白璐，趙威，凌勇根，吉雅琪，張鵬，龔云，楊秀偉，張英帥*，陸才洋

1.株洲千金藥業(yè)股份有限公司，湖南 株洲 412007；

2.中南林業(yè)科技大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410004；

3.北京大學(xué) 藥學(xué)院 天然藥物及仿生藥物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100191；

4.湖南省藥品審評(píng)認(rèn)證與不良反應(yīng)監(jiān)測(cè)中心，湖南 長(zhǎng)沙 410013

婦科斷紅飲膠囊由赤芍、益母草、三七、仙鶴草、地榆炭和蒲黃炭6 味中藥組成，具有涼血、化瘀和止血的作用，用于功能失調(diào)性子宮出血，表現(xiàn)為月經(jīng)過(guò)多、經(jīng)期延長(zhǎng)，中醫(yī)診斷為“漏證”，辨證屬血熱者。婦科斷紅飲膠囊為株洲千金藥業(yè)股份有限公司獨(dú)家品種，是國(guó)家中藥保護(hù)品種。婦科斷紅飲膠囊原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)對(duì)赤芍、益母草、三七、仙鶴草4 味中藥進(jìn)行了薄層色譜鑒別，對(duì)赤芍進(jìn)行了芍藥苷的含量控制，但缺乏對(duì)地榆炭和蒲黃炭2 味中藥的有效質(zhì)量控制方法。傳統(tǒng)炮制認(rèn)為“炒炭存性”，是指藥物經(jīng)過(guò)炒炭后具有吸附、收斂的作用，止血作用增強(qiáng)。但因?yàn)榕谥乒に囉绊懸蛩剡^(guò)多，炭類藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)均較為簡(jiǎn)單，僅為性狀顯微鑒別等，成方制劑中定性鑒別較少。本研究首次建立了地榆炭、蒲黃炭的薄層色譜鑒別方法和特征圖譜測(cè)定方法，以期完善婦科斷紅飲膠囊質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，為臨床用藥安全提供保障。

1 材料

1.1 儀器

ATS 4 型薄層色譜全自動(dòng)點(diǎn)樣儀、ADC 2 型薄層色譜全自動(dòng)展開儀、Visualizer 2 型薄層色譜數(shù)碼成像系統(tǒng)（瑞士CAMAG公司）；1260型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent 公司）；LCMS-9030 型高分辨QTOF 液質(zhì)聯(lián)用儀（日本島津公司）；TG-WS 型臺(tái)式高速離心機(jī)（湖南湘立科學(xué)儀器有限公司）；PL203型電子天平［梅特勒托利多科技（中國(guó)）有限公司］。

1.2 試藥

地榆對(duì)照藥材（批號(hào)：121286-201703）、對(duì)照品異鼠李素-3-O-新橙皮苷（批號(hào)：111571-201806，純度：93.0%）和沒(méi)食子酸（批號(hào)：110831-201906，純度：91.5%）均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；對(duì)照品苯甲酰芍藥苷（批號(hào)：B02402011030，純度：98%）、1,2,3,4,6-O-五沒(méi)食子酰葡萄糖（批號(hào)：W03202004001，純度：98%）、丁香酸（批號(hào)：D01911804026，純度：98%）均購(gòu)于成都瑞芬思生物科技有限公司；婦科斷紅飲膠囊（批號(hào)分別為20200701、20200702、20200703、20200704、20200705、20200706、20200805、20200806、20200906、20201105、20201202、20210101、20210102、20210201、20210301、20210302）為株洲千金藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)；硅膠G 板（青島海洋化工有限公司，批號(hào)分別為20180612、20 190708；青島海浪硅膠干燥劑有限公司，批號(hào)：20 190402；Merck 公司，批號(hào)：HX03290984）；聚酰胺薄膜（浙江省臺(tái)州市路橋四甲生活塑料廠，批號(hào)分別為20181106、20 210312；武漢市偉琪博星生物科技有限公司，批號(hào)：20 201120；上海一基實(shí)業(yè)有限公司，批號(hào)：20201025）；乙腈（色譜純，美國(guó)Tedia公司）；水為純化水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1地榆炭供試品溶液的制備 取婦科斷紅飲膠囊內(nèi)容物1 g，加水25 mL，超聲處理30 min，濾過(guò)，濾液加水飽和的正丁醇提取3次，每次20 mL，合并正丁醇液，加氨試液40 mL 洗滌，棄去洗液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL 使溶解，作為供試品溶液。按樣品處方配比，按婦科斷紅飲膠囊制備工藝、供試品溶液制備方法制備地榆炭陰性樣品溶液。

