姜承勇，鄭家棟，顏彪，張嘉漪

復(fù)旦大學(xué) 腦科學(xué)研究院，醫(yī)學(xué)神經(jīng)生物學(xué)國家重點實驗室/教育部腦科學(xué)前沿科學(xué)中心，上海 200032

視覺是人類及大多數(shù)動物感知外界環(huán)境信息的重要來源[1]，視覺功能的實現(xiàn)依賴于完整的視覺環(huán)路和健康的眼周環(huán)境。視網(wǎng)膜退行性疾病(retinal degeneration, RD)是一種以視網(wǎng)膜細胞漸進性凋亡為主、視網(wǎng)膜的完整性被破壞直到視覺功能完全喪失的慢性疾病[2]，在遺傳上表現(xiàn)為高度異質(zhì)性，具有繼發(fā)性和不可逆性的特點[3-6]。全球RD患者多達0.3億人[7]。在中國，視覺障礙是繼聽覺障礙之后第二大致殘疾病，超過3.3%的中國人遭受不同程度的影響，其中視網(wǎng)膜退行性疾病是主要致盲因素之一，嚴重影響患者的生活質(zhì)量[8]。根據(jù)發(fā)病機制的不同，視網(wǎng)膜退行性疾病可分為兩大類別：遺傳性的視網(wǎng)膜退行性疾病(inherited retinal degeneration, IRD)和復(fù)雜視網(wǎng)膜變性所導(dǎo)致的視網(wǎng)膜退行性疾病。前者是遺傳變異性疾病，主要臨床疾病類型是視網(wǎng)膜色素變性(retinitis pigmentosa, RP)[9-10]。后者受到基因和環(huán)境的共同影響，臨床高發(fā)的疾病類型包括年齡相關(guān)的黃斑變性(age-related macular degeneration, AMD)[11]、糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy, DR)[12]和黃斑營養(yǎng)不良(Stargardt macular dystrophy, STGD)[13]。在過去的十幾年里，我們見證了醫(yī)療領(lǐng)域在恢復(fù)視網(wǎng)膜退行性疾病患者視覺方面所取得的一系列重大技術(shù)和方法上的突破，如基因替代療法用于萊伯先天性黑內(nèi)障(LCA)患者的治療[14]，以及視網(wǎng)膜假體Argus II和Alpha-IMS在視網(wǎng)膜色素變性病人身上的應(yīng)用[15-16]。除此之外，藥物和神經(jīng)保護因子治療、干細胞療法等也在實驗動物研究和臨床研究中嶄露頭角。越來越多新的治療方法的出現(xiàn)有望為視網(wǎng)膜退行性疾病患者帶來福音。

1 視網(wǎng)膜退行性疾病

1.1 視網(wǎng)膜色素變性

視網(wǎng)膜色素變性是一種由基因突變引起的視網(wǎng)膜退行性疾病，其在人群中的發(fā)病率為1/4 000[17]。患者的早期病癥主要為因視桿細胞受損而導(dǎo)致的夜盲癥。最初病變開始于視網(wǎng)膜赤道部，表現(xiàn)為周圍視野的丟失；之后逐漸擴展到視野中心；最終引起視錐細胞凋亡直至患者失明[18]。視網(wǎng)膜色素變性患者中有15%～35%為常染色體顯性遺傳，癥狀較輕，發(fā)病時間較遲；5%～45%為常染色體隱性遺傳；有5%～17%為X染色體連鎖遺傳，其癥狀較為嚴重[19]。此外，還有一部分是由于線粒體基因發(fā)生突變，表現(xiàn)為母系遺傳模式[20]。與視網(wǎng)膜色素變性相關(guān)的突變基因編碼產(chǎn)物大多與光感受器的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和新陳代謝、基因剪切、蛋白合成以及細胞結(jié)構(gòu)等相關(guān)[21]。其中位于2號染色體短臂上的視紫紅質(zhì)(RHO)基因是第一個被報道的視網(wǎng)膜色素變性致病基因[22]。視紫紅質(zhì)是視網(wǎng)膜光感受器中視桿細胞的色素分子，也是超過25%的視網(wǎng)膜色素變性病人的致病基因[23]，RHO不同位點的突變最終都將導(dǎo)致視紫紅質(zhì)合成和定位錯誤。Dryja等[24-25]首次報道了由RHO P23H位點突變導(dǎo)致的視紫紅質(zhì)錯誤折疊，造成視桿細胞功能異常，進而引起視網(wǎng)膜色素變性。另外一個高發(fā)的突變基因是PDE6B，該基因突變引起cGMP-磷酸二酯酶的β亞基失活，導(dǎo)致視桿細胞外段cGMP濃度升高，增加了保持開放的陽離子通道，最終導(dǎo)致視桿細胞死亡[26-27]。此外，RPE65蛋白在視網(wǎng)膜色素上皮細胞中的含量較豐富，參與11-順式視黃醇的合成，因此相關(guān)基因的突變將導(dǎo)致類視黃醇及其衍生物的積累；MUTYH基因突變引發(fā)DNA單鏈斷裂，加速細胞壞死；RP1和CRB1基因突變導(dǎo)致微管蛋白無法合成，從而造成視網(wǎng)膜細胞間物質(zhì)運輸受阻[28-29]等異常。目前被鑒定為視網(wǎng)膜色素變性致病基因的數(shù)量已超過150個[18]，以單基因突變?yōu)橹鳎俨糠执嬖陔p基因突變或多基因突變[30]。值得一提的是，視網(wǎng)膜色素變性相關(guān)的突變基因存在人種差異性。在中國人群中，CYP4V2基因突變占據(jù)了視網(wǎng)膜色素變性突變基因的25%[31]，而在北美人群中，RHO是最主要的致病基因[32]。

