張琪 ，鄧曄 ，邵宗澤，王萬鵬*

( 1.山東大學(xué) 海洋研究院，山東 青島 266237；2.自然資源部第三海洋研究所 海洋生物遺傳資源重點實驗室，福建 廈門361005；3.中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心，北京 100085)

1 引言

潮間帶位于海陸交界處，大潮高潮最高潮線和大潮低潮最低潮線之間，是典型的近海生態(tài)系統(tǒng)。來自于海洋和陸地的各類營養(yǎng)物質(zhì)，很容易在潮間帶地區(qū)匯集并累積，使得潮間帶相比其他環(huán)境有更高的初級生產(chǎn)力和更豐富的微生物資源。潮間帶作為海陸交界處易受到來自于海洋的石油污染，海洋石油烴污染的來源主要包括人類活動（如海上運輸、廢水排入、地表徑流、海上油氣田的開發(fā)等）、自然滲漏（海底的石油滲漏等）以及大氣沉降[1-2]，在潮間帶地區(qū)，微生物能夠有效地分解來自陸地和海洋積聚在此的有機(jī)物[3]。好氧條件下石油烴降解菌的研究開展較早且較深入，而厭氧條件下的相關(guān)研究包括微生物的種類、功能基因和降解機(jī)制等都處于初始階段[4-8]。

20世紀(jì)末，科學(xué)家們陸續(xù)從烴污染的土壤、沉積物（淡水和海洋）和油藏等缺氧的生境中分離獲得了降解石油烴的單菌和菌群[9-11]。在厭氧條件下，微生物無法利用氧氣作為末端電子受體獲取ATP，但可以利用硝酸鹽[12]、硫酸鹽[13]、三價鐵[14]以及高價錳[15]等作為末端電子受體進(jìn)行呼吸作用氧化多環(huán)芳烴（Polycyclic Aromatic Hydrocarbons，PAHs）等有機(jī)物，還有研究發(fā)現(xiàn)，在產(chǎn)甲烷條件下存在多環(huán)芳烴的降解現(xiàn)象[16-18]。硫是地球上最豐富的元素之一，它主要以黃鐵礦（FeS2）或石膏（CaSO4）的形式存在于巖石和沉積物中，在海水中以硫酸鹽的形式存在。硫酸鹽在自然環(huán)境特別是在許多厭氧生境中含量豐富并顯著地影響著環(huán)境中的微生物活動[19]。在缺氧環(huán)境中，硫酸鹽還原菌（Sulfate-Reducing Bacteria，SRB）可以利用硫酸鹽作為電子受體氧化烷烴、多環(huán)芳烴等有機(jī)污染物[20-22]，因此研究硫酸鹽還原條件下海洋沉積物中厭氧石油烴類的降解對碳硫等元素的循環(huán)也至關(guān)重要。為探究近海潮間帶地區(qū)沉積物中參與厭氧烴降解過程的細(xì)菌類群，本研究以青島女島灣潮間帶沉積物深層樣品為研究對象，給予混合烴為碳源及硫酸鹽作為電子受體進(jìn)行厭氧富集培養(yǎng)，分析厭氧石油烴降解菌的多樣性并分離單菌進(jìn)行功能驗證，以期獲得高效的石油烴降解菌。

2 材料與方法

2.1 實驗材料

樣品采集于青島女島灣潮間帶（36.22°N，120.51°E）表層0.5 m以下的沉積物，共6管。泥樣呈黑褐色，稍有刺鼻氣味，有黏性。采集的樣品置于無菌的50 mL離心管，低溫運輸，4℃保存?zhèn)溆?，并另? g置于離心管中放入?20℃冰箱內(nèi)進(jìn)行冷凍，用于提取原位樣本的環(huán)境DNA。

2.2 厭氧富集培養(yǎng)

