陳治 ，馬春來 ，葉樂 ，楊超杰 ，王海山 *

( 1.海南熱帶海洋學(xué)院 熱帶海洋生物資源利用與保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 三亞 572022；2.海南熱帶海洋學(xué)院 海南省熱帶海洋漁業(yè)資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 三亞 572022)

1 引言

近年來，環(huán)境 DNA（Environmental DNA，eDNA）metabarcoding技術(shù)開始廣泛應(yīng)用于漁業(yè)生態(tài)學(xué)領(lǐng)域，在物種多樣性調(diào)查、外來魚種監(jiān)測、瀕危魚類保護(hù)方面展現(xiàn)了極大的應(yīng)用價(jià)值和發(fā)展?jié)摿1-2]。其中，metabarcoding片段的選擇對(duì)該技術(shù)的有效使用至關(guān)重要[2-3]。經(jīng)過眾多研究者的不懈努力，目前已篩選出一些物種識(shí)別率較高、對(duì)應(yīng)引物擴(kuò)增能力較強(qiáng)的優(yōu)質(zhì)片段[3]。如Miya等[4]基于880種硬骨魚類線粒體12S序列設(shè)計(jì)的MiFish-U，擴(kuò)增片段長度控制在163～185 bp范圍內(nèi)，對(duì)沖繩水族館的魚類檢出數(shù)目高達(dá)230種；Vences等[5]針對(duì)線粒體16S設(shè)計(jì)的脊椎動(dòng)物Vert-16S，不僅擴(kuò)增片段長度更長（約260 bp），而且對(duì)魚類、兩棲類均具有較好的適用性—以德國境內(nèi)的兩條河流為驗(yàn)證水域時(shí)，物種檢出率高達(dá)82%～93%；Balasingham等[6]設(shè)計(jì)的PS1，將擴(kuò)增片段選定于線粒體COI基因上，在獲得較多魚類可操作分類單元（Operational Taxonomic Units，OTUs）的同時(shí)，可高效利用公共數(shù)據(jù)庫內(nèi)的參考序列進(jìn)行物種注釋。截至2020年，被報(bào)道的魚類eDNA metabarcoding片段已多達(dá)數(shù)十個(gè)，其中表現(xiàn)優(yōu)異的片段約10余個(gè)[3]。各片段的篩選背景不同，實(shí)際表現(xiàn)也各具特色，這為豐富魚類eDNA metabarcoding庫、推動(dòng)魚類多樣性研究奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

然而，迄今為止的魚類eDNA研究尚不健全，如何根據(jù)研究水域和目標(biāo)類群合理選擇metabarcoding片段仍處于探索階段[3]。其中，metabarcoding片段對(duì)近緣物種的適用性就是一個(gè)亟需解決的問題。物種識(shí)別率和引物通用性是選擇魚類eDNA metabarcoding片段的兩大核心指標(biāo)[3-4]。為了同時(shí)兼顧上述兩方面需求，主流的eDNA metabarcoding片段（AcMDB07、Ac12S、MiFish-U、Tele02等）主要位于線粒體核糖體（12S、16S）高變區(qū)[3]，雖然能基本滿足魚類多樣性調(diào)查需求，但卻存在著少數(shù)近緣魚類因條形碼片段變異速率較低而難以識(shí)別的風(fēng)險(xiǎn)?；谝延形锓N監(jiān)測結(jié)果可知，采用核糖體區(qū)片段進(jìn)行魚類eDNA調(diào)查可能會(huì)造成“物種丟失”。如MiFish-U對(duì)平鲉屬（Sebastes）、東方鲀屬（Takifugu）、蝴蝶魚屬（Chaetodon）[7]，Tele01對(duì)玉筋魚屬（Ammodytes）、杜父魚屬（Cottus）、雅羅魚屬（Leuciscus）[8]等類群的OTUs注釋結(jié)果均出現(xiàn)了此問題。表明“物種丟失”可能是一種比較常見的現(xiàn)象。然而，由于本底資料缺乏、物種數(shù)量不足等原因，已知的魚類eDNA調(diào)查只是簡單提及了此現(xiàn)象，未能充分揭露所用片段的近緣物種識(shí)別缺陷；不同片段間的近緣物種識(shí)別差異更缺乏相互比較。究竟哪些片段的“物種丟失”風(fēng)險(xiǎn)更低，更適合近緣魚類多樣性調(diào)查？目前尚不得而知。