1.2 年齡相關(guān)的黃斑變性

年齡相關(guān)的黃斑變性是一種慢性的退行性黃斑疾病。隨著年齡的增加，視網(wǎng)膜色素上皮細胞、光感受器、玻璃膜(又稱Bruch膜)和脈絡(luò)膜復(fù)合體發(fā)生漸進性退化，進而出現(xiàn)色素沉著，導(dǎo)致患者視覺功能丟失[33]，嚴重影響老年群體的生活質(zhì)量。在西方國家，有1%～3%的老年人受到年齡相關(guān)的黃斑變性的困擾，預(yù)計到2040年全球有將近3億人罹患年齡相關(guān)的黃斑變性[34]。一項基于761個參與者的研究表明，與正常人相比，由于眼底的病變，年齡相關(guān)的黃斑變性患者的生活受到很大的負面影響，包括情緒、日常行為等；也有研究表明年齡相關(guān)的黃斑變性患者的認知功能受到影響[35-36]。年齡相關(guān)的黃斑變性的發(fā)病機制復(fù)雜，涉及不同的文化背景、年齡、生活方式、飲食習(xí)慣、基因等影響(表1)。此外，年齡相關(guān)的黃斑變性還和其他疾病伴生，比如高血壓、甲狀腺機能亢進、糖尿病、阿爾茲海默癥等[37]。根據(jù)發(fā)病時間的不同，可以將年齡相關(guān)的黃斑變性分為早期和晚期兩個階段：年齡相關(guān)的黃斑變性的早期病理癥狀不明顯，主要表現(xiàn)為在視網(wǎng)膜色素上皮形成脈絡(luò)膜小疣[38]；晚期伴隨有嚴重的視力丟失，并且可以進一步分為干性和濕性兩種類型[39-40]。干性年齡相關(guān)的黃斑變性由于視網(wǎng)膜中形成脈絡(luò)膜小疣，阻礙了視網(wǎng)膜中營養(yǎng)物質(zhì)的供應(yīng)，從而導(dǎo)致黃斑區(qū)光感受器細胞的大面積凋亡；濕性年齡相關(guān)的黃斑變性由于視網(wǎng)膜中微小血管的不斷形成，容易發(fā)生血管破裂和滲出，進而引發(fā)炎癥反應(yīng)。與濕性年齡相關(guān)的黃斑變性不同，在干性年齡相關(guān)的黃斑變性后期，由于沒有血管再生，視網(wǎng)膜色素上皮細胞(retinal pigment epithelium, RPE)出現(xiàn)凋亡并且無法支持光感受器的正常功能，因此患者往往在短時間內(nèi)即喪失視覺[41]。年齡相關(guān)的黃斑變性是環(huán)境和基因共同作用的結(jié)果，目前已鑒定出超過50個年齡相關(guān)的黃斑變性的易感基因[40]。大多數(shù)基因與補體系統(tǒng)、細胞外基質(zhì)的建成、脂質(zhì)代謝等細胞生化途徑相關(guān)[42]，其中最主要的兩個基因是CFH和ARMS2，前者的編碼產(chǎn)物是補體因子H，而后者的功能尚不清楚[42-43]。與視網(wǎng)膜色素變性致病基因不同，年齡相關(guān)的黃斑變性相關(guān)基因突變主要導(dǎo)致眼底血管的增生，進而引發(fā)炎癥反應(yīng)。環(huán)境因素中年齡是最大的致病因子，幾乎所有的年齡相關(guān)的黃斑變性患者年齡都超過60歲[44]。除此以外，飲食和生活習(xí)慣也與年齡相關(guān)的黃斑變性有關(guān)，長期的吸煙和胡蘿卜素攝入不足將顯著提高患病的概率和提前發(fā)病的時間[45]。

1.3 糖尿病視網(wǎng)膜病變

糖尿病視網(wǎng)膜病變是長期罹患糖尿病患者的典型并發(fā)癥。據(jù)美國眼科醫(yī)學(xué)學(xué)會的流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，全球糖尿病患者高達3.87億人，預(yù)計到2035年將達到5.92億人。研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病視網(wǎng)膜病變在糖尿病人群中發(fā)病率大約為30%，其中Ⅰ型糖尿病發(fā)病率達到95% ，Ⅱ型糖尿病占50%～60%[46]。臨床上根據(jù)糖尿病視網(wǎng)膜病變病人的臨床病癥，可以大致分為非增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變(nonproliferative diabetic retinopathy,NPDR)和增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變(proliferative diabetic retinopathy, PDR)[47](表1)。在早期非增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變患者的眼底，可檢測到微動脈瘤或小血管的腫脹，隨后腫脹的血管發(fā)生液體滲出，引發(fā)視網(wǎng)膜炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致黃斑水腫，直接影響視網(wǎng)膜的功能，這個過程又稱為糖尿病性黃斑水腫[48-49]。如果未及時給予干預(yù)，患者視網(wǎng)膜的特定區(qū)域?qū)⒅饾u進入嚴重缺血狀態(tài)，并分泌血管內(nèi)皮生長因子和腫瘤壞死因子等[46,50]，導(dǎo)致新血管的生長，而這也標志著疾病從非增殖性過渡為增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變[51-52]。在增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變期，血管向玻璃體腔的生長和侵潤常導(dǎo)致出血，而向黃斑的侵潤則會導(dǎo)致視力的長期喪失。此外，新生血管的瘢痕化或膠質(zhì)細胞的增生會導(dǎo)致玻璃體和視網(wǎng)膜之間的牽引力增大，進而引起視網(wǎng)膜色素上皮與視細胞層之間發(fā)生脫離，最終使得患者失明。除此之外，因血管增生而引發(fā)的炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、血管內(nèi)皮細胞和神經(jīng)節(jié)細胞的凋亡等也都參與到糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)病進程中[47,53]。