2.2.1 培養(yǎng)基

基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基（MSM）：NH4Cl 0.33 g/L、KCl 0.5 g/L、CaCl20.5 g/L、MgSO4·7H2O 3.0 g/L、NaCl 22.0 g/L、Na2SO43.0 g/L、PIPEs buffer（哌嗪-1，4-二乙磺酸）5.0 g/L，加入1 mL的刃天青溶液（1.0 g/L）作為氧氣指示劑，pH 調(diào)至 6.8±0.2。

Medium 63 培養(yǎng)基：K2HPO40.5 g/L、NH4Cl 1.0 g/L、Na2SO41.0 g/L、CaCl2·2H2O 0.1 g/L、MgSO4·7H2O 2.0 g/L、FeSO4·7H2O 0.5 g/L，加入 1 mL 的刃天青溶液（1.0 g/L）作為氧氣指示劑，pH調(diào)至6.8±0.2。

混合烴溶液：萘、菲、芘各0.01 g分別溶于1 mL十二烷和1 mL十六烷中，制成混合烴類碳源，過濾除菌。

將基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基分裝到規(guī)格為150 mL的厭氧血清瓶中，每瓶70 mL，用丁基橡膠塞蓋緊，并用鋁蓋壓緊封口。121℃高溫滅菌20 min后，加入過濾除菌的微量元素溶液、維生素溶液、磷酸鹽緩沖溶液和混合烴溶液（體積比為0.5%）。利用高純度氮氣抽換氣的方式將厭氧瓶里的空氣去除，頂空氣體充入氮氣，除氧效果以溶液澄清無色為準(zhǔn)。若培養(yǎng)基進(jìn)氧顏色變粉，需及時補(bǔ)加適量半胱氨酸鹽酸鹽溶液。

2.2.2 以硫酸鹽為電子受體的厭氧富集

取5 g原位樣品用滅菌后的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基重懸，使用無菌注射器將重懸樣品注射到準(zhǔn)備好的厭氧血清瓶中，用作厭氧富集的培養(yǎng)基去除，作為氮源，作為末端電子受體，頂空氣體為N2。每日搖勻兩次并進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)氧氣指示劑有變色現(xiàn)象時，及時補(bǔ)加半胱氨酸鹽酸鹽溶液去除培養(yǎng)基內(nèi)殘余氧氣。靜置于32℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每隔1個月進(jìn)行一次轉(zhuǎn)接。在后期培養(yǎng)中，適量補(bǔ)加硫酸亞鐵溶液，目的是將還原為后與形成FeS黑色沉淀，以此作為生長表征。

2.3 原位和富集樣本的高通量測序及分析

樣本DNA在提取前首先要保證菌量足夠，電子顯微鏡觀察菌群具有一定的活性，在不斷傳代的過程中發(fā)現(xiàn)新轉(zhuǎn)移的培養(yǎng)基內(nèi)24 h就可以生成硫化亞鐵沉淀。本實驗中，提取DNA的樣本分別為6個原位沉積物樣本（QD_1Y，QD_2Y，······，QD_6Y）及其富集傳代培養(yǎng) 8 個月的 6 個樣本（QD_1F，QD_2F，······，QD_6F）。

采用德國QIAGEN公司的環(huán)境基因組提取試劑盒（QIAGEN，Düsseldorf，Germany）提取樣品總 DNA，在1%濃度的瓊脂糖凝膠電泳下顯示明亮 DNA 條帶，并通過 Nanodrop 2000 超微量分光光度計檢測DNA質(zhì)量，提取的DNA送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行測序分析。采用細(xì)菌引物338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和 806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）對16S 基因序列的V3?V4區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增子測序，測序數(shù)據(jù)經(jīng)拼接、質(zhì)控、去接頭之后獲得優(yōu)化序列。按照97%的相似性閾值將序列聚類為不同的操作分類單元（Operational Taxonomic Unit, OTU）分析，并在各分類水平分析每個樣品的群落組成以及多樣性指數(shù)。