隨著水體污染、過度捕撈、棲息地喪失等威脅的加劇，世界各地土著魚類的物種多樣性、遺傳多樣性正急劇下降[9-11]；而外來魚種卻因水產(chǎn)養(yǎng)殖、觀賞活動(dòng)釋放等原因大幅增加[11]。這就對(duì)當(dāng)前的魚類多樣性監(jiān)測提出了更高的要求。而全面、準(zhǔn)確的物種調(diào)查則是開展各類生物多樣性保護(hù)的基礎(chǔ)和前提[1-3]。在近緣魚類識(shí)別是魚類eDNA調(diào)查無法回避的大背景下，本研究將系統(tǒng)探究主流metabarcoding片段的“物種丟失”風(fēng)險(xiǎn)、比較不同片段的近緣物種識(shí)別差異，以期能夠從中篩選出物種識(shí)別率最高的片段，最終為完善魚類eDNA metabarcoding技術(shù)、提高魚類多樣性調(diào)查結(jié)果的準(zhǔn)確性提供一定技術(shù)支撐。

2 材料與方法

2.1 序列下載及篩選

自然水域難以出現(xiàn)近緣魚類大規(guī)模出現(xiàn)的情況，結(jié)果具有較大的偶然性。因此，本研究采用MitoFish公共數(shù)據(jù)庫內(nèi)的線粒體全序比較各片段的近緣物種識(shí)別差異。具體操作如下：登錄MitoFish數(shù)據(jù)庫（http://mitofish.aori.u-tokyo.ac.jp/download.html），下 載“All Mitogenomes”選項(xiàng)內(nèi)的3 081種魚類的線粒體全序fasta壓縮文件（截至2022年1月23日）；同步下載txt文檔，以方便核對(duì)序列來源、GenBank號(hào)、上傳者單位等信息。使用MegAlign軟件將下載的fasta文件轉(zhuǎn)換為seq文件?；贔ishbase數(shù)據(jù)庫（https://www.fishbase.de/）核對(duì)物種分類有效性。剔除雜交種、爭議種及含有簡并堿基的序列。為降低序列截齊的工作量，本研究僅將物種較多（5種及以上）的屬挑出用于后續(xù)分析。物種分類階元的確認(rèn)依據(jù)Fishbase數(shù)據(jù)庫及中國動(dòng)物主題數(shù)據(jù)庫（China Animal Scientific Database，http://www.zoology.csdb.cn/）。

2.2 metabarcoding片段選擇

查閱2008?2021年期間涉及魚類eDNA metabarcoding技術(shù)的有關(guān)研究，特別是參考Zhang等[3]的研究結(jié)果對(duì)其中表現(xiàn)較好的metabarcoding片段及對(duì)應(yīng)引物進(jìn)行匯總。以花鰻鱺（Anguilla marmorata）線粒體全序（序列號(hào)：NC006540）為參照，核對(duì)正、反向引物方向標(biāo)注是否正確。按所在位置對(duì)metabarcoding片段進(jìn)行編號(hào)、排序。

2.3 序列截齊

使用DNAstar軟件包中的Seqman程序，對(duì)挑選出的序列進(jìn)行截齊：（1）擴(kuò)增片段序列截齊后用于近緣魚類條形碼相似度分析；（2）正、反向引物序列截齊后用于引物變異度分析。

2.4 遺傳距離分析

采用PAUP 4.0軟件構(gòu)建最大簡約法（Maximum Parsimony，MP）系統(tǒng)發(fā)育樹，系統(tǒng)樹可信度均采用Bootstrap檢驗(yàn)，經(jīng)1 000次重復(fù)抽樣檢驗(yàn)得到分支樹節(jié)點(diǎn)支持率。物種的聚類情況即物種識(shí)別率[12]：若不同物種聚為一支（取遺傳距離等于0），認(rèn)為該物種識(shí)別失??；若不同物種聚為不同支（遺傳距離大于0），認(rèn)為該物種識(shí)別成功（由于不同metabarcoding片段的種間差異標(biāo)準(zhǔn)不同，難以給出準(zhǔn)確可靠的判定閾值，因此本研究只探究遺傳距離是否為0的情況）；同時(shí)，基于正、反向引物聯(lián)合序列計(jì)算總平均遺傳距離[7]，從而判斷引物的通用程度。

