滿 佳 華澤升 夏 荷 李建勇 李方義 李劍峰

1.山東大學(xué)機(jī)械工程學(xué)院，高效潔凈機(jī)械制造教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南，250061 2.山東大學(xué)機(jī)械工程國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，濟(jì)南，250061

0 引言

生命科學(xué)涉及生物化學(xué)、生物醫(yī)學(xué)、生物工程制造等多個(gè)領(lǐng)域，伴隨著微流控技術(shù)的出現(xiàn)，相關(guān)學(xué)科蓬勃發(fā)展，以現(xiàn)代生物技術(shù)為基礎(chǔ)的生命科學(xué)也迅速進(jìn)步，取得了諸多重大成就。

機(jī)械工程是涵蓋了多個(gè)自然學(xué)科和技術(shù)學(xué)科的工程學(xué)科。通過(guò)結(jié)合生產(chǎn)實(shí)踐中的經(jīng)驗(yàn)，人們研發(fā)了各種不同的機(jī)械系統(tǒng)，解決了理論與實(shí)踐相脫離的問(wèn)題。微流控(microfluidics)是在微機(jī)電加工技術(shù)(MEMS)基礎(chǔ)上發(fā)展而來(lái)的，是指在微尺度空間內(nèi)操控流體的一種技術(shù)，該技術(shù)可以將化學(xué)、生物等實(shí)驗(yàn)室的基本功能微縮到一個(gè)幾平方厘米的芯片上，因此又被稱為芯片實(shí)驗(yàn)室(Lab-on-a-chip)[1]。作為機(jī)械、生物、化學(xué)、材料等學(xué)科交叉領(lǐng)域研究的技術(shù)平臺(tái)，微流控技術(shù)具有傳統(tǒng)研究方法不可替代的優(yōu)勢(shì)，它把樣品反應(yīng)、制備、分離、檢測(cè)等生化實(shí)驗(yàn)的基本操作集成到很小的芯片上，試劑消耗量小、檢測(cè)成本低、靈敏度高、效率高[2]。近年來(lái)，隨著微流控器件和制備工藝的發(fā)展，微流控技術(shù)在生命科學(xué)領(lǐng)域的交叉應(yīng)用越來(lái)越廣泛。

本文主要闡述了微流控技術(shù)的工作原理及其近年來(lái)在機(jī)械工程-生命科學(xué)交叉領(lǐng)域國(guó)內(nèi)外研究成果，梳理了其在生命科學(xué)領(lǐng)域的交叉應(yīng)用現(xiàn)狀，主要從生物檢測(cè)、體外結(jié)構(gòu)仿生制造及可控釋放的藥物載體制備三方面展開介紹，最后對(duì)其應(yīng)用前景進(jìn)行展望。

1 微流控技術(shù)的概述

20世紀(jì)90年代瑞士科學(xué)家MANZ等[3]最早提出了微流控的概念，將微機(jī)電與化學(xué)分析相結(jié)合，即微全分析系統(tǒng)(micro total analysis system，μTAS)，拉開了微流控技術(shù)發(fā)展的序幕。微流控是多學(xué)科融合的新興科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，與傳統(tǒng)機(jī)械制造技術(shù)相比，它是一場(chǎng)理論方法和制造技術(shù)的革命。微流控技術(shù)在生命科學(xué)上的交叉應(yīng)用是通過(guò)微流控芯片實(shí)現(xiàn)的，微流控芯片是通過(guò)設(shè)計(jì)和加工一定結(jié)構(gòu)的微通道，然后在微通道內(nèi)對(duì)液體進(jìn)行操控和分析的平臺(tái)。微流控芯片的材料及制備工藝是提升芯片性能及功能的關(guān)鍵。

1.1 微流控芯片制備材料

微流控芯片的制備材料主要有硅質(zhì)材料、高聚物材料、陶瓷材料以及新興的紙基材料等，其中，硅質(zhì)材料主要包括硅、玻璃、石英等，來(lái)源廣泛。硅[4]具有良好化學(xué)惰性和熱穩(wěn)定性，是早期微流控芯片的主要材料，缺點(diǎn)是電絕緣性、透光性較差。近幾年，玻璃[5]和石英[6]由于透光性和電滲性良好、耐腐蝕等特點(diǎn)而逐步取代硅。高聚物材料主要指聚二甲基硅氧烷(PDMS)和聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)[7]。PDMS是當(dāng)前應(yīng)用最廣泛的芯片材料之一，具有良好的透光性和透氣性[8]。陶瓷材料，例如氧化鋁基[9]等適用于制造具有復(fù)雜三維結(jié)構(gòu)微流控器件。新提出的紙基材料[10]由于具有良好的生物相容性，且成本低廉，主要用于生物檢測(cè)領(lǐng)域。