2.4 脫硫弧菌的分離及烴降解率的測定

2.4.1 厭氧平板分離

在基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中加入1.5%瓊脂制成固體培養(yǎng)基，加熱滅菌后待培養(yǎng)基冷卻至50℃以下，加入過濾好的混合烴混勻后迅速倒平板，抽取20 μL前期厭氧富集的培養(yǎng)物涂板，密封，將平板倒置于厭氧培養(yǎng)袋中，放入產(chǎn)氣包以吸收袋內(nèi)殘余氧氣，將其置于32℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。此操作在厭氧操作箱內(nèi)完成。1周左右培養(yǎng)皿中長出菌落，挑取單菌落進(jìn)行三區(qū)劃線獲得純培養(yǎng)菌株。

2.4.2 分離純菌的分子生物學(xué)鑒定

純菌DNA使用賽百盛細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行提取。利用細(xì)菌16S rRNA通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′） 和 1492R（5′-ACGGCTACCTTGTTACGACT-3′）對 16S rRNA 全長進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物送至廈門鉑瑞測序部進(jìn)行測序。將16S rRNA 基因序列拼接后上傳至EzBioCloud（https://eztaxon-e.ezbiocloud.net/）與數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行比對，確定與其最為相近的模式菌株[23]。

2.4.3 烷烴和芳烴的降解率測定

使用 Medium 63培養(yǎng)基測定單菌對烷烴和芳烴的降解率，分別加入二十四烷和菲作為碳源進(jìn)行培養(yǎng)。每種碳源在每個時間段設(shè)置3個平行，分別在0 d、15 d、30 d、45 d、60 d對培養(yǎng)基內(nèi)剩余未利用碳源進(jìn)行萃取。通過正己烷萃取收集培養(yǎng)液中的烴類，加入無水硫酸鈉進(jìn)行除水，再用正己烷稀釋適當(dāng)倍數(shù)。經(jīng)0.22 μm孔徑聚酰胺微孔濾膜過濾后，將其轉(zhuǎn)移至2 mL頂空瓶上機(jī)進(jìn)行GC-MS檢測，測定樣品中各類碳源的剩余量以計算降解率。

3 結(jié)果

3.1 原位樣本和厭氧富集菌群的細(xì)菌α多樣性

在樣本厭氧富集過程中加入混合烴作為碳源，硫酸鹽作為電子受體，每隔1個月進(jìn)行一次稀釋傳代培養(yǎng)。在經(jīng)過8個月的培養(yǎng)后，烴類降解實驗驗證發(fā)現(xiàn)富集物中有穩(wěn)定的烴降解菌群的存在。收集此時的菌群樣品作為富集樣本，進(jìn)行擴(kuò)增子測序。使用Uprase[24]對測序、拼接后獲得的序列進(jìn)行聚類，共獲得711 293條序列。

稀釋曲線表明隨著讀數(shù)的增加，原位和富集樣本的Richness指數(shù)上升幅度趨于平緩，該測序深度已經(jīng)能夠較為精確地反映樣品中的多樣性趨勢（圖1）。Ace指數(shù)和Chao1指數(shù)是估計群落中含有OTU數(shù)目的指數(shù)，相比于原位樣本，富集樣品的Ace指數(shù)和Chao1指數(shù)都有所下降，代表群落中物種數(shù)量下降，不能在厭氧條件下利用烴的細(xì)菌被逐漸淘汰。Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)是衡量群落物種多樣性的指數(shù)，也是物種豐富度和物種均勻度的綜合指標(biāo)。Shannon指數(shù)越大，說明群落多樣性越高。Simpson指數(shù)值越大，說明群落多樣性越低?？梢钥闯龈患瘶悠芳?xì)菌群落的多樣性在不斷降低，這表明細(xì)菌種類在減少，菌群趨于單一，不能適應(yīng)環(huán)境的細(xì)菌被逐漸淘汰，保留下來的可能是直接或間接參與厭氧硫酸鹽還原的烴降解菌（圖2）。

圖1 原位和富集樣本的細(xì)菌序列稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curves of bacterial sequences for in situ and enriched samples

圖2 原位和富集樣本的細(xì)菌Alpha多樣性Fig.2 Bacterial Alpha diversity for in situ and enriched samples

