血是一種常見的急危重癥，其發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多層次、多因素的復(fù)雜過程，而腦出血后繼發(fā)性腦損傷是導(dǎo)致病人殘疾、死亡的主要原因[9]。目前認(rèn)為出血性腦損傷發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，包括細(xì)胞毒性物質(zhì)釋放、炎癥反應(yīng)、血腦屏障破壞等[10]。腦出血后，血腦屏障被破壞，發(fā)病3 h至14 d內(nèi)，血腫周圍水腫持續(xù)增加，這是腦出血后致殘、致死的重要病理基礎(chǔ)[11]。另外，腦出血后繼發(fā)的炎癥反應(yīng)在血腦屏障紊亂中也具有重要作用。因此，臨床上盡早診治出血性腦損傷病人，尋求新的治療靶點(diǎn)，減輕神經(jīng)功能損傷，控制血腦屏障破壞，已成為研究熱點(diǎn)之一。

Sirtuins屬于蛋白去乙?；割?，可調(diào)控代謝、細(xì)胞分裂、老化等細(xì)胞和生物過程，而Sirt2為Sirtuins家族成員之一，主要定位于細(xì)胞質(zhì)[12]。在神經(jīng)系統(tǒng)方面，雖有研究發(fā)現(xiàn)Sirt2敲除可引發(fā)髓鞘形成減慢[13]，但目前仍不知激活Sirt2在促進(jìn)損傷神經(jīng)髓鞘再生中是否有作用。另外，也有報(bào)道顯示，在神經(jīng)退行性疾病中，Sirt2抑制劑通過對固醇合成進(jìn)行抑制從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[14]?？梢?，Sirt2抑制劑對神經(jīng)損傷的功能目前研究少且存在爭議，可能是腦損傷后潛在的治療靶點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用Sirt2抑制劑治療后，大鼠NSS評分、W/D值及IL-6、TNF-α水平降低，大腦皮層、基底節(jié)區(qū)伊文思藍(lán)含量減少；進(jìn)一步分析腦組織病理形態(tài)學(xué)，發(fā)現(xiàn)Sirt2抑制劑組腦組織結(jié)構(gòu)紊亂、局部出血、水腫、炎性細(xì)胞浸潤等現(xiàn)象明顯改善，提示Sirt2抑制劑可改善出血性腦損傷大鼠神經(jīng)功能，減輕炎癥反應(yīng)、腦水腫，降低血腦屏障通透性，控制腦組織損傷。

NF-κB是一種含多向轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用的核蛋白因子，可參與炎癥、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡等病理過程。相關(guān)報(bào)道顯示，Sirt2可參與NF-κB信號(hào)通路，且在細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)、多種糖脂代謝等方面發(fā)揮重要作用[15]。有學(xué)者提出，Sirt2在應(yīng)激條件下，可通過對NF-κB去乙酰化，調(diào)節(jié)細(xì)胞應(yīng)激所致?lián)p傷[16]。還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，Sirt2/NF-κB信號(hào)通路可參與免疫、炎癥介導(dǎo)的神經(jīng)損傷，機(jī)制可能是Sirt2能對NF-κB活性進(jìn)行抑制，阻礙依賴NF-κB激活轉(zhuǎn)錄的炎性細(xì)胞因子釋放，以減輕炎癥反應(yīng)[17]。這些研究均提示Sirt2/NF-κB信號(hào)通路可能在出血性腦損傷中有一定作用。本研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用Sirt2抑制劑后，大鼠Sirt2、p-NF-κB p65蛋白相對表達(dá)量均降低，提示Sirt2抑制劑能對Sirt2/NF-κB信號(hào)通路進(jìn)行抑制，這可能是Sirt2抑制劑發(fā)揮改善大鼠出血性腦損傷、降低血腦屏障通透性的重要作用機(jī)制之一。

綜上所述，Sirt2抑制劑可改善出血性腦損傷大鼠神經(jīng)功能，減輕炎癥反應(yīng)、腦水腫，降低血腦屏障通透性，作用機(jī)制可能與抑制Sirt2/NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。本研究存在一定不足之處，如研究局限于大鼠，并未實(shí)際應(yīng)用到臨床，且Sirt2抑制劑對大鼠出血性腦損傷改善作用及對血腦屏障通透性影響途徑較多，本研究并未就其他作用機(jī)制進(jìn)行分析，今后仍需進(jìn)一步深入研究。