1.2 微流控芯片制備工藝

微流控芯片可通過(guò)多種機(jī)械加工工藝制備得到，包括：微銑削、微光刻、蝕刻法、激光燒灼法、LIGA法、軟光刻及3D打印等。微銑削[11]是利用微銑刀對(duì)基底表面進(jìn)行加工的方法，具有極高的加工精度，適用于結(jié)構(gòu)多變且具有階梯深度的微凹槽結(jié)構(gòu)加工，如圖1所示。微光刻是利用光膠、掩膜、紫外光來(lái)進(jìn)行微制造，包括薄膜沉淀、光刻、刻蝕三個(gè)工序。薄膜沉積[12]是通過(guò)氧化、沉積等方法將軟材料覆蓋在基片表面形成薄膜，薄膜作為犧牲層；光刻和蝕刻過(guò)程是將掩膜通過(guò)曝光成像轉(zhuǎn)移到薄膜上并在基底上加工特定微結(jié)構(gòu)的工藝。與微光刻法相似，蝕刻法[13]主要有薄膜沉淀、光刻、刻蝕三個(gè)工序，不同之處是刻蝕過(guò)程采用腐蝕性液體進(jìn)行處理。硅質(zhì)材料一般采用光刻和蝕刻方法加工。激光燒灼法[14]是將紫外激光作用在可光解聚合物上，使其發(fā)生激光濺射，通過(guò)控制濺射位置，可得到具有特定結(jié)構(gòu)的微芯片。該方法能制備具有大深寬比的芯片，但加工效率低且成本高。LIGA技術(shù)是基于X射線光刻的微機(jī)電加工技術(shù)[15]，包括X光深層光刻、微電鑄和微復(fù)制三個(gè)工藝步驟，適合加工具有高深寬比的芯片，因而能夠制備復(fù)雜的圖形結(jié)構(gòu)，精度高，缺點(diǎn)是成本較高且無(wú)法加工曲面。軟光刻法[16-17]是20世紀(jì)90年代末出現(xiàn)的制備方法，大多數(shù)PDMS微流控芯片是用該方法制備的，其工藝特點(diǎn)在于利用軟材料制作出微通道陽(yáng)模，然后通過(guò)圖案復(fù)制制備出微流控芯片，該方法能夠制作出具有復(fù)雜三維微通道結(jié)構(gòu)的芯片，并能在不同化學(xué)性質(zhì)表面上應(yīng)用，應(yīng)用范圍更廣。圖2所示為利用軟光刻法制備微流控芯片工藝流程。3D打印法[18]是近年來(lái)新興的微流控芯片制備工藝，與傳統(tǒng)制備方法相比，3D打印法不僅有更高的分辨率，還能夠制備特殊的多孔結(jié)構(gòu)。

圖1 微銑削法制備微流控芯片[11]

圖2 軟光刻法制備PDMS芯片[17]

2 微流控技術(shù)在生命科學(xué)中的交叉應(yīng)用

近年來(lái)，隨著微機(jī)電加工技術(shù)的不斷進(jìn)步，以微流控芯片為核心的微尺度制造技術(shù)取得了長(zhǎng)足的發(fā)展，在生命科學(xué)研究領(lǐng)域發(fā)揮重要作用[19]。

2.1 微流控技術(shù)在生物檢測(cè)方面的應(yīng)用

生物檢測(cè)是一種用于檢測(cè)目標(biāo)生物分子(蛋白質(zhì)、酶、抗體、核酸等)的技術(shù)，已廣泛應(yīng)用于藥物研發(fā)、醫(yī)療診斷、環(huán)境監(jiān)測(cè)及食品安全等領(lǐng)域。與傳統(tǒng)化學(xué)檢測(cè)相比，微流控技術(shù)在減少樣品使用劑量、實(shí)現(xiàn)高通量和高效檢測(cè)方面有顯著優(yōu)勢(shì)。

2.1.1DNA分析和測(cè)序

微流控技術(shù)由于其特殊的功能，在疾病檢測(cè)方面有廣闊的應(yīng)用前景。在應(yīng)對(duì)新型冠狀病毒過(guò)程中，人們意識(shí)到快速檢測(cè)在病毒性傳染病的預(yù)防和控制過(guò)程中所發(fā)揮的重要作用。目前病毒DNA的檢測(cè)方法有傳統(tǒng)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR[20]、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法(LAMP)[21]等技術(shù)。由于DNA濃度很低，在檢測(cè)前需要對(duì)DNA進(jìn)行擴(kuò)增，再用熒光或者化學(xué)發(fā)光方法檢測(cè)。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法所需的試劑量較多，檢測(cè)靈敏度相對(duì)較低，為此，研究人員將微流控技術(shù)與上述檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合，對(duì)DNA分析和測(cè)序進(jìn)行了大量研究。

微液滴數(shù)字PCR(dd PCR)[22]是基于液滴微流控的數(shù)字PCR技術(shù)，與其他PCR技術(shù)相比，具有更高的分辨率和檢測(cè)靈敏度，是一種單分子水平的核酸定量分析技術(shù)。利用微流控芯片將待測(cè)樣品制備成微米尺度的液滴，微液滴中只含有待測(cè)樣品的單分子DNA，然后對(duì)微液滴中的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，完成DNA熒光標(biāo)記[22]，最后通過(guò)微液滴分析儀進(jìn)行熒光信號(hào)檢測(cè)，有熒光信號(hào)的表示存在初始DNA分子，沒有熒光信號(hào)的意味著沒有初始DNA分子，這樣就能夠得到待測(cè)樣品中的DNA數(shù)目。ZHU等[23]采用“準(zhǔn)共聚焦”方法來(lái)構(gòu)建微液滴檢測(cè)儀的光路，如圖3所示。由于激發(fā)光路中的激發(fā)光斑與微液滴的尺寸相匹配，因而能夠最大限度地激發(fā)整個(gè)微液滴內(nèi)的熒光信號(hào)，提高微液滴之間的信號(hào)對(duì)比度。該方法的相對(duì)誤差小于5%，線性度r2>0.998，解決了微液滴檢測(cè)過(guò)程中的假陽(yáng)性問(wèn)題，實(shí)現(xiàn)了高精準(zhǔn)檢測(cè)。目前，該技術(shù)已應(yīng)用于北京新弈生物科技有限公司開發(fā)的新羿TD-1 數(shù)字 PCR 平臺(tái)，在生物醫(yī)學(xué)的基因檢測(cè)、微生物檢測(cè)等方面應(yīng)用廣闊。