1.4 黃斑營養(yǎng)不良

黃斑營養(yǎng)不良是在成年人和嬰幼兒中均普遍發(fā)生的一類常染色體隱性突變引起的視網(wǎng)膜退行性疾病。雖然其發(fā)病比例低(一般為1/8 000～1/10 000)，但是發(fā)病時間早，而且發(fā)病后12～24個月內(nèi)患者視覺便急劇消退[54-56]。患者的典型病癥表現(xiàn)為中心視野丟失[57](表1)。黃斑營養(yǎng)不良是由遺傳因素和環(huán)境因素共同參與的一類視網(wǎng)膜退行性疾病，其中以遺傳性為主[2]。ATP級聯(lián)轉(zhuǎn)運家族A4(ABCA4)是黃斑營養(yǎng)不良患者的主要致病基因，該基因產(chǎn)物參與光感受器細胞中類視黃醇類物質(zhì)從膜盤向胞質(zhì)中的轉(zhuǎn)運，從而介導(dǎo)視黃醇的循環(huán)使用。一旦ABCA4異常，將導(dǎo)致視黃酰乙醇胺(A2E)在視網(wǎng)膜色素上皮細胞中積累，視黃酰乙醇胺的積累最終會導(dǎo)致視網(wǎng)膜色素上皮細胞中脂褐質(zhì)的沉積，即形成患者眼底熒光素血管造影上看到的黃色斑塊[58-59]，該時期稱為少年黃斑營養(yǎng)不良[60]。隨著疾病的進一步發(fā)展，開始出現(xiàn)視錐視桿細胞的死亡，脈絡(luò)膜和視網(wǎng)膜萎縮，此時被稱為保留中央凹的黃斑萎縮[59]。除了ABCA4基因，在一些病例中也篩查到由ELOVL4、PROM1基因突變所誘發(fā)的STDG樣病，這兩類突變基因分別對應(yīng)臨床上STGD3(后來發(fā)現(xiàn)STGD2和STDG3由同一個基因突變造成，2005年遂取消STGD2命名，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/6784)和STGD4型患者[58]。其中ELOVL4基因的表達產(chǎn)物在視網(wǎng)膜中僅定位于光感受器的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，參與脂肪酸的合成，該基因的突變會導(dǎo)致ELOVL4定位錯誤，進而導(dǎo)致光感受器和色素上皮細胞吞噬功能異常[61-63]。PROM1基因表達產(chǎn)物是糖蛋白，定位于視網(wǎng)膜外段，參與光感受器細胞的膜盤的發(fā)生以及調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜色素上皮的吞噬作用，該基因異常導(dǎo)致光感受器外段的功能和形態(tài)異常[64-65]。黃斑營養(yǎng)不良患者典型的病理特征是眼底黃斑的形成，但是由于發(fā)病早期眼底特征不明顯，常被誤診為功能性視力喪失、弱視和其他形式的視網(wǎng)膜退行性疾病[66-67]。而在發(fā)病晚期，患者眼底呈現(xiàn)出類似于AMD的視網(wǎng)膜地理萎縮和視網(wǎng)膜下新生血管膜增生，因此常被誤診為AMD[59,68]。為了提高臨床診斷的準確率，常采用光學(xué)相干斷層成像術(shù)(OCT)、眼底自發(fā)熒光血管造影(FAF)、基于光譜閾的脈絡(luò)膜OCT成像(SD-OCT)、全視野閃光視網(wǎng)膜電圖(ffERG)以及多焦視網(wǎng)膜電圖(mfERG)等相結(jié)合[69]，可以篩查更早期的病變。此外，最新開發(fā)的分子檢測和基因檢測也對STGD的早期確診和干預(yù)發(fā)揮著重要作用[54]。

表1 視網(wǎng)膜退行性疾病類型及特征

1.5 其他視網(wǎng)膜退行性疾病

除了上述主要的視網(wǎng)膜退行性疾病外，在眼科臨床診斷中，還可根據(jù)癥狀和發(fā)病機制的不同分出一些亞類，例如萊伯先天性黑內(nèi)障是視網(wǎng)膜色素變性的一種類型，其主要特征為瞳孔光感差、發(fā)病早，且患者主要集中在嬰幼兒[68,70]。其他發(fā)病率較低的視網(wǎng)膜退行性疾病還包括X染色體相關(guān)的視錐細胞營養(yǎng)不良(cone dystrophy, COD)和視錐-視桿細胞營養(yǎng)不良(cone-rod dystrophy, CORD)，這兩類疾病的臨床發(fā)病率為1 /20 000～1/100 000。視錐細胞營養(yǎng)不良的病理特征表現(xiàn)為視網(wǎng)膜中心視錐細胞的凋亡。在患病早期，患者的中心視野和色彩分辨能力丟失，出現(xiàn)晝盲癥；到了患病晚期，患者的周邊視野逐漸發(fā)生缺失，視力下降到20/200甚至更低[71-72]。然而對于視錐-視桿細胞營養(yǎng)不良患者而言，由于光感受器的無差別凋亡，在患病早期晝視野和夜視野均發(fā)生退化，并且在時間上沒有明顯的先后。視錐細胞營養(yǎng)不良和視錐-視桿細胞營養(yǎng)不良主要的發(fā)病原因均是基因突變，目前已經(jīng)鑒定出32個相關(guān)基因，大部分突變基因是二者所共有的[73]，主要有視蛋白基因(OPN1MW)[74]、cGMP磷酸二酯酶基因(PDE6C、PDE6H)[75-76]、CNG通道亞基(CNGα/β)[77]等。視錐細胞營養(yǎng)不良和視錐-視桿細胞營養(yǎng)不良在發(fā)病早期常被誤診為視網(wǎng)膜色素變性，與視網(wǎng)膜色素變性不同的是患者并沒有夜盲癥和視野收縮等典型癥狀[78]。二者在發(fā)病機制上也有很大差別：視網(wǎng)膜色素變性主要是視桿細胞基因突變率先引起視桿細胞凋亡，患者先出現(xiàn)夜盲癥，而后才會影響到視錐細胞；而COD/CORD主要是視錐細胞基因突變，先出現(xiàn)晝視野和色彩的丟失，而后才會影響到外周的視桿細胞。