運(yùn)用SPSS25.0 軟件基于單因素方差分析（Oneway ANOVA）對(duì)不同引物的物種識(shí)別率等進(jìn)行差異顯著性分析。顯著差異閾值為p=0.05，試驗(yàn)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2.5 非度量多維尺度分析

使用非度量多維尺度（Non-Metric Multidimensional Scaling，NMDS）[13]方法對(duì)物種識(shí)別結(jié)果 [0,1]矩陣進(jìn)行排序分析，該分析在Canoco 5.0軟件中完成。選用Bray-Curtis距離，因?yàn)槠湓诖蠓秶托》秶淖鴺?biāo)軸上都具有穩(wěn)健性[12,14]。分析結(jié)果以脅強(qiáng)系數(shù)（stress）作為評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)：當(dāng)stress＜0.2時(shí)，認(rèn)為可以用NMDS的二維點(diǎn)圖表示，該圖形有一定的解釋意義；當(dāng)stress＜0.1時(shí)，認(rèn)為該排序是一個(gè)好的排序；而當(dāng)stress＜0.05時(shí)，則認(rèn)為該排序結(jié)果具有很好的代表性[15]。NMDS運(yùn)算的步驟如下：（1）將物種識(shí)別率處理為[0,1]矩陣，鑒定成功為1，鑒定失敗為0；以物種名為首行、metabarcoding片段名為首列儲(chǔ)存.xlsx格式的[0,1]矩陣；（2）打開Canoco 5.0軟件，加載.xlsx文檔，給定table name，選擇“import all species as factors”，其余選擇默認(rèn)參數(shù)，完成矩陣導(dǎo)入；（3）“analysis”選項(xiàng)下，選擇“Canoco Adviser”，調(diào)出 NMDS 分析程序；（4）“treatment of ties in distance”選擇“secondary”， “stress formula”選擇“type 1”，其余選擇默認(rèn)參數(shù)。

3 結(jié)果

3.1 用于分析的近緣魚類簡介

本研究用于分析的魚類共計(jì)2綱、20目、52科、106屬、935種。其中鯉形目（Cypriniformes）種類最多，共計(jì)3科、37屬、337種，鱸形目（Perciformes）次之，共計(jì) 18科、22屬、190種。扁鯊目（Squatiniformes）、脂鯉目（Characiformes）、胡瓜魚目（Osmeriformes）的數(shù)量最少，各只有1科、1屬、5種。物種名稱及對(duì)應(yīng)Genbank序列號(hào)見表S1、表S2。

3.2 引物簡介

經(jīng)文獻(xiàn)查閱及匯總，特別是參照Zhang等[3]對(duì)22個(gè)主流片段（引物）的全面比較結(jié)果，本研究用于分析的魚類eDNA metabarcoding片段共計(jì)15個(gè)。涵蓋線粒體12S、16S、COI 3個(gè)目標(biāo)基因。其中以12S為目標(biāo)基因的片段最多（8個(gè)），16S次之（6個(gè)），COI最少（僅1個(gè)）。各片段、對(duì)應(yīng)引物位置及信息見圖1及表1。

表1 本研究中15個(gè)魚類eDNA metabarcoding片段簡介Table 1 Summary of 15 fish eDNA metabarcoding fragments analyzed in this study

圖1 本研究中15個(gè)魚類eDNA metabarcoding片段和對(duì)應(yīng)引物在目標(biāo)基因上的位置Fig.1 Locations of the 15 fish eDNA metabarcoding fragments and primer pairs on the target mitochondrial genes