圖3 “準(zhǔn)共聚焦”液滴檢測(cè)裝置[23]

LAMP法是由NOTOMI等[24]提出的。首先，DNA模板在具有鏈置換活性的DNA聚合酶的作用下，恒溫(60～65 ℃)培養(yǎng)15～60 min，實(shí)現(xiàn)109～1010倍的核酸擴(kuò)增，擴(kuò)增過(guò)程中產(chǎn)生的白色渾濁可作為擴(kuò)增結(jié)果的觀察依據(jù)。FANG等[25]開發(fā)了一種基于LAMP技術(shù)的即時(shí)檢測(cè)細(xì)菌的微流控芯片。該芯片由DNA釋放腔室、多網(wǎng)路的LAMP放大腔室以及兩腔室之間的螺桿閥和虹吸閥構(gòu)成，如圖4所示。通過(guò)在DNA釋放腔室內(nèi)設(shè)置高溫，使DNA快速釋放并溶于緩沖液中，然后通過(guò)開啟螺桿閥控制芯片內(nèi)部的蒸汽壓力進(jìn)而將DNA溶液輸送到放大室，在LAMP放大室內(nèi)可實(shí)現(xiàn)DNA指數(shù)級(jí)的擴(kuò)增。檢測(cè)結(jié)果可以通過(guò)肉眼直接觀察，簡(jiǎn)便快捷，可應(yīng)用于核酸快速檢測(cè)領(lǐng)域[25]。近期，博奧生物集團(tuán)聯(lián)合清華大學(xué)、四川大學(xué)華西醫(yī)院共同開發(fā)了包括新冠病毒在內(nèi)的六項(xiàng)呼吸道病毒核酸檢驗(yàn)試劑盒，該試劑盒是基于LAMP的微流控?cái)U(kuò)增技術(shù)研發(fā)的，目前已獲得CE-IVD認(rèn)證，為新冠疫情防控工作提供了強(qiáng)有力的高效檢測(cè)工具[26]。

圖4 多網(wǎng)絡(luò)LAMP擴(kuò)增芯片的結(jié)構(gòu)示意圖[25]

DNA測(cè)序[27]包括樣品分離、放大、擴(kuò)增、提純、電泳分析五個(gè)步驟。MADSEN等[28]設(shè)計(jì)了一種可定向測(cè)序的微流控芯片，它能將單個(gè)樣品細(xì)胞的DNA直接轉(zhuǎn)化為堿基序列，通過(guò)后續(xù)放大、擴(kuò)增、電泳分析完成DNA樣品的測(cè)序，分析時(shí)間可減少一個(gè)數(shù)量級(jí)，且準(zhǔn)確率在99%以上。

2.1.2蛋白質(zhì)分析

DNA僅僅是遺傳信息的載體，在DNA水平上難以獲知其表達(dá)產(chǎn)物蛋白質(zhì)的組成和活動(dòng)規(guī)律，在此背景下誕生了研究細(xì)胞中蛋白質(zhì)組成和活動(dòng)規(guī)律的蛋白質(zhì)組學(xué)。基于微流控技術(shù)的蛋白質(zhì)芯片使用幾微升甚至幾納升的蛋白質(zhì)溶液便可以將特定蛋白質(zhì)從細(xì)胞中分離出來(lái)并進(jìn)行相應(yīng)的檢測(cè)，高效且試劑消耗少。

CHIKKAVEERAIAH等[29]基于PDMS芯片制造了用于癌癥蛋白質(zhì)生物標(biāo)記物多重檢測(cè)的微流體分析系統(tǒng)。該系統(tǒng)包括微量注射泵和PDMS通道發(fā)生裝置，在微通道下方裝有電極微陣列以及對(duì)稱放置的參照電極和對(duì)比電極(圖5)。這種微流體電化學(xué)分析系統(tǒng)利用酶標(biāo)記的1 μm超順磁性抗體生物結(jié)合物顆粒離線捕獲分析物，然后通過(guò)測(cè)量電極捕獲抗體，能夠有效檢測(cè)前列腺特異性抗原(PSA)血清中的白細(xì)胞介素水平。

圖5 8電極陣列的微流控電化學(xué)分析設(shè)備[29]

徐波[30]搭建了一套基于二維電泳分離的微流控?zé)晒鈾z測(cè)系統(tǒng)，對(duì)常見的20種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸進(jìn)行了定量分析，如圖6所示。該系統(tǒng)在進(jìn)樣和分離切換上引入雙電動(dòng)閥系統(tǒng)，通過(guò)調(diào)節(jié)電勢(shì)分配，使樣品在電滲流的驅(qū)動(dòng)下交替進(jìn)入樣品廢物收集通道和分離通道，基于該方法檢測(cè)的氨基酸線性相關(guān)數(shù)大于0.99，系統(tǒng)的線性范圍超過(guò)常規(guī)方法 3個(gè)數(shù)量級(jí)[30]。

(a)蛋白質(zhì)芯片微通道結(jié)構(gòu)示意圖

2.1.3免疫分析

基于微流控芯片的免疫分析具有擴(kuò)散距離小、空間比表面積大的優(yōu)勢(shì)，解決了傳統(tǒng)免疫分析方法效率低、操作繁瑣、分析時(shí)間長(zhǎng)、試劑消耗大的問(wèn)題。