2 視網(wǎng)膜退行性疾病相關(guān)治療

2.1 藥物和神經(jīng)保護因子治療

藥物治療作為一種保守的輔助性治療方法，可以在一定程度上延緩疾病的進展和改善視力，但其治療效果仍然十分有限[79]。鑒于大多數(shù)造成視網(wǎng)膜退行性疾病的基因突變會導(dǎo)致視色素循環(huán)異常，因此通過口服藥物來代償內(nèi)源性視色素的功能成為了臨床藥物研發(fā)的熱點。臨床I期研究表明，RP患者在連續(xù)7天服用Zuretinol(9-順式-視黃醇乙酸酯)后，視野和視銳度均有了顯著性的恢復(fù)，且隨著長期服藥癥狀逐漸好轉(zhuǎn)，目前無明顯副作用的報道[79-81]。Zuretinol和內(nèi)源性視蛋白形成的異視紫紅質(zhì)可介導(dǎo)視網(wǎng)膜的光響應(yīng)[82]，該藥物已成為美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)和歐洲藥品管理局(EMA)的指定藥品，并且同時獲得了FDA的快速通道認定，與之相關(guān)的臨床研究仍在進行中[83]?；谕瑯拥脑?，另外一款藥物Dunaliella(富含9-順式-β-胡蘿卜素)也在29個視網(wǎng)膜色素變性病人身上完成了Ⅰ期臨床研究，患者口服Dunaliella膠囊90天后視錐和視桿細胞的功能均獲得了不同程度的恢復(fù)。該藥基本沒有副作用，因此已經(jīng)獲得了FDA的臨床批準[84-85]。該藥物將在青少年視網(wǎng)膜色素變性患者身上做進一步臨床試驗(表2)。目前已有三種廣泛使用的玻璃體內(nèi)抗VEGF藥物被證明能有效預(yù)防濕性年齡相關(guān)的黃斑變性，分別是蘭尼單抗、貝伐單抗和阿柏西普[86-87]，主要是通過抑制VEGF的功能來抑制血管增生。糖尿病視網(wǎng)膜病變的病理特征與濕性年齡相關(guān)的黃斑變性極為相似，因此上述抗VEGF藥物也在臨床上被推薦用于糖尿病視網(wǎng)膜病變患者[88]。同時，糖尿病視網(wǎng)膜病變作為糖尿病的并發(fā)癥，其治療的另一個主要途徑是對基礎(chǔ)性疾病的治療，比如調(diào)控患者的糖代謝等[89]。針對黃斑營養(yǎng)不良患者的大部分藥物目前都處于臨床或臨床前研究階段，主要包括Isotretinoin(臨床前)、VM200(臨床前)、ALK-001(Ⅱ期)、Emixustat(Ⅲ期)、Zimura(Ⅱ期)等[4,83]，其中ALK-001備受期待。ALK-001作為維生素A的補充劑，在臨床Ⅱ期試驗中展現(xiàn)了良好的視網(wǎng)膜保護效果[90](表2)。

表2 藥物治療視網(wǎng)膜退行性疾病在臨床上的最新應(yīng)用

由于視網(wǎng)膜退行性疾病的多樣性和異質(zhì)性，目前的藥物都只能在一定的范圍內(nèi)延緩病程。作為藥物治療的補充，臨床上也開發(fā)出一系列神經(jīng)保護制劑[79]，其中備受關(guān)注的兩個神經(jīng)營養(yǎng)因子分別是睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(ciliary neurotrophic factor, CNTF)和來自于視桿細胞的視錐細胞活性因子(rod-derived cone viability,RDCV)[4,91]。CNTF在盲小鼠模型[92]和特發(fā)性黃斑毛細血管擴張2型病人的臨床試驗[93]中均被觀察到具有保護作用，而在早期或晚期視網(wǎng)膜色素變性病人的臨床試驗中卻并沒有顯著改善患者的視力[94]。RDCV是由視桿細胞產(chǎn)生并作用于視錐細胞的硫氧還蛋白樣分子。視錐-視桿細胞營養(yǎng)不良模型小鼠在通過病毒攜帶的方式表達了RDCV之后，小鼠的視錐細胞的凋亡比率出現(xiàn)了顯著降低，同時小鼠的明視野也在一定程度上得到了恢復(fù)[95]。除此之外，?；侨パ跄懰?TUDCA)[96]、維生素A[97]、二十二碳六烯酸(DHA)[98]以及葉黃素補充劑[99]在臨床前研究中被證明分別通過抗凋亡和抗氧化的方式發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