2.1.2地榆對(duì)照藥材溶液的制備 取地榆對(duì)照藥材0.5 g，按2.1.1項(xiàng)下方法制備，得對(duì)照藥材溶液。

2.1.3地榆薄層色譜不同薄層色譜板考察 選擇不同廠家生產(chǎn)的薄層色譜板，按薄層色譜法［《中華人民共和國(guó)藥典》（以下簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典》）2020年版（四部）通則0502］試驗(yàn)，吸取以上供試品溶液、陰性樣品溶液各5 μL，吸取對(duì)照藥材溶液2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層色譜板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（20.0∶4.0∶0.5）為展開劑展開，取出，晾干，置紫外燈365 nm 下檢視。結(jié)果顯示，供試品色譜中，不同廠家生產(chǎn)的薄層色譜板在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性樣品無(wú)干擾，薄層色譜行為基本一致（圖1）。

圖1 地榆炭不同的薄層色譜板鑒別

2.1.4地榆炭薄層色譜不同展開溫度 考察了在4、20、30 ℃下展開對(duì)婦科斷紅飲膠囊薄層色譜行為的影響。結(jié)果顯示，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性樣品沒(méi)有干擾，表明該方法在4～30 ℃薄層色譜行為基本一致，對(duì)溫度的耐用性良好（圖2）。

圖2 地榆炭不同的展開溫度鑒別

2.1.5 地榆炭薄層色譜不同展開濕度 考察了相對(duì)濕度分別為33%、50%、70%條件下展開對(duì)婦科斷紅飲膠囊薄層色譜行為的影響。結(jié)果顯示，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性樣品無(wú)干擾，表明方法在相對(duì)濕度為33%～70%薄層色譜行為基本一致，對(duì)濕度的耐用性良好（圖3）。

圖3 地榆炭不同的展開相對(duì)濕度鑒別

2.1.6地榆炭樣品檢測(cè) 對(duì)16 批婦科斷紅飲膠囊（含1 批缺地榆炭陰性樣品）進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，16 批婦科斷紅飲膠囊供試品色譜中，除1 批缺地榆炭陰性樣品，其他15 批樣品在與對(duì)照色譜相應(yīng)的位置上均顯相同顏色的斑點(diǎn)（圖4）。

圖4 地榆炭樣品檢測(cè)

2.1.7蒲黃炭供試品溶液的制備 取婦科斷紅飲膠囊內(nèi)容物3 g，加乙醚20 mL 加熱回流20 min，傾去乙醚液，藥渣揮干，加80%乙醇50 mL，冷浸24 h，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)铀?5 mL使溶解，濾過(guò)，用乙酸乙酯提取2次，每次20 mL，棄去乙酸乙酯液，水液用水飽和的正丁醇振搖提取2次，每次25 mL，合并正丁醇液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，通過(guò)以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的小柱，再加甲醇10 mL洗脫，合并甲醇液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。按樣品處方配比，稱取不含蒲黃炭的其他藥材，按婦科斷紅飲膠囊制備工藝、供試品溶液制備方法制備蒲黃炭陰性對(duì)照溶液。