HERRMANN等[31]設(shè)計(jì)了一種在截流條件下實(shí)現(xiàn)平行酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)的微流控檢測(cè)系統(tǒng)，該系統(tǒng)由8個(gè)獨(dú)立的微通道組成，用于在相同的實(shí)驗(yàn)條件下實(shí)現(xiàn)并行檢測(cè)，如圖7所示。該系統(tǒng)在PDMS微通道內(nèi)通入了順磁性微珠，磁珠既用作固相，以支持反應(yīng)性免疫復(fù)合物的形成，又可在通道內(nèi)部實(shí)現(xiàn)磁混合。

圖7 平行ELISA微流控檢測(cè)芯片[31]

COSTANTINI等[32]開發(fā)了將微流控芯片和非晶硅光敏傳感器結(jié)合的ELISA裝置，該裝置由PDMS芯片、玻璃基底、光敏陣列片、非晶硅光電傳感器等組成，如圖8所示。裝置基于GPs抗體和辣根過(guò)氧化物酶Ig-HRP標(biāo)記的二次抗體進(jìn)行免疫分析，二次抗體攜帶的HRP酶能催化化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，而非晶硅光敏傳感器能檢測(cè)光強(qiáng)并轉(zhuǎn)換成電信號(hào)，通過(guò)電信號(hào)強(qiáng)弱便可篩選出特異性抗體，目前該系統(tǒng)已能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)腹腔疾病的診斷。

圖8 微流控芯片和非晶硅光敏傳感器結(jié)合的ELISA裝置示意圖[32]

微流控技術(shù)檢測(cè)精度高、用時(shí)少、操作方便、可靠性高，在臨床診斷、藥物分析等基礎(chǔ)研究領(lǐng)域都可能大有作為，但不同的檢測(cè)目標(biāo)往往需要選擇不同結(jié)構(gòu)及尺寸的微流控芯片，普適性較差。如果該問(wèn)題得不到有效解決，生物檢測(cè)芯片的應(yīng)用范圍將大受影響。

2.2 微流控技術(shù)在體外仿生制造的應(yīng)用

2.2.1微流控技術(shù)在細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用

細(xì)胞是生物結(jié)構(gòu)和功能的基本單位，細(xì)胞不是單獨(dú)存在的，只有通過(guò)細(xì)胞間的相互作用，才能維持和協(xié)調(diào)生物體內(nèi)有序的生命活動(dòng)，因此研究細(xì)胞結(jié)構(gòu)及其生物行為對(duì)探索生命的奧秘具有深遠(yuǎn)意義。細(xì)胞在人體內(nèi)處于復(fù)雜的微環(huán)境中，傳統(tǒng)的研究分析方法難以模擬細(xì)胞所處的微環(huán)境，而且細(xì)胞樣品量小、體系復(fù)雜、價(jià)格昂貴等使廣大科研工作者望而卻步。與傳統(tǒng)方法相比，微流控細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，如芯片通道尺寸與細(xì)胞大小相適應(yīng)、可操縱少數(shù)或單個(gè)細(xì)胞等。因此，細(xì)胞培養(yǎng)芯片能夠模擬細(xì)胞所受的細(xì)胞外基質(zhì)以及細(xì)胞間的相互作用，從而精確研究細(xì)胞的生理狀態(tài)，在藥物研發(fā)等領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用。

根據(jù)培養(yǎng)方式的不同，微流控細(xì)胞培養(yǎng)主要分為二維細(xì)胞培養(yǎng)[33]和三維細(xì)胞培養(yǎng)[34]。二維細(xì)胞培養(yǎng)與傳統(tǒng)培養(yǎng)皿培養(yǎng)方式較為相似，細(xì)胞懸浮液流經(jīng)微流控芯片后，細(xì)胞貼附在微通道內(nèi)壁上，培養(yǎng)基或者其他溶液從細(xì)胞上方經(jīng)過(guò)，以靜態(tài)方式為細(xì)胞提供所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[35]，該方式操作簡(jiǎn)單，易于觀察，但所得到的數(shù)據(jù)往往是細(xì)胞群體的平均值，不能充分反映細(xì)胞個(gè)體的差異性。三維細(xì)胞培養(yǎng)是將細(xì)胞培養(yǎng)在利用生物相容性材料構(gòu)建的三維微流控系統(tǒng)中，細(xì)胞可以對(duì)外部環(huán)境和刺激做出反應(yīng)。與二維培養(yǎng)相比，三維微流控系統(tǒng)能夠最大程度地模擬體內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境，不僅可以促進(jìn)細(xì)胞聚集和組織形成，還可以促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化、遷移等生物行為[35]。

LEI等[36]研制了一種三維灌流細(xì)胞培養(yǎng)微流控芯片，該芯片由灌注層、培養(yǎng)層、電極層組成，如圖9所示。在該研究中，人類口腔癌細(xì)胞(OEC-M1)被包裹在三維瓊脂糖支架中，并在培養(yǎng)室中進(jìn)行灌流培養(yǎng)。在培養(yǎng)室的側(cè)壁埋入一對(duì)垂直電極進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)阻抗測(cè)量，平行的垂直電極可產(chǎn)生均勻的電場(chǎng)，使得封裝在不同位置的細(xì)胞可以得到相同的電場(chǎng)，通過(guò)阻抗變化可監(jiān)測(cè)細(xì)胞增殖情況，并可以對(duì)不同濃度抗癌藥物灌流下的細(xì)胞活力進(jìn)行實(shí)時(shí)阻抗監(jiān)測(cè)。研究表明，阻抗大小與細(xì)胞活力直接相關(guān)，通過(guò)阻抗測(cè)量實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞增殖狀況和化學(xué)敏感性的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，在癌癥藥物研發(fā)方向有巨大的潛力。