按照97%的相似性閾值將序列聚類為不同的OTUs，OTU通常被視為微生物分類學(xué)分析的物種單元，我們使用Sliva數(shù)據(jù)庫對每一個OTU的代表序列進(jìn)行了注釋，結(jié)果表明，原位6個樣品所獲得的細(xì)菌序列歸屬細(xì)菌域的55個門，124 個綱，267個目，364個科，564個屬和997個種。通過細(xì)菌物種組成分析，原位樣品中彎曲桿菌門（Campliobacterota）豐度最高，在6個樣品中相對豐度為8.2%～63.9%。此外，門水平上相對豐度大于1%的還包括變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidota）、脫硫桿菌門（Desulfobacterota）、綠 彎 菌門（Chloroflexi）、 厚 壁菌門（Firmicutes）和酸桿菌門（Acidobacteriota）。從屬水平來看，原位樣品中優(yōu)勢的種屬為硫單胞菌屬（Sulfurimonas）和硫菌屬（Sulfurovum），相對豐度均超過10%，其他相對豐度超過1%的優(yōu)勢菌屬還包括：黃桿菌屬（Lutibacter）、海桿菌屬（Marinobacter）、鹽水微菌屬（Salinimicrobium）、需鹽桿菌屬（Salegentibacter）、伍斯菌屬（Woeseia）和鹽單胞菌屬（Halomonas）（圖3）。

相較于原位樣本，加入混合石油烴為碳源的富集樣本中細(xì)菌的種類和數(shù)量都發(fā)生了較大的變化。6個富集樣本中所獲得的細(xì)菌序列歸屬于細(xì)菌域的31個門，56個綱，88個目，111個科，159個屬和239個種，遠(yuǎn)低于原位樣本中的細(xì)菌種類。在門水平上，最優(yōu)勢菌群由彎曲桿菌門轉(zhuǎn)變?yōu)槊摿驐U菌門，其相對豐度達(dá)到30%以上，擬桿菌門 在富集樣本中的豐度也提高到10%以上。科水平上的優(yōu)勢菌為脫硫疊球菌科（Desulfosarcinaceae），其相對豐度大于20%；海洋滑動菌科（Marinilabiliaceae）和脫硫桿菌科（Desulfobacteraceae）的相對豐度也高于5%（圖3）。其中，脫硫疊球菌科和脫硫桿菌科為典型的SRB，在厭氧條件下被證明是耦合硫酸鹽還原降解丁烷和十二烷的主要參與者[25]。海洋滑動菌科（Marinilabiliaceae）大部分為專性厭氧或兼性厭氧菌，目前關(guān)于其對石油烴的利用未見報道，但根據(jù)海洋滑動菌科中已報道的單菌推測此類群可以利用硫酸鹽或者亞硫酸鹽作為電子受體[26]，在厭氧環(huán)境中可能具有降解有機(jī)物的潛在能力，能夠直接降解烴或者利用烴降解過程的中間代謝物進(jìn)行傳代生長。

圖3 原位和富集樣本中不同分類水平的細(xì)菌群落組成柱形圖Fig.3 Barplots of bacterial community composition at different taxonomic levels in in situ and enriched samples

3.2 原位樣本和厭氧富集菌群的細(xì)菌β多樣性

β多樣性是度量不同樣本（組）間菌群組成的相似度大小、菌群組成與分布差異的參數(shù)。主坐標(biāo)分析 （Principal Co-ordinates Analysis, PCoA），是一種非約束性的數(shù)據(jù)降維分析方法，可用來研究樣本群落組成的相似性或差異性。我們采用基于Weighted UniFrac的PCoA方法分析樣本間的組成差異（圖4）。PCoA圖顯示原位樣本之間的距離大于富集樣本之間的距離，原位樣本彼此之間較為離散，而富集樣本之間更聚集，這說明原位樣本間的細(xì)菌組成存在較大差異性，而在富集樣本中差異性較小。且原位樣本與富集樣本在圖中分散兩側(cè)，說明經(jīng)過石油烴富集后的富集樣本與原位樣本之間的菌群組成已存在差別。