2.1.8蒲黃炭對(duì)照品溶液的制備 精密稱取異鼠李素-3-O-新橙皮苷對(duì)照品適量，加甲醇制成0.1 mg·mL-1的對(duì)照品溶液。

2.1.9蒲黃炭薄層色譜不同薄層色譜板考察 選擇不同廠家生產(chǎn)的薄層色譜板，按薄層色譜法［《中國(guó)藥典》2020年版（四部）通則］試驗(yàn)，吸取供試品溶液、陰性樣品溶液、對(duì)照品溶液各1 μL，分別點(diǎn)于同一聚酰胺薄膜上，以丙酮-水（2∶3）為展開劑展開，取出，晾干，噴以5%三氯化鋁乙醇溶液，晾干，置紫外燈365 nm 下檢視。結(jié)果顯示，供試品色譜中，不同廠家生產(chǎn)的薄層色譜板在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性樣品無(wú)干擾，薄層色譜行為基本一致（圖5）。

圖5 蒲黃炭不同的薄層色譜板鑒別

2.1.10 蒲黃炭薄層色譜不同展開溫度 考察了在4、20、30 ℃不同的溫度下展開對(duì)婦科斷紅飲膠囊薄層色譜行為的影響。結(jié)果顯示，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性樣品無(wú)干擾，表明方法在4～30 ℃薄層色譜行為基本一致，對(duì)溫度的耐用性良好（圖6）。

圖6 蒲黃炭不同的展開溫度鑒別

2.1.11 蒲黃炭薄層色譜不同展開濕度 考察了相對(duì)濕度分別為33%、50%、70%條件下展開對(duì)婦科斷紅飲膠囊薄層色譜行為的影響。結(jié)果顯示，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)。陰性樣品無(wú)干擾，表明方法在相對(duì)濕度為33%～70% 薄層色譜行為基本一致，對(duì)濕度的耐用性良好（圖7）。

圖7 蒲黃炭不同的展開相對(duì)濕度鑒別

2.1.12 蒲黃炭樣品檢測(cè) 對(duì)16 批婦科斷紅飲膠囊（含1 批缺蒲黃炭陰性樣品）進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，16 批婦科斷紅飲膠囊供試品色譜中，除1 批缺蒲黃炭陰性樣品，其他15 批樣品在與對(duì)照色譜相應(yīng)的位置上均顯相同顏色的斑點(diǎn)（圖8）。

圖8 蒲黃炭樣品檢測(cè)

2.2 特征圖譜的建立

2.2.1供試品溶液的制備 取本品粉末（批號(hào)：20200704）約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加水25 mL，超聲處理（300 W，40 kHz）10 min，放冷，搖勻，在10000 r·min-1離心2 min（離心半徑為9 cm），精密量取上清液15 mL，用乙醚萃取2次，每次15 mL，分液，合并乙醚層，揮干，殘?jiān)眠m量75%乙醇溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加75%乙醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2對(duì)照品溶液的制備 取1,2,3,4,6-O-五沒(méi)食子酰葡萄糖對(duì)照品適量，精密稱定，加75%乙醇制成1,2,3,4,6-O-五沒(méi)食子酰葡萄糖質(zhì)量濃度為0.5 mg·mL-1的溶液，即得。

2.2.3色譜條件 Shimadzu Shim-pack GISS色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm），流動(dòng)相為乙腈（A）-0.2%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～17 min，14%A；17～47 min，14%～30%A；47～55 min，30%～40%A；55～60 min，40%～14%A）；體積流量為1.0 mL·min-1；柱溫為35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm；進(jìn)樣量為5 μL。

2.2.4精密度試驗(yàn) 取婦科斷紅飲膠囊樣品（批號(hào)：20200704），按2.2.1 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2.3項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。以1,2,3,4,6-O-五沒(méi)食子酰葡萄糖為參照峰，計(jì)算色譜圖中特征峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果表明，共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD 為0～0.32%，共有峰的相對(duì)峰面積RSD 為0～3.62%，表明儀器精密度良好。

2.2.5重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批婦科斷紅飲膠囊樣品（批號(hào)：20200704），按2.2.1 項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份，按照2.2.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。以1,2,3,4,6-O-五沒(méi)食子酰葡萄糖為參照峰，計(jì)算色譜圖中共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果表明，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD 為0～0.32%，各共有峰的相對(duì)峰面積RSD＜3.4%，表明方法重復(fù)性良好。