(a)微流控芯片設(shè)計(jì) (b)微流控芯片實(shí)物

ZHAO等[37]提出了一種基于液滴的三維細(xì)胞培養(yǎng)方法來(lái)培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞，如圖10所示。將液滴陣列貼附在PDMS片的側(cè)壁上，不僅避免了細(xì)胞貼附在芯片表面，實(shí)現(xiàn)了三維細(xì)胞培養(yǎng)，而且還利于對(duì)液滴內(nèi)的細(xì)胞執(zhí)行多種操作，包括細(xì)胞懸液液滴生成，藥物治療及細(xì)胞染色等。

圖10 三維液滴細(xì)胞培養(yǎng)分析過(guò)程及芯片結(jié)構(gòu)[37]

LI等[38]基于3D打印、微流控芯片技術(shù)和共培養(yǎng)技術(shù)，開發(fā)了一種新的體外藥物篩選微流控芯片3DPF。在該研究中，微流控芯片由兩個(gè)微通道和通道之間的單排微結(jié)構(gòu)組成(圖11)。A通道用于血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)和給藥，B通道用于肝癌細(xì)胞培養(yǎng)，利用A通道和B通道之間的單排微結(jié)構(gòu)進(jìn)行物質(zhì)傳遞，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)。在美妥珠單抗的藥效學(xué)測(cè)試中，發(fā)現(xiàn)3DPF模型對(duì)藥物濃度更敏感，該模型不僅為美妥珠單抗的開發(fā)提供了參考，將來(lái)還可用于評(píng)估各種藥物的毒性。

(a)芯片內(nèi)部結(jié)構(gòu)

2.2.2微流控技術(shù)在組織工程中的應(yīng)用

在人體微環(huán)境中，組織是由細(xì)胞和細(xì)胞間質(zhì)組成的，隨著細(xì)胞共培養(yǎng)研究的不斷進(jìn)步，組織工程引發(fā)了越來(lái)越多的關(guān)注和研究。組織工程通過(guò)模擬生物體內(nèi)微環(huán)境來(lái)構(gòu)建生物系統(tǒng)，為醫(yī)學(xué)、生命科學(xué)等領(lǐng)域的研究提供了更好的平臺(tái)。微流控技術(shù)具有集成化程度高、結(jié)構(gòu)多樣化的特點(diǎn)，可以精確操縱細(xì)胞與細(xì)胞外微環(huán)境?；谖⒘骺丶夹g(shù)的組織工程通過(guò)精確控制系統(tǒng)中的化學(xué)梯度、流體應(yīng)力和細(xì)胞生態(tài)位，能夠有效適應(yīng)組織結(jié)構(gòu)的形貌變化，且具備良好的功能穩(wěn)定性，是制備組織工程結(jié)構(gòu)和研究組織相互作用的有利手段。

現(xiàn)有的微流控組織工程的實(shí)現(xiàn)大多是采用灌流培養(yǎng)的方式。微流控灌注培養(yǎng)系統(tǒng)通過(guò)各層“紙芯片”的疊加和拆分，結(jié)合微通道主動(dòng)灌流與芯片間的被動(dòng)擴(kuò)散，實(shí)現(xiàn)芯片內(nèi)基質(zhì)與外界物質(zhì)相互交換?！凹埿酒奔夹g(shù)是MARTINEZ等[39]提出的，即在微流控芯片中引入具有良好通透性和生物相容性的薄膜材料[40]。組織工程芯片利用微通道網(wǎng)絡(luò)將不同的細(xì)胞培養(yǎng)單元串聯(lián)，同時(shí)結(jié)合灌流培養(yǎng)的方式，精確模擬了三維組織培養(yǎng)微環(huán)境，實(shí)現(xiàn)了從細(xì)胞到組織的轉(zhuǎn)換。

SHAO等[41]提出了組織/血管同軸3D打印方法，實(shí)現(xiàn)了血管和組織同步制造。該方法利用同軸針頭將預(yù)凝膠化的甲基丙烯酸化凝膠(GelMA)墨水(載有組織細(xì)胞)和預(yù)凝膠化明膠墨水(載有內(nèi)皮細(xì)胞)同時(shí)擠出，明膠墨水在打印時(shí)形成復(fù)雜的流道網(wǎng)絡(luò)，與此同時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞黏附在流道內(nèi)壁進(jìn)行血管化，兩者相互結(jié)合進(jìn)而生成血管化組織，如圖12所示。通過(guò)該方法，能夠打印大塊組織結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)了骨組織的體外長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)。

(a)同軸生物3D打印 (b)GelMA永久光交聯(lián) (c)凝膠溶解和細(xì)胞自增殖

2.2.3微流控技術(shù)在器官芯片中的應(yīng)用

在生命科學(xué)的研究領(lǐng)域中，基于微流控器件的器官芯片作為一種新型的體外器官模型，近年來(lái)得到了廣泛的研究。微流控芯片可以精確地模擬體外培養(yǎng)微環(huán)境，維持細(xì)胞功能和形態(tài)，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)二維細(xì)胞培養(yǎng)模式難以實(shí)現(xiàn)人體組織器官?gòu)?fù)雜生理功能的局限，解決了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)、成本高、難以預(yù)測(cè)人體對(duì)各種藥物響應(yīng)的問(wèn)題，為研究人類的生理學(xué)和病理學(xué)提供了很好的技術(shù)手段[42]。到目前為止，肺、肝、心臟等各種器官功能已在微流控器官芯片上成功實(shí)現(xiàn)。