3.3 物種識(shí)別率及引物變異情況

不同片段的物種識(shí)別率存在極顯著差異（F=32.39，p=1.5×10?76），蛋白質(zhì)編碼基因（片段 15）的物種識(shí)別率最高，達(dá)到（82.76±24.66）%。核糖體基因中，片段03、片段05的表現(xiàn)最為優(yōu)異，識(shí)別率分別為（68.9±30.81）%和（71.62±27.3）%；片段 04、片段 08和片段11的識(shí)別率較低，平均值未超過42.92%；其余片段的物種識(shí)別率較為中等，平均值在54.58%～64.6%間（圖2，表2）。

基于15個(gè)片段對(duì)應(yīng)正、反向引物聯(lián)合序列構(gòu)建的MP系統(tǒng)發(fā)育樹總平均遺傳距離依次為1.52%、1.84%、4.58%、0.88%、0.97%、2.46%、5.78%、3.32%、9.32%、2.29%、6.21%、4.14%、1.71%、3.17%和15.70%（圖2）。表明蛋白質(zhì)編碼基因（片段15）的對(duì)應(yīng)引物通用性最差。片段09、片段11、片段07、片段03和片段12的引物變異程度也較高（總平均遺傳距離≥4.14%），實(shí)際使用過程中應(yīng)考慮其eDNA擴(kuò)增效率。

圖2 本研究中15個(gè)魚類eDNA metabarcoding片段的物種識(shí)別率及對(duì)應(yīng)引物序列總平均遺傳距離Fig.2 Fish species resolution rates of 15 eDNA metabarcoding fragments and overall mean distances of primer pairs in this study

不同類群的識(shí)別率也存在極顯著差異（F=14.40,p=7×10?157）：旗鳉屬（Aphyosemion）、舌鰨屬（Cynoglossus）、鏢鱸屬（Etheostoma）等屬內(nèi)近緣物種較容易區(qū)分，全部15個(gè)片段的平均識(shí)別率均在90%以上；而金槍魚屬（Thunnus） 、白鮭屬（Coregonus）等類群的目標(biāo)基因同源性較高，大部分片段對(duì)其識(shí)別能力較差（圖3，表2）。

圖3 本研究中106屬魚類的物種識(shí)別率Fig.3 Fish species resolution rates of 106 genera in this study

表2 metabarcoding片段對(duì)各類群的識(shí)別率Table 2 The species resolution rates of metabarcoding fragments for different groups

3.4 NMDS結(jié)果

根據(jù)935種魚類的識(shí)別結(jié)果對(duì)15個(gè)metabarcoding片段做NMDS排序，片段04、片段08和片段11明顯遠(yuǎn)離其余片段，說明此3個(gè)片段物種識(shí)別結(jié)果較為不同（圖4）。其余11個(gè)核糖體片段根據(jù)所在目標(biāo)基因聚類成A、B兩組，表明不同目標(biāo)基因影響物種識(shí)別。NMDS分析結(jié)果的脅強(qiáng)系數(shù)為0.13，說明將15個(gè)metabarcoding片段劃歸不同組具有一定的解釋意義。

4 討論

本研究用于分析的魚類數(shù)量龐大、階元眾多（見3.1節(jié)及表S1、表S2），涉及軟骨魚類及硬骨魚類、淡水魚類及海水魚類、定居性魚類及洄游性魚類等各類群。樣本量具有較好的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果能夠比較充分地反映15個(gè)主流eDNA metabarcoding片段的優(yōu)劣。本研究是目前國內(nèi)第一篇針對(duì)性探究魚類eDNA metabarcoding近緣物種適用性的報(bào)告。

