詹重清

（福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院 國(guó)家加工食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，福建 福州 350002）

有機(jī)磷酸酯（Organophosphate Esters，OPEs）是一種用途廣泛的添加材料，具有阻燃、潤(rùn)滑、消泡、耐熱、增塑、耐腐蝕等性能，主要應(yīng)用于建材、紡織、玩具、電子元器件及食品行業(yè)中[1-3]。有機(jī)磷酸酯類化合物在使用時(shí)主要是通過(guò)物理方式添加到產(chǎn)品中，因此，OPEs與各類材料的結(jié)合并不牢固，在使用過(guò)程中能夠通過(guò)磨損、揮發(fā)等方式擴(kuò)散逃逸到環(huán)境中[4]。2011～2018年全球的有機(jī)磷酸酯使用量從50萬(wàn)噸增加到280萬(wàn)噸[5]，這給環(huán)境保護(hù)帶來(lái)了不小的壓力和挑戰(zhàn)。當(dāng)前，已有報(bào)道指出在水體、大氣、室內(nèi)灰塵、土壤沉積物、動(dòng)植物以及人體內(nèi)檢測(cè)出了相當(dāng)含量的OPEs[3，6-12]，同時(shí)，也有研究指出有機(jī)磷酸酯類化合物有神經(jīng)和生殖毒性，能夠致癌、干擾內(nèi)分泌等[13,14]。

白酒是日常生活中一種不可或缺的飲品，有資料顯示2017～2019年中國(guó)白酒年產(chǎn)量均大于786萬(wàn)千升[15-17]，隨著生活水平的提高，人們對(duì)白酒的安全問(wèn)題也愈發(fā)關(guān)注，特別是以前容易被忽視的持久性有機(jī)污染物（POPs）所帶來(lái)的威脅。POPs并非在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生，而可能是由釀造過(guò)程中所使用的原材料（如含有OPEs的水體、谷物等）、所接觸的器具（如塑料的接酒桶、輸酒管、乳膠管以及包裝材料中的塑料制品等）。

雖然已有研究顯示在白酒中檢測(cè)出鄰苯二甲酸酯等塑化劑，但是目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)有關(guān)白酒中有機(jī)磷酸酯分析檢測(cè)技術(shù)的文獻(xiàn)報(bào)道和標(biāo)準(zhǔn)，這使人們無(wú)法了解白酒中OPEs類持久性污染物的主要來(lái)源以及污染水平。同時(shí)，由于其在白酒中污染水平數(shù)據(jù)的極度匱乏，相關(guān)國(guó)家機(jī)關(guān)部門無(wú)法進(jìn)行有效評(píng)估、制定白酒中OPEs持久性污染物含量的合理限值水平。

未來(lái)，不排除將OPEs類持久性污染物納入到我國(guó)的標(biāo)準(zhǔn)監(jiān)管體系中，因此，建立白酒中的OPEs這類持久性有機(jī)污染物的分析監(jiān)測(cè)方法，不僅可以監(jiān)測(cè)有機(jī)磷酸酯在白酒中的含量水平以及遷移情況，保護(hù)人體健康，也有利于規(guī)范白酒生產(chǎn)工藝，為企業(yè)發(fā)展、政府部門監(jiān)管市場(chǎng)提供技術(shù)支撐。

當(dāng)前，對(duì)白酒中有機(jī)污染物檢測(cè)的前處理技術(shù)主要有LLE（液液萃?。?、SPE（固相萃?。?、UAE（超聲輔助萃?。?、SPME（固相微萃取法）及QuEChERS等[18-21]，而在OPEs的檢測(cè)方法中，以配有氮磷檢測(cè)器的氣相色譜（GC-NPD）、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（GC-MS）、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC-MS/MS）為主[22]。相比其他三種提取方式，LLE（液液萃?。┚哂胁僮鞲?jiǎn)便的特點(diǎn)在食品安全領(lǐng)域、環(huán)境及生物檢測(cè)等方面得到廣泛應(yīng)用；在靈敏度方面，GC-MS/MS的反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式較GC-MS更優(yōu)良，在基質(zhì)對(duì)檢測(cè)的影響方面，其電子轟擊源電離比LC-MS/MS更低，而且它還具有高分辨率、高重現(xiàn)性等特點(diǎn)。綜合以上技術(shù)方法的優(yōu)劣，本研究建立了液液萃取結(jié)合GC-MS/MS檢測(cè)白酒中8種OPEs的分析方法，該方法簡(jiǎn)便、快速、經(jīng)濟(jì)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（7890A-7000D，美國(guó)安捷倫），配EI源；HP-5 ms Ultra Inert彈性的石英毛細(xì)管柱（30 m×250μm×0.25μm，美國(guó)安捷倫）；電子天平[BSA224S型，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]；48位全自動(dòng)平行濃縮儀（AutoEVA-60，廈門?？朴邢薰荆粓A周振蕩器（IKA）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀器（IKA）、低溫冷卻循環(huán)泵（DLSB-5/20,鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）。