肺芯片是最著名的器官芯片，HUH[43]設(shè)計(jì)了雙層夾膜結(jié)構(gòu)的肺器官芯片，芯片由上下兩層PDMS框架和中間層的PDMS多孔膜組成，在PDMS膜上下兩側(cè)分別培養(yǎng)上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，同時(shí)，在芯片兩側(cè)腔室連接周期性工作的氣泵，通過(guò)兩側(cè)腔室的規(guī)律性抽吸帶動(dòng)細(xì)胞產(chǎn)生周期性形變，模擬肺非真空/真空的循環(huán)狀態(tài)，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的動(dòng)態(tài)培養(yǎng)，如圖13所示。

圖13 仿生肺芯片模擬呼氣和吸氣過(guò)程[43]

肝臟是與藥物代謝相關(guān)的主要靶器官，因此在制備新藥過(guò)程中準(zhǔn)確預(yù)測(cè)肝臟的代謝能力和毒性至關(guān)重要。HE等[44]利用PDMS構(gòu)建了類肝臟血管結(jié)構(gòu)的微流控器官芯片，然后將含有肝細(xì)胞的水凝膠注入芯片微通道中，以形成肝小葉樣結(jié)構(gòu)；同時(shí)用蠕動(dòng)泵連續(xù)灌注來(lái)模擬人體內(nèi)血液流動(dòng)，達(dá)到模擬肝臟代謝功能的效果。

在仿生心臟研究方面，F(xiàn)U等[45]開發(fā)了具有微生理可視化功能的“心臟芯片”，該芯片能夠進(jìn)行可視化和定量分析，這是傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)無(wú)法實(shí)現(xiàn)的。芯片由基底和表面具有微槽的反蛋白石結(jié)構(gòu)水凝膠彈性薄膜組成。心臟的搏動(dòng)過(guò)程伴隨著細(xì)胞的伸長(zhǎng)和收縮，使得水凝膠膜內(nèi)部晶格中衍射平面間距改變，進(jìn)而改變了水凝膠膜結(jié)構(gòu)色，實(shí)現(xiàn)了心肌細(xì)胞的力學(xué)傳感檢測(cè)，如圖14所示。

(a)仿生心臟芯片構(gòu)建過(guò)程

由于人體代謝環(huán)境的復(fù)雜性，器官芯片的應(yīng)用仍然存在一定的局限性，如單器官芯片無(wú)法全面反映機(jī)體器官功能的復(fù)雜性、多變性和完整性。為適應(yīng)人體結(jié)構(gòu)復(fù)雜性，多器官微流控芯片系統(tǒng)應(yīng)運(yùn)而生。MASCHMEYER等[46]提出了四器官芯片，這種芯片包括腸道、肝臟、腎臟、皮膚四個(gè)器官以及提供血液循環(huán)和排泄循環(huán)的微泵，芯片結(jié)構(gòu)如圖15所示。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞在芯片內(nèi)具有較高的活性并能夠自發(fā)形成功能化的結(jié)構(gòu)。多器官芯片將不同器官細(xì)胞在芯片上進(jìn)行共培養(yǎng)，能夠模擬不同器官之間的相互作用，在毒性檢測(cè)和代謝評(píng)估方面具有顯著優(yōu)勢(shì)。

圖15 多器官微流控芯片設(shè)計(jì)示意圖[46]

微流控技術(shù)強(qiáng)大的細(xì)胞操控以及精確的微環(huán)境調(diào)控能力使其成為體外仿生制造研究中的重要手段，但體外仿生制造的發(fā)展與應(yīng)用仍存在細(xì)胞來(lái)源少、可利用材料種類少等問(wèn)題亟待解決。在未來(lái)發(fā)展中，在組織-器官水平上模擬仿生環(huán)境，對(duì)促進(jìn)不同器官細(xì)胞之間的相互作用和藥物風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估研究意義重大。

2.3 微流控技術(shù)在藥物載體制備中的應(yīng)用

由上文可知，微流控技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)體外結(jié)構(gòu)仿生制造，可應(yīng)用于生物制造研究，除此之外該技術(shù)還可以用于體內(nèi)給藥，通過(guò)微流控芯片高效地封裝藥物，實(shí)現(xiàn)藥物的控釋和緩釋。在傳統(tǒng)的給藥方式中，藥物在體內(nèi)釋放后，會(huì)造成血藥濃度迅速升高，隨著體內(nèi)代謝，血藥濃度又迅速降低，這樣的過(guò)程容易產(chǎn)生毒副作用，降低療效。而藥物的緩釋與控釋能夠減少用藥次數(shù)，穩(wěn)定血藥濃度，提高藥物利用率。微流控技術(shù)可以制備粒徑均一、結(jié)構(gòu)可控、可緩慢釋放藥物的微球，為藥物傳遞和釋放建立了一個(gè)強(qiáng)有力的平臺(tái)，近年來(lái)引起許多研究人員的關(guān)注。

形成載藥微球的微通道類型包括三種基本結(jié)構(gòu)：同向結(jié)構(gòu)[47]、微流匯聚結(jié)構(gòu)[47]及T型結(jié)構(gòu)[48]。通過(guò)組合不同類型的通道結(jié)構(gòu)，可以形成用于制備多種復(fù)合結(jié)構(gòu)微液滴的微流控芯片[49-52]，如圖16所示。雖然微流控芯片的形式和結(jié)構(gòu)多種多樣，但其乳化機(jī)理十分相似，即分散相流在連續(xù)相的作用下被打破，形成單分散液滴。

(a)同向結(jié)構(gòu)單乳化芯片[47] (b)微流匯聚型單乳化芯片[47]