2.2 基因替代療法

基因治療作為新興治療方法在最近幾十年里取得了迅猛發(fā)展，其原理是通過載體將目標基因(DNA或RNA)遞送到靶細胞中[100]，以達到基因過表達或者敲除突變基因的目的[101]。腺相關(guān)病毒(AAV)因其轉(zhuǎn)染效率高、毒性小、可以在宿主細胞中持續(xù)表達等優(yōu)點而被廣泛應(yīng)用為基因治療的載體[102-103]。第一例成功的基因治療臨床試驗開始于2007年，通過將攜帶有RPE65基因序列的AAV2病毒注射到萊伯先天性黑內(nèi)障患者的視網(wǎng)膜下，該基因的表達產(chǎn)物在視網(wǎng)膜色素上皮細胞中催化視黃醛轉(zhuǎn)變?yōu)橐朁S醇，患者在接受治療6個月之后，微視野檢查(microperimetry)和暗適應(yīng)視野檢查(dark-adapted perimetry)的視功能顯著改善[14,104]。作為基于該基因開發(fā)的藥物，Luxturna也成為了第一個被FDA批準用于臨床研究的基因產(chǎn)品[105]?；蛑委熾S后也被用于X染色體連鎖遺傳性疾病的治療(CHM[106]、RPGR[107])以及年齡相關(guān)的黃斑變性的治療中。針對年齡相關(guān)黃斑變性患者的臨床治療大部分由于副作用明顯而被迫中止(比如AdGVPEDF.11D[108]、AAV2.sFLT01[109])，還有一些正處于臨床研究階段(比如AAV8-RGX-314[110]、AAV2-CD59[111])(表3)。通過去除腺相關(guān)病毒上的Rap和Cap基因而改造的重組腺相關(guān)病毒(rAAV)首先在年齡相關(guān)的黃斑變性患者中開展臨床研究，一項針對38個濕性年齡相關(guān)的黃斑變性的隨機臨床Ⅱ期研究表明，患者在接受攜帶有sFLT-1基因(其表達產(chǎn)物是VEGF的內(nèi)源性抑制因子)的rAAV治療之后，術(shù)后最佳矯正視力(BCVA)恢復(fù)到1.0，但針對該基因療法的進一步研究結(jié)果目前尚未公布[112]。

表3 基因替代療法在臨床上的最新應(yīng)用

由于腺相關(guān)病毒只能搭載小于4.7 kb的核酸片段[113]，為了滿足大片段的外源基因插入，研究者將6.8 kb的ABCA4基因包裝進馬傳染性貧血病毒(EIAV)驅(qū)動的慢病毒載體，注射入ABCA4敲除的黃斑營養(yǎng)不良模型幼鼠的視網(wǎng)膜下，病毒表達12個月后小鼠視網(wǎng)膜視黃酰乙醇胺沉積顯著性減少，視覺明顯改善[114]。該病毒也在2011年被批準開展I/Ⅱ期臨床試驗(NCT01367444)(表2)，但由于潛在的副作用(患者眼壓升高)而在2019年被迫終止。除了病毒載體介導(dǎo)的基因治療，目前也有一些非病毒載體，比如納米顆粒、脂質(zhì)體和裸DNA等被用于細胞傳遞[115]。與病毒相比它們的轉(zhuǎn)染效率較低，但是可以滿足較大片段的外源性基因的遞送?；蛑委煹牧硪粋€主要問題是技術(shù)操作難度。目前大多數(shù)采用視網(wǎng)膜下注射(subretinal injection)，該方法需要在中央凹形成一種短暫的異源性神經(jīng)感覺視網(wǎng)膜脫離，而大多數(shù)患者視網(wǎng)膜細胞殘留較少且厚度變薄，因此這種方式往往容易導(dǎo)致視網(wǎng)膜脫離或出現(xiàn)黃斑裂孔[116-117]。為此，玻璃體腔注射成為了備選的手術(shù)方案，并在X染色體連鎖突變的Rs1h-/-小鼠[118]和萊伯先天性黑內(nèi)障小鼠模型(rd12小鼠)[119]基因治療上均觀察到視覺恢復(fù)效果。

隨著技術(shù)的革新和發(fā)展，基因治療的形式逐漸多樣化，出現(xiàn)了CRISPR/Cas9基因編輯、反義寡核苷酸治療(AON)和光遺傳治療等新的基因治療形式。CRISPR/Cas9基因編輯是通過引入一種核酸酶，在宿主細胞基因組突變位點產(chǎn)生斷裂缺口，然后以正常的核苷酸鏈作為模板進行內(nèi)源性DNA修復(fù)。該技術(shù)操作簡單，可以特異性和永久性地修復(fù)基因，因而被廣泛應(yīng)用于視網(wǎng)膜色素變性、年齡相關(guān)的黃斑變性和糖尿病視網(wǎng)膜病變等多種類型視網(wǎng)膜退行性疾病的治療。目前唯一進入臨床I/Ⅱ期的基因編輯產(chǎn)品是EDIT-101，臨床前試驗以AAV5為載體在萊伯先天性黑內(nèi)障小鼠和非人靈長類進行視網(wǎng)膜下注射，結(jié)果表明EDIT-101能夠特異性地定位和修復(fù)模型動物CEP290基因座上發(fā)生的突變[120]。反義寡核苷酸治療是指將外源DNA或RNA鏈以裸鏈或者腺相關(guān)病毒載體的方式進行視網(wǎng)膜下注射的治療，主要功能是抑制突變基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA，從而阻止異常蛋白的翻譯[121]。目前臨床上有兩項反義寡核苷酸治療產(chǎn)品正在進行臨床I/Ⅱ期志愿者招募，其中QR-1123、QR-421a分別被用于治療RHOP23H和USH2A基因突變的視網(wǎng)膜色素變性患者。傳統(tǒng)的基因治療技術(shù)很大程度上依賴于殘存的視網(wǎng)膜細胞，而光遺傳學(xué)技術(shù)則突破了這一限制，通過使用病毒將編碼光敏感蛋白的基因插入到功能丟失的光感受器細胞[122]、雙極細胞[123]或者神經(jīng)節(jié)細胞[124]，光敏蛋白在接受光刺激后可興奮或者抑制細胞，進而誘發(fā)下游的級聯(lián)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[125]。第一個用于臨床治療的光遺傳產(chǎn)品RST-001于2016年開始臨床I/Ⅱ期試驗，2021年的I期報告顯示患者術(shù)后視力存在感染和其他副作用[126]。另外一種針對視網(wǎng)膜色素變性病人的光遺傳治療藥物GS030-DP于2017年啟動臨床研究，醫(yī)生將攜帶有激活型光遺傳基因的病毒載體注射入患者玻璃體腔，通過外部穿戴眼罩GS030-MD接受外界視覺刺激并產(chǎn)生激發(fā)光，患者的視神經(jīng)節(jié)細胞被激活從而產(chǎn)生光感。目前已報道的一個RP患者在接受手術(shù)后18周就產(chǎn)生了部分光感，大規(guī)模的臨床試驗正在進行之中[127-128]。光遺傳治療雖然存在一定的優(yōu)勢，但由于光敏感蛋白激活需要的光強較大，如何提高細胞的光敏感性成為了當前急需解決的問題[129]。此外，治療效果很大程度上還取決于病人視網(wǎng)膜的狀態(tài)、術(shù)后恢復(fù)和兼容性等。