圖4 基于Weighted UniFrac的PCoA結(jié)果Fig.4 Results of PCoA based on Weighted UniFrac

采用“wilcoxon秩和檢驗”雙尾檢驗方法，基于樣本中群落豐度數(shù)據(jù)，比較原位和富集樣本細(xì)菌群落中表現(xiàn)出的豐度差異的物種，進(jìn)行假設(shè)性檢驗。由圖5可以看出，在95%的置信區(qū)間內(nèi)，門水平上的原位和富集樣本間菌群分布和豐度存在較大差異，其中脫硫桿菌門在富集樣本中的比例明顯上調(diào)，而彎曲桿菌門和變形菌門所占比例大幅下降，在原位和富集樣本間的相對豐度存在顯著差異（p＜0.05）。

圖5 原位和富集樣本組間群落豐度顯著性差異檢驗Fig.5 Test for significant differences in community abundance between in situ and enriched sample groups

3.3 菌株ND17的分離及系統(tǒng)發(fā)育分析

在進(jìn)行厭氧純菌分離時，觀察厭氧瓶內(nèi)有黑色的硫化亞鐵沉淀生成，打開厭氧瓶的橡膠塞時有硫化氫的氣味。這些都是典型的硫酸鹽還原菌的特征。

平板培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)部分菌落為黑色圓點，多生長在平板內(nèi)部，革蘭氏染色陰性，長度為2 μm 左右，長桿狀，有鞭毛，能夠自由活動。提取菌株DNA，將擴(kuò)增后的16S rRNA產(chǎn)物進(jìn)行測序。測序結(jié)果與Ezbio-Cloud網(wǎng)站上的序列比對，發(fā)現(xiàn)其與菌株脫硫弧菌Desulfovibrio subterraneusHN2T的16S rRNA基因序列的相似性為99.93%，平均核苷酸（ANI）值為98.46%。通過 MEGA-X軟件[27]采用鄰接法（Neighbor-joining）[28]構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，菌株ND17與Desulfovibrio subterraneusHN2T聚類在一起且形成穩(wěn)定的分支（圖6）。

圖6 菌株ND17基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.6 Phylogenetic analysis of strain ND17 based on 16S rRNA gene sequences

3.4 Desulfovibrio subterraneus ND17的烴降解率

為進(jìn)一步表征Desulfovibrio subterraneusND17對烴類的利用效果，長鏈烷烴以二十四烷為代表，多環(huán)芳烴以菲為代表，分別測定了ND17對兩者的降解速率。并且為了驗證厭氧烴降解和硫酸鹽還原之間的耦聯(lián)情況，在對照組內(nèi)加入20 mmol/L的鉬酸鈉，其他條件不變。鉬酸鈉是硫酸鹽還原菌的競爭性抑制劑，可以抑制電子傳遞給硫酸鈉，從而解除厭氧烴降解與硫酸根還原的耦合關(guān)系，可作為烴降解組的對照。沒有鉬酸鈉的實驗組電子傳遞過程可以進(jìn)行，烴降解正常進(jìn)行，硫酸根得到電子發(fā)生還原反應(yīng)。經(jīng)過測定，菌株ND17在兩個月內(nèi)對于菲的降解率可達(dá)到35.7%，對于二十四烷的降解率可達(dá)53.9%，而對照組碳源濃度則沒有明顯變化（圖7）。

圖7 菌株ND17對菲和二十四烷的降解速率的測定Fig.7 Determination of degradation rates of phenanthrene and eicosanoids by strain ND17