2.3.1核殼結(jié)構(gòu)的載藥微球

在微流控通道中，利用連續(xù)相和分散相互不相溶的特性，可形成水包油包水以及油包水包油或者更加復(fù)雜的液滴結(jié)構(gòu)，液滴經(jīng)熱固化、光固化等手段后便可得到相應(yīng)的固體顆粒。殼層或內(nèi)核能夠包裹生物分子、藥物或其他生物相容性物質(zhì)，由不同材料制備得到的微球其性質(zhì)也不同。

LI等[53]以油溶性藥物作為內(nèi)相，以含有溫敏性材料聚N-異丙基丙烯酰胺微凝膠(PNIPAm)、聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)的納米四氧化三鐵混合液為外相，利用同向型雙乳化微流控芯片制備得到藥物為核、聚合物為殼的核殼結(jié)構(gòu)載藥微球，如圖17a所示。當(dāng)氧化鐵納米顆粒被遠(yuǎn)程觸發(fā)的感應(yīng)熱場(chǎng)加熱時(shí)，熱敏性的PNIPAm 殼收縮，同時(shí)形成微/納米空隙和通道，內(nèi)核油相藥物得到釋放；取消感應(yīng)加熱時(shí)，該微球又恢復(fù)到初始狀態(tài)，停止藥物釋放過(guò)程，實(shí)現(xiàn)了藥物的可控釋放，如圖17b所示。

(a)微流控技術(shù)制備核殼微球原理示意圖

由于人體內(nèi)不同的位置具有不同的pH環(huán)境，如胃的酸性環(huán)境和腸、結(jié)腸的堿性環(huán)境，pH響應(yīng)微球有靶向給藥的潛力。LIU等[54]將阿托伐他汀(AVA)和塞來(lái)昔布(CEL)作為模型藥物，以含有AVA藥物的有機(jī)溶液為分散相，以含有CEL藥物的水溶液作為連續(xù)相，利用微流匯聚型微流控芯片制備出負(fù)載兩種藥物的復(fù)合微球，實(shí)現(xiàn)了不同pH條件下AVA藥物的多級(jí)釋放，如圖18所示。該微球在pH值為1.2～5.5時(shí)保持結(jié)構(gòu)完整性，而在pH值為6.0～6.5時(shí)部分溶解，2小時(shí)內(nèi)釋放出50%的藥物；pH值6.5以上時(shí)微球會(huì)完全坍塌，在半小時(shí)內(nèi)便會(huì)釋放出所有藥物。由于該微球能在酸性條件下保護(hù)藥物，在堿性條件下逐漸釋放，因而是胃腸道靶向釋放藥物的優(yōu)良載體。

圖18 微流控技術(shù)制備載有阿托伐他汀(AVA)和塞來(lái)昔布(CEL)的核殼結(jié)構(gòu)微球[54]

LI等[55]將親水性藥物鹽酸阿霉素溶解在光敏材料GelMA中，將疏水性藥物喜樹堿溶解在聚乙丙交脂(PLGA)溶液中，通過(guò)改變內(nèi)外相液體的流速得到雙乳化液滴；在紫外燈的照射下，內(nèi)核固化，使內(nèi)核鹽酸阿霉素藥物得到良好封裝，從而制備了載藥凝膠為核，PLGA為殼的核殼結(jié)構(gòu)微球，如圖19所示。該微球?qū)崿F(xiàn)了親水性藥物和疏水性藥物的同時(shí)封裝，且核殼材料均為生物可降解性的，隨著殼核材料的降解，藥物逐漸釋放。進(jìn)一步研究表明，將肝癌細(xì)胞和藥物同時(shí)封裝在該微球中，能夠顯著降低肝癌細(xì)胞存活率，提高治療效果，這些特性表明了該微球作為藥物傳遞系統(tǒng)的潛在價(jià)值。

(a)用于生成核殼結(jié)構(gòu)微球的毛細(xì)管微流控芯片示意圖

2.3.2多孔結(jié)構(gòu)的載藥微球

利用微流控技術(shù)制備的多孔微球具有大的比表面積和孔體積，藥物可吸附在多孔微球的表面或進(jìn)入微球內(nèi)部，通過(guò)調(diào)整孔結(jié)構(gòu)可實(shí)現(xiàn)藥物緩慢釋放[56]。此外，多孔微球還具有載藥量大、釋藥速率可調(diào)等優(yōu)點(diǎn)，因此廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。

ZHANG等[57]受到豆腐形成機(jī)理的啟發(fā)，通過(guò)微流控芯片制備了大豆蛋白多孔微球。該方法以鹵水為內(nèi)相，以豆?jié){為中相，大豆油為外相，將中相管道與加熱板集成，通過(guò)合理調(diào)控內(nèi)、中、外三相的流速形成大豆蛋白微球，將微球凍干可形成多孔結(jié)構(gòu)，如圖20所示。由于大豆蛋白多孔微球有良好的生物相容性，抗癌藥物能夠被有效封裝在微球中，因此在藥物載體方面有良好的應(yīng)用前景。

圖20 微流控技術(shù)制備大豆蛋白多孔微球[57]

AMOYAV等[58]首先將含碳酸氫銨的水溶液加入到PLGA的有機(jī)溶液中，均質(zhì)化后得到油包水初乳液，再以該初乳液為分散相，以聚乙烯醇(PVA)溶液為連續(xù)相，利用單乳化微流控芯片制備了尺寸均一的微球。隨著有機(jī)相溶劑蒸發(fā)，碳酸氫銨分解產(chǎn)生二氧化碳和氨氣，微球表面形成了多孔結(jié)構(gòu)，如圖21所示。體外釋放研究表明，與非多孔顆粒相比，多孔微球的高比表面積能夠增強(qiáng)分子擴(kuò)散，從而加速微球降解和藥物釋放。