8 種有機(jī)磷酸酯標(biāo)準(zhǔn)品：磷酸三正丁酯（TBP）、磷酸丁氧基乙基酯（TBEP）、磷酸三苯酯（TPP）均購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司；磷酸三（2-氯乙基）酯（TCEP）、磷酸三鄰甲苯酯（o-TCP）、氘代磷酸三苯酯（TPP-d15）均購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；磷酸二苯基-2-乙基己酯（EHDPP）、磷酸三間甲苯酯（m-TCP）、磷酸三對(duì)甲苯酯（p-TCP）均購(gòu)自梯希愛(ài)（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司。

正己烷為分析純，購(gòu)于天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；無(wú)水硫酸鈉、氯化鈉、丙酮、二氯甲烷和乙酸乙酯均為分析純，均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

有機(jī)濾膜（0.45μm，天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。白酒樣品（由福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院提供）。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制

準(zhǔn)確稱取適量TBP、TCEP、TBEP、TPP、EHDPP、o-TCP、m-TCP、p-TCP標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL的容量瓶中，用丙酮配置成濃度為1000μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置4 ℃冰箱保存，使用時(shí)再逐級(jí)稀釋配成所需濃度的標(biāo)準(zhǔn)液。

稱取適量的TPP-d15標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL容量瓶中，用丙酮配置成濃度為10μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液。

1.3 樣品前處理

分別取5 g酒樣于25 mL的離心管內(nèi)，加入0.6 g氯化鈉，在渦旋振蕩器上渦旋1 min，再加入4 mL的純凈水，用5 mL乙酸乙酯進(jìn)行提取，再在渦旋振蕩器上渦旋5 min，然后靜置5～10 min。吸取離心管上層乙酸乙酯到另一個(gè)10 mL試管中，并再一次用5 mL乙酸乙酯提取，合并2次的乙酸乙酯，加入0.5 g無(wú)水硫酸鈉后于渦旋振蕩器上渦旋1 min，最后在40 ℃的溫度下用小氣流的氮?dú)獯抵? mL以下，再用乙酸乙酯定容為1.0 mL，加入10μL的內(nèi)標(biāo)物（TPP-d15），待進(jìn)樣檢測(cè)。

1.4 分析條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱：HP-5 ms Ultra Inert（30 m×250μm×0.25 μm）；載氣：氦氣；進(jìn)樣口溫度：250 ℃。

程序升溫：初始60 ℃，保持1 min；然后以40 ℃/min升溫到170 ℃，保持1 min；再以10 ℃/min升溫到310 ℃并保持5 min；色譜柱流量：1 mL/min；進(jìn)樣量：1 μL；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣。

1.4.2 質(zhì)譜條件

離子源：電子轟擊離子源（EI）；離子源溫度：280 ℃；電離能量：70eV；連接線溫度：280 ℃；溶劑延遲時(shí)間：2.8 min；掃描方式：MRM。主要OPEs的質(zhì)譜參數(shù)及保留時(shí)間見(jiàn)表1。

2 結(jié)果和討論

2.1 氣相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜條件的優(yōu)化

設(shè)置成全掃描模式，調(diào)節(jié)升溫程序，實(shí)現(xiàn)5μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)品（8種有機(jī)磷酸酯化合物、1種氘代有機(jī)磷酸酯化合物）中目標(biāo)物基線的良好分離，通過(guò)利用譜庫(kù)檢索功能對(duì)8種有機(jī)磷酸酯進(jìn)行辨別和確定，根據(jù)已得到的8種有機(jī)磷酸酯的保留時(shí)間進(jìn)一步對(duì)本實(shí)驗(yàn)所需要的色譜條件進(jìn)行調(diào)整和優(yōu)化。全掃描模式下，將提取到的8種有機(jī)磷酸酯所具有的特征性離子作母離子，對(duì)母離子分別施加5～30 eV碰撞能量，掃描辨識(shí)具有特征性的子離子，依次調(diào)整碰撞能以篩選最適合的碰撞能值，最終確定9種有機(jī)磷酸酯的最優(yōu)化的母離子對(duì)、子離子對(duì)以及最適合的碰撞能量。然后再用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描（MRM) 實(shí)現(xiàn)對(duì)有機(jī)磷酸酯類化合物的準(zhǔn)確定量分析。9 種有機(jī)磷酸酯的多選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)信息見(jiàn)表1，結(jié)果表明在10 min內(nèi)，9種有機(jī)磷酸酯可以全部實(shí)現(xiàn)良好的分離。

2.2 提取溶劑的優(yōu)化

有機(jī)磷酸酯的極性范圍較大，logKow（辛醇水系數(shù)）在1.44～6.64的范圍之間（表2）。為實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的快速檢測(cè)以及確保對(duì)目標(biāo)物有較好的提取效果，本研究采取液液萃?。↙LE）的提取方法。