2.2.6穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12 h 按2.2.3 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。以1,2,3,4,6-O-五沒(méi)食子酰葡萄糖為參照峰，計(jì)算色譜圖中共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果表明，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.07%～0.32%，各共有峰的相對(duì)峰面積RSD＜3.5%，表明樣品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.7多批次樣品特征圖譜測(cè)定 取15 批婦科斷紅飲膠囊樣品，按2.2.1 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2.3 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖（圖9）。將15 批婦科斷紅飲膠囊特征圖譜依次導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”（2012 版）軟件，設(shè)定S1 為參照?qǐng)D譜，采用平均數(shù)法，時(shí)間窗寬度為0.1，進(jìn)行多點(diǎn)校正和色譜峰匹配，生成對(duì)照?qǐng)D譜，并進(jìn)行相似度計(jì)算，結(jié)果見表1。

表1 15批婦科斷紅飲膠囊特征圖譜相似度

圖9 15批婦科斷紅飲膠囊HPLC特征圖譜

以1,2,3,4,6-O-五沒(méi)食子酰葡萄糖（峰9）為參照物峰，其余各特征峰的保留時(shí)間與參照峰的比值定義為其余各峰的相對(duì)保留時(shí)間。按以上方法計(jì)算15 批婦科斷紅飲膠囊的11 個(gè)特征峰的相對(duì)保留時(shí)間，見表2。

表2 15批婦科斷紅飲膠囊特征圖譜相對(duì)保留時(shí)間

結(jié)果顯示，15 批婦科斷紅飲膠囊的特征圖譜相似度為0.964～0.999，婦科斷紅飲膠囊的特征圖譜中，以1,2,3,4,6-O-五沒(méi)食子酰葡萄糖參照峰相應(yīng)的峰為S 峰，其相對(duì)保留時(shí)間RSD＜0.3%。根據(jù)15 批樣品特征峰的相對(duì)保留時(shí)間的平均值，確定各峰的相對(duì)保留時(shí)間規(guī)定值分別為0.126（峰1）、0.148（峰2）、0.241（峰3）、0.316（峰4）、0.327（峰5）、0.455（峰6）、0.526（峰7）、0.740（峰8）、1.220（峰10）、1.588（峰11）。

2.2.8色譜峰的歸屬 通過(guò)比對(duì)供試品溶液色譜峰和陰性樣品溶液色譜峰對(duì)特征圖譜的色譜峰進(jìn)行歸屬。

供試品溶液的制備：按2.2.1 項(xiàng)下方法制備供試品溶液。

陰性樣品溶液的制備：按處方配比，取除三七外的其他藥材，按工藝制備制成缺三七的陰性樣品。同法制備缺其他5味藥材的陰性樣品。按2.2.1項(xiàng)下方法制成6個(gè)陰性樣品溶液。

取供試品溶液和6個(gè)陰性樣品溶液按2.2.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，結(jié)果見圖10。

圖10 婦科斷紅飲膠囊供試品及陰性樣品色譜圖

結(jié)果顯示，缺地榆炭陰性樣品色譜圖無(wú)特征峰2 和7，故特征峰2 和7 可歸屬于地榆炭；缺蒲黃炭陰性樣品色譜圖無(wú)峰5，故特征峰5 可歸屬于蒲黃炭；缺益母草陰性樣品色譜圖無(wú)特征峰4，故特征峰4可歸屬于益母草；缺赤芍色譜圖無(wú)特征峰3、6、8、9、10和11，故此6個(gè)特征峰可歸屬于赤芍。

2.2.9對(duì)照品溶液的制備：取1,2,3,4,6-O-五沒(méi)食子酰葡萄糖對(duì)照品適量，精密稱定，加75%乙醇制成質(zhì)量濃度為0.5 mg·mL-1的溶液；取丁香酸對(duì)照品適量，精密稱定，加乙醇制成質(zhì)量濃度為0.6 mg·mL-1的溶液；取沒(méi)食子酸乙酯和苯甲酰芍藥苷對(duì)照品適量，精密稱定，分別加甲醇制成質(zhì)量濃度分別約為65 μg·mL-1、0.5 mg·mL-1的溶液；取沒(méi)食子酸對(duì)照品適量，精密稱定，加水制成質(zhì)量濃度約為1.0 mg·mL-1的溶液。