4 討論

微生物降解石油烴在海洋沉積物、石油污染海域、原油和廢水等生境中一直發(fā)揮著巨大的作用[4,29]。Lü等[30]曾測量了多種PAHs在國內(nèi)海岸線潮間帶沉積物樣品中的分布情況，結(jié)果表明，多環(huán)芳烴的疏水性使其很容易在潮間帶地區(qū)沉積，在沉積物中的總濃度可以達(dá)到2.3～1 031.7 ng/g（干重）。然而在潮間帶地區(qū)降解長鏈烷烴和三環(huán)以上（包括菲）PAHs厭氧菌的種類和群落結(jié)構(gòu)仍鮮有報道，對于在嚴(yán)格厭氧條件下烴降解菌的分離和培養(yǎng)仍是難題。Qian等[31]曾發(fā)現(xiàn)脫硫弧菌屬（Desulfovibrio）和石化菌屬（Petrimonas）可以協(xié)同降解菲，并未分離脫硫弧菌的單菌進(jìn)行研究。Zhang等[32]曾報道分離出一株可以利用硫酸鹽作為電子受體厭氧降解菲的硫還原地桿菌（Geobacter sulfurreducensstrain PheS2），是第一株分離到的可以耦合硫酸鹽還原降解菲的純菌株。由此可見，厭氧條件下對于高環(huán)芳烴降解菌的分離與培養(yǎng)仍然為熱點和難點。好氧菌在近海表層沉積物石油烴的降解中起主要作用，但深入表層以下沉積物中的石油烴必須經(jīng)過厭氧微生物的降解過程去除。

本次研究對青島女島灣潮間帶地區(qū)深層沉積物進(jìn)行厭氧富集，經(jīng)高通量測序后對原位和富集樣本的細(xì)菌多樣性進(jìn)行了分析。相比于原位樣本，富集樣本中細(xì)菌的種類和數(shù)量明顯減少，與原位樣本的群落組成有著較大的差異性，優(yōu)勢菌群也轉(zhuǎn)變?yōu)橐悦摿虔B球菌科和脫硫桿菌科為主的硫酸鹽還原菌，所占比例達(dá)35%。在此前研究中，Kleindienst等[25]通過高通量測序和同位素標(biāo)記實驗揭示了脫硫桿菌科中存在4個SRB的分支，在丁烷和十二烷的降解中發(fā)揮著主要作用。這也暗示SRB是一類重要的厭氧烴降解菌，其降解范圍廣泛。菌株ND17作為一種典型的SRB，表現(xiàn)出對于烷烴和多環(huán)芳烴的降解并耦合硫酸鹽還原的能力。在最開始的分離過程中，由于分離培養(yǎng)基的限制以及無法模擬原位條件和每種菌的適宜培養(yǎng)條件，分離鑒定出來的菌比較有限，主要包括變形菌門、厚壁菌門以及放線菌門的部分菌種。經(jīng)后續(xù)實驗驗證，發(fā)現(xiàn)菌株ND17對各種烴類的響應(yīng)時間明顯短于其他菌株，有較廣的石油烴降解范圍，并能利用Fe3+和AQDS作為電子受體降解長鏈烷烴。此外，脫硫弧菌科在原位樣本中的豐度達(dá)到5%，這也表明脫硫弧菌類群在復(fù)雜的潮間帶沉積物環(huán)境中，具有降解各類有機(jī)物適應(yīng)環(huán)境的潛力。

脫硫弧菌屬除了石油烴降解的能力，還在沉積物中木質(zhì)素、幾丁質(zhì)和纖維素的降解中發(fā)揮了重要作用。孫超等[33]在對漳州九龍江河口紅樹林沉積物中降解纖維素、幾丁質(zhì)和木質(zhì)素的厭氧細(xì)菌定向富集和平板分離純化的研究中發(fā)現(xiàn)，脫硫弧菌屬在降解木質(zhì)素的優(yōu)勢菌屬中占比為22.1%，在降解幾丁質(zhì)的優(yōu)勢菌屬中占比為9.6%；齊明明等[34]在對廈門觀音山潮間帶海水和沉積物環(huán)境利用以魚鱗、海帶葉片、蝦殼、幾丁質(zhì)和殼聚糖為有機(jī)底物進(jìn)行富集時發(fā)現(xiàn)，脫硫弧菌屬也占到了較高的比例，結(jié)合本文研究，可以推測脫硫弧菌屬在多種難降解有機(jī)物和石油烴類等污染物的利用中都發(fā)揮了較大的作用。