2.3 干細胞療法和細胞再生

由于視網(wǎng)膜的細胞數(shù)目少且具有免疫豁免的特點，特別是對于視網(wǎng)膜退行性疾病晚期的患者而言，由于視網(wǎng)膜細胞殘存較少，干細胞移植成為修復(fù)和補充凋亡細胞的理想途徑[4]。具有增殖和多潛能的干細胞在來源上主要可分為兩類：一類是外源性視網(wǎng)膜干細胞，包括間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cell, MSC)、人源胚胎干細胞(human embryonic stem cells, hESC)和誘導(dǎo)多能干細胞(induced pluripotent stem cells, iPSC)[6]；另一類是內(nèi)源性視網(wǎng)膜干細胞，例如睫狀上皮來源的干細胞和色素上皮來源的干細胞[130-132](圖1)。

圖1 干細胞治療視網(wǎng)膜退行性疾病的途徑和機制

色素上皮細胞作為光感受器細胞的支撐結(jié)構(gòu)，沒有復(fù)雜的突觸連接結(jié)構(gòu)，在細胞移植后結(jié)構(gòu)較容易恢復(fù)[91]。此外，無論是體內(nèi)的色素上皮細胞還是干細胞分化來源的色素上皮細胞都具有免疫抑制和免疫原性雙重特性，這一特性能夠降低移植色素上皮細胞的免疫排斥風(fēng)險[133]。體外分化的色素上皮細胞可以以細胞懸液或者細胞層的方式進行移植，臨床經(jīng)驗表明細胞層移植的方式后續(xù)細胞存活率更大[133]。Schwartz等[134]在2011年率先開展了人源胚胎干細胞來源的色素上皮細胞臨床I/Ⅱ期研究(NCT01345006和NCT01344993)，18名年齡相關(guān)的黃斑變性或黃斑營養(yǎng)不良受試者在接受了人源胚胎干細胞來源的色素上皮細胞移植12個月后，其中13名患者視網(wǎng)膜下色素沉積無顯著性減少，但有10個患者術(shù)后最佳矯正視力評分有一定程度的提升，且未發(fā)生明顯的副作用。最新的針對年齡相關(guān)的黃斑變性患者臨床I/Ⅱ期研究表明，患者在接受了治療后，視網(wǎng)膜萎縮明顯緩解，而且長期的隨訪發(fā)現(xiàn)移植的色素上皮細胞可以長期存在并逐漸形成色素上皮細胞層[135]。盡管人源胚胎干細胞來源的色素上皮細胞在臨床上取得了不錯的效果，但是患者需要長期進行免疫治療，因此研究者將目光轉(zhuǎn)移到誘導(dǎo)多能干細胞來源的色素上皮細胞上。一項針對年齡相關(guān)的黃斑變性病人的臨床研究發(fā)現(xiàn)，患者在接受了來自自體的誘導(dǎo)多能干細胞來源的色素上皮細胞治療1年后，視力雖無顯著性的改善，但是針對該病人的4年隨訪研究表明，接受治療之后患者的病程出現(xiàn)了減緩[136-137]。國內(nèi)以第三軍醫(yī)大學(xué)附屬西南醫(yī)院牽頭也開展了外源RPE治療視網(wǎng)膜退行性疾病的臨床I期研究。早期黃斑營養(yǎng)不良患者在接受了胚胎來源的色素上皮細胞視網(wǎng)膜下注射后，在5年隨訪中患者視力趨于穩(wěn)定，無明顯的副作用，且部分患者有好轉(zhuǎn)的趨勢，證明了干細胞移植治療視網(wǎng)膜退行性疾病的安全性[138]。相比而言，間充質(zhì)干細胞因來源和擴增方便、免疫排斥風(fēng)險更低而備受青睞。間充質(zhì)干細胞通過不斷產(chǎn)生多種生長因子(NGF、HGF、VEGF)作用于色素上皮細胞或者光感受器，可通過替補凋亡的光感受器和分泌免疫調(diào)節(jié)因子(IL-6、TGF-β)抑制炎癥反應(yīng)等方式發(fā)揮治療效果[139]。目前有大量的相關(guān)研究正在開展臨床試驗，比如：將骨髓間充質(zhì)干細胞(BM-MSCs)用于視網(wǎng)膜色素變性患者的治療(I期)[139]；將臍帶血間充質(zhì)干細胞(UC-MSCs)用于恢復(fù)視網(wǎng)膜色素變性病人的光感(Ⅲ期)[140-141](表4)；在使用骨髓間充質(zhì)干細胞治療非增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變患者3～6個月后，患者的術(shù)后最佳矯正視力得到了顯著性恢復(fù)[142]。由于色素上皮細胞缺乏光敏感性，一旦光感受器凋亡，即使采用干細胞來源的色素上皮細胞治療也無法逆轉(zhuǎn)患者失明的進程，但可通過光感受器細胞移植來補充凋亡的光感受器。例如，研究者在獲得了處于增殖高峰的胚胎期的視桿細胞懸液后，將視桿細胞移植到盲小鼠的視網(wǎng)膜外段，成功地在盲小鼠上再生了一層光感受器[143]，并且能夠顯著恢復(fù)盲小鼠的視覺功能[144]，但是相關(guān)方法尚未有臨床應(yīng)用。對于晚期的視網(wǎng)膜退行性患者而言，光感受器和雙極細胞均嚴重缺失，此時進行視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞移植或者嘗試采用體外培養(yǎng)的3D視網(wǎng)膜類器官在不久的未來或?qū)榛颊邘砀Ｒ鬧145-146]。