圖21 PLGA多孔微球制備示意圖[58]

2.3.3各向異性結(jié)構(gòu)的載藥微球

各向異性顆粒是指在同一個(gè)顆粒中具有非對(duì)稱的形狀或不均勻的性質(zhì)，與其他類型顆粒的理化性質(zhì)不同，各向異性粒子在生物醫(yī)用材料、固體表面活性劑等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。各向異性顆粒主要分為Janus型顆粒[59]、Patchy型顆粒和多組分顆粒，其中，最常見的是Janus顆粒。Janus顆粒是指在同一個(gè)顆粒上有兩個(gè)不同性質(zhì)的部分，并且具有非中心對(duì)稱結(jié)構(gòu)。液滴微流控技術(shù)可以制備結(jié)構(gòu)可控的單分散顆粒，是制備Janus粒子的重要手段。

SUN等[60]設(shè)計(jì)了一種流動(dòng)聚焦微流控芯片，將PLGA和氫化椰油甘油酯溶解在二氯甲烷中作為分散相，PVA溶液作為連續(xù)相，生成水包油液滴，通過(guò)溶劑蒸發(fā)誘導(dǎo)相分離，使液滴固化形成Janus微球。如圖22所示，每個(gè)微球都有PLGA和脂質(zhì)材料兩個(gè)腔室，通過(guò)調(diào)節(jié)兩個(gè)腔室的比例，微球結(jié)構(gòu)也可靈活地改變?yōu)槠瑺睢⑷龑?、四層或核殼式。所選擇的脂質(zhì)材料在生理溫度下會(huì)從固態(tài)變?yōu)橐簯B(tài)，使藥物快速釋放；而PLGA腔室會(huì)緩慢降解，從而實(shí)現(xiàn)了藥物快速和持續(xù)釋放的結(jié)合。WANG等[61]利用微流控芯片中流體為層流的特點(diǎn)成功地制備了具有pH響應(yīng)特性的PAA-ETPTA Janus微球。通過(guò)調(diào)節(jié)流速比和表面活性劑在連續(xù)油相中的濃度，可以調(diào)節(jié)微球結(jié)構(gòu)和形貌。在不同pH條件下，包封的羅丹明B染料和PS納米顆粒的裝載率和釋放率不同，緩釋率隨pH值的增加而增大，且得到的Janus微球具有較高的穩(wěn)定性。

圖22 制備Janus微球的芯片結(jié)構(gòu)示意圖[60]

相對(duì)于傳統(tǒng)的藥物載體制備方法，微流控技術(shù)不僅可以構(gòu)建各種結(jié)構(gòu)的微球，還能封裝不同性質(zhì)的藥物，豐富和拓展了微球的應(yīng)用領(lǐng)域。然而，該制備技術(shù)存在制備效率較低、難以大批量化生產(chǎn)的缺點(diǎn)。如何提高載藥微球的制備效率、實(shí)現(xiàn)高效率的批量生產(chǎn)是未來(lái)可控釋放的藥物載體制備研究的主要方向。

3 總結(jié)與展望

微流控技術(shù)由于具備優(yōu)異的微尺度界面調(diào)控性能，近年來(lái)在生命科學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用。本文以微流控技術(shù)為研究對(duì)象，從生物檢測(cè)、體外結(jié)構(gòu)仿生制造及可控釋放的藥物載體制備三方面介紹了微流控技術(shù)在機(jī)械工程-生命科學(xué)交叉領(lǐng)域的研究成果及應(yīng)用現(xiàn)狀。微流控技術(shù)能夠減少樣品使用劑量、實(shí)現(xiàn)高通量和高效檢測(cè)，而且能夠體外培養(yǎng)細(xì)胞、模擬人體組織和器官功能以及制備載藥微顆粒，為藥物和疫苗研發(fā)、生物安全性評(píng)估等生物醫(yī)學(xué)研究提供了新的研究思路。

目前微流控技術(shù)在生命科學(xué)領(lǐng)域的交叉應(yīng)用仍存在諸多挑戰(zhàn)，主要來(lái)自于以下幾個(gè)方面：首先是芯片的加工，超精密的微流控芯片加工難度大、成本極高，專用加工設(shè)備種類少，因此開發(fā)面向微流控芯片的加工設(shè)備依然任重而道遠(yuǎn)；其次，在生命科學(xué)過(guò)程中既要構(gòu)建個(gè)體化外形和可控內(nèi)部結(jié)構(gòu)，還需形成與人體組織器官相匹配的生物力學(xué)性能，同時(shí)保證材料表面或內(nèi)部的信息傳遞等。伴隨著先進(jìn)制造技術(shù)的不斷革新，未來(lái)微流控技術(shù)會(huì)朝向智能化、集成自動(dòng)化發(fā)展。

(1)智能化：將人工智能與微流控技術(shù)相結(jié)合，通過(guò)環(huán)境感知，實(shí)現(xiàn)智能動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，可有效提高生物檢測(cè)過(guò)程的質(zhì)量和效率。

(2)集成自動(dòng)化：探究新材料、新工藝，開發(fā)各類模塊化單元，將模塊化的功能單元與控制系統(tǒng)集成于一體，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化操作。

相信在不久的將來(lái)，隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，以微流控技術(shù)為核心的微機(jī)電系統(tǒng)技術(shù)將不斷革新，更加廣泛地應(yīng)用于生命科學(xué)研究中。