供試品溶液制備和色譜條件（除采用DAD 外）同2.2.1、2.2.3項(xiàng)下方法。

色譜峰的指認(rèn)及參照峰的確定 通過(guò)查閱文獻(xiàn)了解相關(guān)藥味的主要化學(xué)成分及關(guān)鍵質(zhì)量屬性。采用島津LCMS-9030型高分辨Q-TOF液質(zhì)聯(lián)用儀，對(duì)婦科斷紅飲膠囊進(jìn)行定性分析，結(jié)果見表3。采用二極管陣列檢測(cè)器（DAD）在200～400 nm 對(duì)相關(guān)化合物對(duì)照溶液和供試品溶液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，得到各化合物和供試品吸收峰的紫外吸收?qǐng)D，通過(guò)比對(duì)化合物和供試品溶液出峰的保留時(shí)間和紫外吸收?qǐng)D，對(duì)特征圖譜的主要特征峰進(jìn)行識(shí)別，部分化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖11。

圖11 婦科斷紅飲膠囊特征圖譜中6個(gè)化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)

表3 婦科斷紅飲膠囊質(zhì)譜分析結(jié)果

結(jié)果顯示，通過(guò)比對(duì)一級(jí)質(zhì)譜和二級(jí)離子質(zhì)譜信息，對(duì)特定的6個(gè)色譜峰的主要成分進(jìn)行了分子式預(yù)測(cè)，結(jié)合其元素組成等相關(guān)信息，推測(cè)得到的中藥活性成分中6個(gè)未知物質(zhì)的結(jié)構(gòu)式分別為沒(méi)食子酸、丁香酸、沒(méi)食子酸乙酯、3,4-二羥基-5-甲氧基-苯甲酸甲酯、1,2,3,4,6-O-五沒(méi)食子酰葡萄糖和苯甲酰芍藥苷。

通過(guò)對(duì)化合物和供試品溶液的保留時(shí)間和紫外吸收光譜圖比較，化合物沒(méi)食子酸、丁香酸、沒(méi)食子酸乙酯、3,4-二羥基-5-甲氧基-苯甲酸甲酯、1,2,3,4,6-O-五沒(méi)食子酰葡萄糖和苯甲酰芍藥苷的保留時(shí)間和紫外吸收光譜圖分別與供試品色譜中的峰1（4.15 min）、峰4（10.4 min）、峰6（15.0 min）、峰7（17.4 min）、峰9（33.0 min）和峰11（52.7 min）一致，故峰1、4、6、7、9和11分別指認(rèn)為化合物沒(méi)食子酸、丁香酸、沒(méi)食子酸乙酯、3,4-二羥基-5-甲氧基-苯甲酸甲酯、1,2,3,4,6-O-五沒(méi)食子酰葡萄糖和苯甲酰芍藥苷。

鑒于1,2,3,4,6-O-五沒(méi)食子酰葡萄糖的色譜峰保留時(shí)間居中、分離較好、響應(yīng)值較高，故選擇1,2,3,4,6-O-五沒(méi)食子酰葡萄糖（峰9）作為對(duì)照品參照峰，標(biāo)記為峰S，同時(shí)將1,2,3,4,6-O-五沒(méi)食子酰葡萄糖對(duì)照品作為參照物，結(jié)果見圖12。

圖12 婦科斷紅飲膠囊對(duì)照特征圖譜

3 討論

3.1 薄層色譜鑒別

婦科斷紅飲膠囊處方中地榆炭、蒲黃炭為地榆、蒲黃炮制后的飲片，因炮制工藝受溫度、時(shí)間、加熱方式等因素影響，導(dǎo)致炭藥物質(zhì)基礎(chǔ)的不確定性，制約了其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的統(tǒng)一[1-2]。本方法開發(fā)過(guò)程中選用地榆炭中的鞣質(zhì)類、蒲黃炭中的黃酮類成分為定性指標(biāo)，作為2 味藥材中的主要藥效成分在文獻(xiàn)中均有報(bào)告[3-7]，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果地榆炭選用對(duì)照藥材，蒲黃炭選用對(duì)照品作為定性參照物。方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果顯示，在不同廠家薄層色譜板、4～30 ℃、33%～70%相對(duì)濕度條件下，耐用性良好。