4.1 COI片段的引物缺陷

片段15（PS1，COI）的物種識(shí)別率顯著高于剩余14個(gè)12S/16S片段，是唯一物種識(shí)別率超過80%的metabarcoding片段。這與Balasingham等[6]認(rèn)為的魚類線粒體蛋白質(zhì)編碼基因比核糖體基因能夠更有效避免北美五大湖內(nèi)部分入侵物種eDNA注釋結(jié)果假陰性的結(jié)論一致，也與經(jīng)典的DNA條形碼普遍采用線粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞基I基因的事實(shí)相符[24]。此外，COI基因在魚類eDNA metabarcoding參考數(shù)據(jù)庫的全面性方面也具有12S、16S基因難以比擬的優(yōu)勢[3]。然而，引物序列的高變性可能會(huì)阻礙片段15的廣泛應(yīng)用。本研究中該片段正、反向引物序列的總平均遺傳距離高達(dá)15.70%。中國團(tuán)扇鰩（Platyrhina sinen-sis）、細(xì)條銀口天竺鯛（Jaydia lineata）、土佐鰧（Uranoscopus tosae）、橫帶髭鯛（Hapalogenys analis）的 COI特異性引物、探針設(shè)計(jì)結(jié)果表明：當(dāng)總平均遺傳距離大于8.21%～9.65%時(shí)，高純度DNA模板會(huì)出現(xiàn)明顯的彌散擴(kuò)增；總平均遺傳距離大于12.47%～13.77%時(shí)，引物會(huì)對(duì)部分近緣物種產(chǎn)生絕對(duì)特異[7]。因此，片段15存在eDNA低效擴(kuò)增/偏倚擴(kuò)增的缺陷。Collins等[25]、Zhang等[3]分別對(duì)英吉利海、北京水系的魚類多樣性調(diào)查顯示，COI片段的物種檢出數(shù)目不及所用的12S片段，其結(jié)果支持本研究觀點(diǎn)。

此外，其他的COI或Cytb metabarcoding片段可能也難以解決引物通用性的問題。魚類eDNA metabarcoding技術(shù)需要依托 2×150 bp、2×250 bp兩種高通量測序（Next-generation Sequencing，NGS）平臺(tái)實(shí)現(xiàn)[3]，而Miya等[4]對(duì)880種硬骨魚類線粒體基因組全序的篩查結(jié)果顯示，COI、Cytb等蛋白質(zhì)編碼基因在該讀長限定范圍內(nèi)不存在成對(duì)的側(cè)翼保守區(qū)，理論上難以設(shè)計(jì)出與經(jīng)典的魚類DNA條形碼（基于Sanger測序，讀長可達(dá)2×600 bp）媲美的成對(duì)引物。Menning等[26]、Jennings等[27]、Sultana等[28]的序列比對(duì)結(jié)果也表明，整個(gè)Cytb基因基本為高變序列，COI基因則只在近5′端前350 bp范圍內(nèi)變異較小，相對(duì)適合設(shè)計(jì)短片段通用引物。結(jié)合本研究（圖1）和Zhang等[3]對(duì)22對(duì)引物的匯總結(jié)果可知，片段15等少數(shù)幾對(duì)魚類COI metabarcoding優(yōu)質(zhì)片段恰位于此相對(duì)保守區(qū)，其引物通用性較差，而其他區(qū)域metabarcoding片段的引物序列總平均遺傳距離可能更大。因此，本研究認(rèn)為后續(xù)研究沒有必要進(jìn)一步比較其他COI、Cytb片段的近緣物種識(shí)別差異；同時(shí)認(rèn)為以片段15為代表的蛋白質(zhì)編碼片段更適合作為eDNA研究的輔助metabarcoding，并且需要根據(jù)研究水域、目標(biāo)類群降低引物調(diào)查范圍，從而對(duì)引物序列進(jìn)行針對(duì)性設(shè)計(jì)或優(yōu)化。

4.2 核糖體片段的比較

片段長度影響物種識(shí)別（表1，圖2，圖4）。本研究中識(shí)別率最低的3個(gè)metabarcoding片段（片段08、片段11和片段04）長度均不超過110 bp，而片段05、片段03等高識(shí)別率片段則在200 bp以上。Balasingham等[6]、Gantner等[29]的研究也認(rèn)為12S和16S擴(kuò)增片段越短，物種鑒定的準(zhǔn)確性越低。雖然由于水體中的痕量eDNA通常存在嚴(yán)重降解，主流的觀點(diǎn)認(rèn)為200 bp以內(nèi)的微條形碼可能具有更高的PCR成功率[4,30]，但Bylemans等[19]、Zhang等[3]多個(gè)研究卻發(fā)現(xiàn)：片段05、片段03等的高通量測序數(shù)據(jù)量和物種檢出數(shù)目并不低于片段08、片段04或片段11，只是在定量分析等方面相互存在較大差異。魚類eDNA的產(chǎn)生、降解動(dòng)力學(xué)過程極為復(fù)雜，目前沒有研究能夠準(zhǔn)確闡明eDNA的微觀存在、分布和變化規(guī)律，Deiner等[31]、Bylemans等[19]推測長片段eDNA可能反而可以更長久地存在水體中。本研究不推薦使用metabarcoding短片段（片段08、片段11和片段04）進(jìn)行近緣魚類多樣性調(diào)查。