表4 干細胞治療視網(wǎng)膜退行性疾病的臨床研究最新進展

雖然干細胞治療具有明顯的優(yōu)勢，但潛在的風(fēng)險也不能被忽視。Jeffrey等[147]在2017年報道了三例年齡相關(guān)的黃斑變性女性患者在接受脂肪細胞來源的干細胞治療后產(chǎn)生嚴重的副作用，患者的視力在術(shù)后1年降低到20/200直至完全失明，并伴隨著高眼壓等癥狀。此外，臨床上有部分患者接受干細胞治療后出現(xiàn)嚴重的炎癥反應(yīng)、視網(wǎng)膜脫落以及其他并發(fā)癥[148-149]。與此同時，例如干細胞在移植后如何整合到新的視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)中等一系列問題仍然有待解決。這表明，干細胞治療雖然有很大的應(yīng)用前景，但還有很長的路要走。在最近幾十年里，干細胞治療臨床申請便多達69個。盡管如此，目前只有兩個進入臨床Ⅲ期研究，且還沒有一項基于干細胞移植的產(chǎn)品被批準用于患者治療[150-151]。

2.4 視覺假體

人類致力于視覺修復(fù)的努力從未止步，視覺修復(fù)的方法也層出不窮。視網(wǎng)膜假體移植是其中一種方法[15,91]，其原理是將視覺信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘栔苯哟碳ひ暰W(wǎng)膜內(nèi)層細胞，從而幫助失明患者恢復(fù)光感。目前關(guān)于視覺假體和人工視覺的研究和開發(fā)主要集中在視網(wǎng)膜假體和皮質(zhì)假體，而視網(wǎng)膜假體根據(jù)植入位置的不同主要分為視網(wǎng)膜外假體、視網(wǎng)膜下假體和脈絡(luò)膜假體[152]。視網(wǎng)膜外假體繞過視網(wǎng)膜的內(nèi)核層與神經(jīng)節(jié)細胞貼合，直接刺激神經(jīng)節(jié)細胞以引起視覺響應(yīng)[153-154]。這類視覺假體只要在神經(jīng)節(jié)細胞存活的視網(wǎng)膜中即可使用，植入手術(shù)也相對容易。視網(wǎng)膜下假體位于視網(wǎng)膜與色素上皮之間，主要通過激活殘存的視網(wǎng)膜內(nèi)層細胞引起神經(jīng)節(jié)細胞響應(yīng)[155]。此類假體利用殘存的視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)將信號放大，故而僅需要較低的刺激強度，但是植入手術(shù)較為復(fù)雜[156]。脈絡(luò)膜假體位于脈絡(luò)膜和鞏膜之間，植入方法的侵入性較小，手術(shù)風(fēng)險較小[157]，但是因為刺激電極與視網(wǎng)膜神經(jīng)元之間的距離較大，所以需要較大的電流才能引起視覺感知。另外，脈絡(luò)膜上放置假體有較大的電流擴散風(fēng)險，造成了空間分辨率的下降[158]。

通過電刺激恢復(fù)視覺的臨床應(yīng)用最早可以追溯到1775年，Charles Le Roy等采用電流刺激視皮層恢復(fù)了視覺損傷患者的部分視感[156]，而間隔兩個半世紀后，第一款可以用于視網(wǎng)膜色素變性患者臨床治療的視覺假體ArgusⅡ才被FDA批準(2013年)，也是目前全球使用最廣泛的視網(wǎng)膜外植入假體[159]。ArgusⅡ由植入眼部的設(shè)備和佩戴于體外的設(shè)備兩部分組成，其中：植入眼部的設(shè)備主要包含有一個具有接收與發(fā)射信號功能的線圈和一個與之相連并植入到視網(wǎng)膜黃斑表面的電極微陣列，電極微陣列由60個直徑為200 μm的電極通道組成；體外設(shè)備則主要由攝像機、發(fā)射器和視頻處理器組成。使用時攝像機拍攝的視頻先由視頻處理器加工為電信號，再由發(fā)射器無線傳輸至植入體內(nèi)的接收線圈，然后由線圈經(jīng)絲狀線纜傳至電極微陣列，并刺激視網(wǎng)膜細胞，從而在視覺系統(tǒng)中成像[154]。第一批30個視網(wǎng)膜色素變性患者在美國和歐洲接受了視網(wǎng)膜外植入ArgusⅡ手術(shù)，患者在植入后1年和3年的平均視敏度為2.5 logMar，在這兩個時間點的最佳視敏度為1.9 logMar(20/1 588)[154,160]。連續(xù)5年的隨訪也表明，患者在識字符、整理內(nèi)務(wù)、行走避障等行為上均有所進步，生活質(zhì)量顯著提升。然而，其中有12位患者(40%)發(fā)生了嚴重不良事件，主要癥狀為結(jié)膜糜爛[160]。目前Second Sight醫(yī)療公司已不再進行新版本ArgusⅡ的商業(yè)發(fā)布。