地榆炭鑒別曾考慮采用地榆中鞣質(zhì)類代表性成分沒(méi)食子酸作為對(duì)照，后因陰性存在干擾而放棄[8-9]。展開劑嘗試了二相、三相和四相展開系統(tǒng)，并篩選了多種展開劑，結(jié)果以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（20.0∶4.0∶0.5）為展開劑，365 nm 下檢視斑點(diǎn)，指標(biāo)成分斑點(diǎn)清晰且分離效果佳。

蒲黃炭鑒別嘗試以蒲黃對(duì)照藥材、異鼠李素、香蒲新苷為對(duì)照建立方法[10]，但因含量過(guò)低或斑點(diǎn)被掩蓋等原因均未能成功，最后參照《中國(guó)藥典》2020 年版對(duì)“障眼明片”的樣品處理方法，增加萃取步驟除雜，并參照蒲黃藥材的展開條件[8]進(jìn)行了展開劑和顯色劑的優(yōu)化，以丙酮-水（2∶3）為展開劑，5%三氯化鋁乙醇溶液為顯色劑，365 nm下檢視熒光斑點(diǎn)，分離效果好，指標(biāo)性成分斑點(diǎn)清晰、無(wú)干擾。

3.2 特征圖譜測(cè)定

3.2.1供試品的制備 婦科斷紅飲膠囊由赤芍、益母草、三七、仙鶴草、地榆炭和蒲黃炭6 味中藥組成，其中赤芍、仙鶴草、地榆炭和蒲黃炭都含有較高的鞣質(zhì)類成分[11-16]，鞣質(zhì)在水和醇中有較好的溶解性，但是鞣質(zhì)結(jié)構(gòu)復(fù)雜、穩(wěn)定性差、分離難度大[17-19]，造成供試品制備難度較大。供試品在存放和檢測(cè)過(guò)程中都容易析出沉淀，造成色譜中的柱壓升高或堵塞。在供試品制備過(guò)程中嘗試采用75%乙醇作為提取溶劑，以明膠和殼聚糖作為沉淀劑進(jìn)行沉淀，再離心除雜。雖然色譜中堵塞問(wèn)題有所改善，但色譜雜質(zhì)峰較多，目標(biāo)峰分離效果不理想。嘗試采用先以水為提取溶劑，再分別考察以乙酸乙酯、正丁醇和乙醚3 種溶劑作為萃取溶劑，進(jìn)行萃取，并取有機(jī)層蒸干或揮干，殘?jiān)眠m量75%乙醇溶解，轉(zhuǎn)移定容至5 mL 量瓶中，作為供試品溶液。結(jié)果顯示，采用乙醚作為萃取溶劑，供試品色譜圖特征峰受雜峰干擾少，峰形和分離效果最好，而且在不引入沉淀劑外源雜質(zhì)的情況下徹底解決了色譜柱堵塞問(wèn)題，故最終確定了以水為提取溶劑，以乙醚為萃取劑的供試品制備方法。

3.2.2檢測(cè)波長(zhǎng)的確定 采用DAD 在200～400 nm進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，得到各吸收峰的紫外吸收?qǐng)D，結(jié)果表明，在203 nm 左右各吸收峰都有較高的吸收，信息量較大，故選擇203 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2.3系統(tǒng)適用性考察 比較了乙腈-水、乙腈-0.2%磷酸水溶液和乙腈-0.2%乙酸水溶液3 個(gè)流動(dòng)相系統(tǒng)梯度洗脫情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用乙腈-0.2%磷酸水溶液流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫時(shí)色譜峰分離度最好，峰形較好，雜質(zhì)干擾小。