圖4 不同metabarcoding片段的非度量多維尺度（NMDS）分析Fig.4 Analysis of non-metric multidimensional scaling (NMDS) for different metabarcoding fragments

續(xù)表2

續(xù)表2

續(xù)表2

續(xù)表2

除去COI和3個(gè)短片段，片段05的物種識(shí)別率最高，其引物通用性（總遺傳距離=0.97%）也僅次于片段04。片段05是近緣魚類多樣性調(diào)查的第一選擇，該結(jié)果與Zhang等[3]的研究結(jié)論一致。片段09、片段07、片段03、片段12的物種識(shí)別率雖然也較高，但在本研究中，其引物序列總平均遺傳距離較大（≥4.14%），存在類似于片段15的“物種丟失”風(fēng)險(xiǎn)；其他metabarcoding引物比較研究也表明其物種檢出數(shù)目不及片段06、片段13[3]。片段14、片段10雖然長度大于200 bp，但物種識(shí)別率和引物通用性卻并不出眾；并且可能因?yàn)橐镄蛄?′位置存在變異[7]，這兩個(gè)片段在個(gè)別研究中的實(shí)際表現(xiàn)甚至不如片段15[3]。而片段01和片段02則在引物序列、條形碼性能方面基本一致，二者存在明顯的相互替代性，本研究更傾向二者中選用片段01。綜上所述，片段05、片段06、片段01、片段13是本研究篩選出的4個(gè)最優(yōu)metabarcoding片段。然而，受高通量測序成本和參考數(shù)據(jù)庫的影響，在單一研究中使用的metabarcoding片段通常不超過3個(gè)[3-4]。雖然本研究及Zhang等[3]、Bylemans等[19]的研究均表明片段06的物種識(shí)別率和引物通用性優(yōu)異，但NMDS分析（圖4）顯示片段06在散點(diǎn)圖上與片段05位置較近，因此同時(shí)使用這兩個(gè)片段進(jìn)行魚類多樣性研究可能并不能顯著提高物種檢出數(shù)目。NMDS分析也顯示，不同基因、同一基因不同片段間均存在較大差異（圖4）。因此不僅需要多片段聯(lián)合應(yīng)用，而且所用片段要有足夠的多基因代表性。本研究傾向于以片段05、片段01為主，片段13等為輔，進(jìn)行近緣魚類多樣性調(diào)查。

4.3 本研究所用片段的不足及新片段開發(fā)的可能性

本研究對(duì)106屬魚類的識(shí)別結(jié)果差異極顯著（見3.3節(jié)），表明物種類群直接影響eDNA metabarcoding調(diào)查效果。從15個(gè)片段的總識(shí)別率角度比較（表2），僅15屬魚類物種識(shí)別率超過90%，多達(dá)38屬魚類識(shí)別率不足50%。由于935種魚類的線粒體全序列皆來自公共數(shù)據(jù)庫，其中一些序列可能存在同物異名錯(cuò)誤—如鯧屬魚類的銀鯧（Pampus argenteus）與鐮鯧（Pampus echinogaster）[32]，因此該屬魚類識(shí)別率偏低；但更可能的解釋是低識(shí)別類群物種間遺傳差異較小，導(dǎo)致metabarcoding片段從源頭上就難以完全區(qū)分—如白鮭屬（Coregonus）[33]、紅點(diǎn)鮭屬（Salvelinus）[34]的眾多物種集中分布于50°N以北環(huán)北極圈水域，物種間可能存在較為頻繁的基因交流；平鲉屬（Sebastes）則廣泛分布于北太平洋且仔魚營漂浮生活，不同群體間也不存在明顯的地理隔離[35]。Miya等[4]在篩選Mi-Fish-U（片段01）引物時(shí)已發(fā)現(xiàn)，金槍魚屬等大洋性魚類的大部分線粒體基因高度保守，只有借助變異速率極高的線粒體NADH脫氫酶亞基5（NADH Dehydrogenase Subunit 5，ND5）條形碼才能進(jìn)行有效區(qū)分。因此，受制于物種自身的遺傳背景，本研究所用片段尚無法對(duì)全部魚類進(jìn)行100%區(qū)分。后續(xù)仍需不斷嘗試篩選新片段從而盡量提高eDNA metabarcoding技術(shù)的魚類多樣性調(diào)查能力。