Alpha IMS是唯一一個獲得CE認證的視網(wǎng)膜下植入物，由德國蒂賓根大學(xué)眼科中心的Eberhart Zrenner團隊研發(fā)。Alpha IMS由一個3 mm2的芯片和外部電源及各種組件組成，其中芯片在視網(wǎng)膜下植入，而外部電源和感應(yīng)線圈相連置于眼外[161]。Alpha IMS的I期臨床試驗于2010年開始，部分患者植入Alpha IMS后可以識別少數(shù)字母，檢測運動和不同形狀的物品[162]。第二代Alpha AMS芯片上的光電二極管提高到了1 600個，使用壽命也有了很大的提高，并在2016年獲得CE認證，其安全性和有效性在15名視網(wǎng)膜色素變性患者身上進行了驗證[163]。另外一款用于視網(wǎng)膜下植入的視覺假體是PRIMA，在年齡相關(guān)的黃斑變性患者身上進行了臨床試驗，該電極包含378個直徑100 μm的近紅外光電器件，不需要外部供電[164]。其他的視網(wǎng)膜下植入假體還包括IMI、IRIS以及EPI-RET3[165]等(表5)，但是都處于臨床試驗階段。用于脈絡(luò)膜上植入的視覺假體主要包括BVA和STS。前者是由澳大利亞仿生視覺研究聯(lián)盟團隊研發(fā)的，植入眼內(nèi)的設(shè)備包含33根刺激電極。該產(chǎn)品在2012年啟動的視網(wǎng)膜色素變性病人臨床試驗中展示了較高的穩(wěn)定性和安全性，患者Landolt-C視敏度能達到20/4 451[157,166]。BVA團隊目前正在開發(fā)下一代44通道完全可植入設(shè)備，并在開展臨床前的研究[167]。STS是由日本的Fujikado等研發(fā)的，該電極陣列由49根直徑500 μm的電極組成[168]，目前已經(jīng)完成3個視網(wǎng)膜色素變性病人的臨床研究，患者在手術(shù)后視覺功能得到顯著性改善，并能夠完成一些簡單的視覺引導(dǎo)行為[169-170]。

表5 臨床治療視網(wǎng)膜退行性疾病的視覺假體研究

對于視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)完全丟失的患者，研究者嘗試直接在枕葉的視皮層給予患者電刺激。研究者將視皮層假體UEA植入完全致盲的患者視皮層下，該電極陣列由96個1.5 mm長的電極排列在10×10的柵格內(nèi)，單根電極的刺激閾值為66.8±36.5 μA。最新研究報告顯示，采用多根電極同步刺激，可以誘發(fā)患者的光感，接受刺激后患者也能識別一些簡單的字母和物體輪廓[171]。另外一款基于多點序列刺激原理的視皮層假體VCP也在病人身上進行臨床評估，按照一定的頻率和序列進行刺激，患者能夠報道部分刺激所對應(yīng)的視覺信息[172]。就刺激模式而言，除了上面提到的電刺激，還包括光遺傳學(xué)、光驅(qū)動外源性材料、超聲波和磁場等方式，但大多處于臨床前階段?？偠灾?，視覺假體在某些方面展現(xiàn)出了較為滿意的視覺恢復(fù)效果，但同樣存在一些問題。比如電極的密度、幾何形狀、通道布局和電極陣列的返回配置的限制導(dǎo)致視覺假體的空間分辨率較差。其他方面包括刺激脈沖類型和參數(shù)、電流擴展、通道間干擾、手術(shù)植入位置等也顯著影響其分辨率[173-174]。

3 總結(jié)和展望

目前全球有超過1 400萬人因視網(wǎng)膜退行性疾病而失明，已經(jīng)發(fā)展成為亟待解決的公共衛(wèi)生問題[175]。在老齡化問題日益嚴重的當下，幫助視網(wǎng)膜患者重獲光明不僅能夠提高患者的生活質(zhì)量，也為社會和國家釋放了一部分醫(yī)療壓力，是全社會共同的期望和美好愿景。視網(wǎng)膜退行性疾病多數(shù)由遺傳調(diào)控，少數(shù)還受到環(huán)境因素的影響。由于其發(fā)病機制的復(fù)雜性和基因突變的異質(zhì)性，目前針對神經(jīng)退行性疾病并沒有有效的治療方法。但是在最近幾十年里，大量的治療方法和技術(shù)為廣大患者帶來了福音。藥物治療在一定程度上能夠緩解疾病進程，但是無法逆轉(zhuǎn)視網(wǎng)膜功能退化的進程；基因替代療法對于特異性基因突變的早期視網(wǎng)膜退行性疾病患者有較明顯的治療效果，但對于光感受器殘存較少的晚期視網(wǎng)膜退行性疾病患者治療效果不佳；細胞治療雖然可以用于晚期視網(wǎng)膜退行性疾病的治療，但臨床上的副作用較大，目前還沒有相關(guān)產(chǎn)品被批準用于臨床治療。相比而言，視覺假體是目前視覺恢復(fù)領(lǐng)域治療效果較為理想的途徑之一，患者在植入假體后最佳視力可以達到20/546，但是仍然無法幫助患者獲取精細的視覺信息[162]。

總而言之，目前視網(wǎng)膜退行性疾病的治療方法各有利弊，還需要不斷的探索和發(fā)展。隨著科學(xué)技術(shù)的進步和視網(wǎng)膜退行性疾病發(fā)病機制研究的不斷深入，相信不斷會有新興療法可以克服挑戰(zhàn)，甚至可能出現(xiàn)幾種治療手段的相互結(jié)合、相互輔助，有望幫助患者恢復(fù)視覺。