分別采用Shimadzu Shim-pack GISS、Inertsil ODS-3 和SHIMSEN Ankylo C18-AQ 3種填料色譜柱，對(duì)供試品進(jìn)樣分析，考察不同填料色譜柱對(duì)分離效果的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，出峰時(shí)間和特征峰分離效果都有較大差異。色譜柱Shimadzu Shim-pack GISS 能獲得最好的分離效果，故選擇其為最優(yōu)色譜柱條件。

3.3 含量測(cè)定研究

婦科斷紅飲膠囊原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)對(duì)方中君藥赤芍中的芍藥苷進(jìn)行了含量控制，本研究針對(duì)方中君藥益母草和貴細(xì)藥材三七展開含量測(cè)定研究。

《中國(guó)藥典》2020 年版收載的益母草含量檢測(cè)指標(biāo)為鹽酸水蘇堿和鹽酸益母草堿，控制限度分別為含鹽酸水蘇堿不得少于0.4%，含鹽酸益母草堿不得少于0.040%。選取5 批益母草采用《中國(guó)藥典》2020 年版方法進(jìn)行含量檢測(cè)，鹽酸水蘇堿的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.6%，鹽酸益母草堿的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.062%。鹽酸益母草堿因含量太低而不適合作為成藥的含量測(cè)定指標(biāo)，故本研究主要對(duì)成藥中的鹽酸水蘇堿含量展開研究。采用高效液相色譜、DAD，檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)置為192 nm，Venusil HILIC色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）以丙基酰胺鍵合硅膠為填充劑；分別考察了乙腈-0.2%磷酸水、乙腈-0.2%乙酸水和乙腈-0.4%乙酸水3個(gè)流動(dòng)相系統(tǒng)梯度洗脫，通過(guò)流動(dòng)相配比及流速調(diào)整，無(wú)法使供試品中鹽酸水蘇堿與雜質(zhì)達(dá)到完全分離，鹽酸水蘇堿含量測(cè)定方法建立失敗。

《中國(guó)藥典》2020 年版三七的含量指標(biāo)為三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1。本研究針對(duì)三七的研究也圍繞以上3 個(gè)指標(biāo)成分展開。篩選了70%乙醇、乙酸乙酯、水飽和的正丁醇作為提取溶劑，超聲提取，制備供試品，最終確定采用水飽和正丁醇提取效果最好。采用Shimadzu Shim-pack GISS 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、DAD，檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm，以乙腈（A）-0.2%磷酸水溶液（B）為流動(dòng)相，梯度洗脫（0～10 min，15%A；10～40 min，15%～30%A；40～50 min，30%～40%A；50～60 min，40%～15%A）；流速為1.0 mL·min-1；柱溫為35 ℃；進(jìn)樣量為5 μL。檢測(cè)結(jié)果顯示，三七皂苷R1未檢出，人參皂苷Rb1和人參皂苷Rg1與相鄰峰分離良好，但信號(hào)響應(yīng)太低（可能的原因是三七的處方量太少造成成品含量低，且紫外檢測(cè)3 個(gè)皂苷均為末端吸收，信號(hào)響應(yīng)本身較低）不適合作為含量測(cè)定指標(biāo)，故未增補(bǔ)至質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)正文中。

4 結(jié)論

婦科斷紅飲膠囊由赤芍、益母草、三七、仙鶴草、地榆炭和蒲黃炭6 味中藥組成，本研究建立了地榆炭和蒲黃炭2 味中藥的薄層色譜鑒別方法，并建立了婦科斷紅飲膠囊的特征圖譜，確定了11 個(gè)特征峰，歸屬于赤芍、益母草、地榆炭和蒲黃炭4 味中藥，并對(duì)其中的6 個(gè)色譜峰進(jìn)行了指認(rèn)，分別為沒(méi)食子酸、丁香酸、沒(méi)食子酸乙酯、3,4-二羥基-5-甲氧基-苯甲酸甲酯、1,2,3,4,6-O-五沒(méi)食子酰葡萄糖和苯甲酰芍藥苷。所建方法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、重復(fù)性好，完善后的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)實(shí)現(xiàn)了6 味藥的全處方質(zhì)量控制，全面提升了婦科斷紅飲膠囊的質(zhì)量控制水平。