metabarcoding片段的開發(fā)與目標(biāo)基因內(nèi)莖環(huán)結(jié)構(gòu)的數(shù)量和分布情況密切相關(guān)。斑鰶（Konosirus punctatus）[36]、大口鰜（Psettodes erumei）[37]、北極茴魚（Thymallus arcticus）[38]等線粒體基因二級(jí)結(jié)構(gòu)示意圖顯示，16S基因僅在中后段存在1～2個(gè)大型莖環(huán)結(jié)構(gòu)，相比之下，12S基因存在2～4個(gè)。由于12S基因的總長度僅為16S的60%（約900 bp : 1 600 bp），因此該基因內(nèi)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)分布更為密集和均勻。莖環(huán)結(jié)構(gòu)有利于尋找穩(wěn)定的“保守?高變?保守”序列，Evans和Lamberti[39]、H?nfling 等[40]、Bylemans等[19]據(jù)此認(rèn)為，線粒體12S基因比16S基因更適合開發(fā)魚類eDNA metabarcoding標(biāo)記，本研究支持此結(jié)論。然而，基于14個(gè)核糖體片段的位置示意圖（圖1）和簡約信息（表1）可知，魚類16S基因的后半段大型莖環(huán)及12S基因的主要莖環(huán)皆已經(jīng)被篩選出metabarcoding片段。圍繞單一莖環(huán)結(jié)構(gòu)開發(fā)新片段不僅可能性極小，而且片段識(shí)別率可能也不理想（如片段07、片段10）。相比片段01、片段04和片段08等，片段05和片段06等則是由多個(gè)中小型莖環(huán)結(jié)構(gòu)組合形成，其物種識(shí)別率反而更高。以此類推，聯(lián)合多個(gè)相鄰莖環(huán)區(qū)域可能是形成新的高識(shí)別率片段的手段之一。本研究中，12S片段對(duì)應(yīng)引物存在明顯的位置重合及序列共用（圖1，表1），說明這些區(qū)域的引物保守性得到了較大認(rèn)可。因此，可以嘗試通過這些引物的組合應(yīng)用開發(fā)更長、更高識(shí)別率的metabarcoding片段。如片段01、片段02的正向引物與片段06、片段07正向引物的反向互補(bǔ)序列共用，PCR產(chǎn)物約420 bp（圖1）。該片段由1個(gè)大型莖環(huán)加2個(gè)小型莖環(huán)結(jié)構(gòu)組成，其物種識(shí)別率可能高于片段05。

綜合物種識(shí)別率、引物通用性等多方面因素，本研究推薦2×150 bp測序平臺(tái)使用片段01（MiFish-U）、2×250 bp 測序平臺(tái)使用片段 05（Ac12S），輔以片段13（Vert-16S-eDNA）進(jìn)行近緣魚類多樣性調(diào)查；新片段的開發(fā)也是不斷完善eDNA metabarcoding技術(shù)的重要工作。然而，魚類eDNA研究受多方面因素的影響，基于935種近緣魚類線粒體全序的比較結(jié)果可能會(huì)與實(shí)際表現(xiàn)有差異。后期還需尋找近緣魚類廣泛分布的水域，在建立龐大的本底資料數(shù)據(jù)庫的基礎(chǔ)上驗(yàn)證本研究的結(jié)論和推測。

補(bǔ)充材料

表S1 本研究中106屬魚類簡介

表S2 本研究中935種魚類學(xué)名及對(duì)應(yīng)序列號(hào)

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