本研究對(duì)使用不同極性的正己烷、乙酸乙酯和二氯甲烷等有機(jī)溶劑提取白酒中8種有機(jī)磷酸酯的效果進(jìn)行了評(píng)估，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)按照1.4的方法進(jìn)行操作，均能夠使目標(biāo)物快速進(jìn)行提取。圖1為3種有機(jī)溶劑對(duì)8種有機(jī)磷酸酯目標(biāo)物的提取回收率的對(duì)比，從圖中可以看出，除了正己烷對(duì)TCEP的提取回收率較低外，其余2種對(duì)TCEP的提取回收率都較高。由于二氯甲烷對(duì)人體和環(huán)境有害，因此，本實(shí)驗(yàn)最終選擇乙酸乙酯作為L(zhǎng)LE萃取劑。

圖1 3種不同溶劑的提取效果

同時(shí)，實(shí)驗(yàn)表明乙酸乙酯分2次提取相比1次提取可以顯著提高有機(jī)磷酸酯的回收率，而且使用乙酸乙酯作為萃取溶劑在節(jié)省溶劑用量同時(shí)還比較環(huán)保。

2.3 線性回歸方程、檢測(cè)限和定量限

在優(yōu)化后的實(shí)驗(yàn)條件下，本研究采用TPP-d15為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，以內(nèi)標(biāo)法對(duì)TBP、TCEP、TBEP、TPP、EHDPP、o-TCP、m-TCP和p-TCP這8種有機(jī)磷酸酯進(jìn)行定量分析。對(duì)濃度為5、10、25、50、100、250、500μg/L的標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行測(cè)定，以O(shè)PEs與TPP-d15的峰面積之比為縱坐標(biāo)，以兩者的濃度之比建立橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸分析，并作標(biāo)準(zhǔn)曲線。二者的線性相關(guān)系數(shù)均大于0.998，檢出限是0.031～0.41μg/kg ，定量限是0.10～1.4μg/kg。其中，目標(biāo)化合物的峰高為噪聲3倍（S/N=3）時(shí)所對(duì)應(yīng)的濃度是檢測(cè)限，為噪聲10倍（S/N=10）對(duì)應(yīng)的濃度是定量限。表3是所測(cè)8種有機(jī)磷酸酯的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、方法檢測(cè)限和定量限及相關(guān)系數(shù)。

表3 8種OPEs的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程及其相關(guān)系數(shù)、方法檢出限和定量限

2.4 精密度、準(zhǔn)確度和回收率

本研究中，在空白白酒樣品分別添加2.0、5.0、10.0μg/kg的3個(gè)濃度水平進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，對(duì)每個(gè)濃度水平的平行試驗(yàn)都進(jìn)行6次，按前述1.4的操作方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)處理，表4為試驗(yàn)結(jié)果。表4可知，白酒中8種有機(jī)磷酸酯的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別在77.2%～96.8%和3.1%～8.9%之間，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)建立起的白酒中8種有機(jī)磷酸酯的檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性都較高，可以對(duì)實(shí)際白酒樣品進(jìn)行檢測(cè)。圖2為空白白酒中添加量為10μg/kg的總離子流圖。

表4 白酒中8種OPEs的回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）

圖2 白酒中添加量為10μg/kg的總離子流圖

2.5 實(shí)際樣品的檢測(cè)

采用本方法對(duì)市場(chǎng)上的20份白酒樣品進(jìn)行8種有機(jī)磷酸酯的檢測(cè)分析，結(jié)果顯示有機(jī)磷酸酯均未在樣品中檢出。

3 結(jié)論

本研究建立了液液萃取結(jié)合氣相色譜法－三重四極桿質(zhì)譜對(duì)白酒中的8種有機(jī)磷酸酯化合物（TBP、TCEP、TBEP、TPP、EHDPP、o-TCP、m-TCP、p-TCP）進(jìn)行快速檢測(cè)的分析方法，優(yōu)化了方法的提取方式、萃取溶劑等檢測(cè)條件，采取內(nèi)標(biāo)（TPPd15）進(jìn)行定量分析，減少了基質(zhì)的干擾。通過(guò)對(duì)方法學(xué)評(píng)價(jià)的結(jié)果進(jìn)行分析，可以了解到本研究所建立的檢測(cè)方法的準(zhǔn)確度和精密度都較高，TBP、TCEP、TBEP、TPP、EHDPP、o-TCP、m-TCP和p-TCP的加標(biāo)回收率在77.2%～96.8%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.1%～8.9%，方法檢測(cè)限檢出限為0.031～0.41 μg/kg，定量限為0.10～1.4μg/kg。本實(shí)驗(yàn)方法在前處理過(guò)程中操作步驟簡(jiǎn)便、快速，同時(shí)質(zhì)譜儀器分析的時(shí)間僅需10 min，適用于白酒樣品中有機(jī)磷酸酯類有機(jī)污染物的快速、準(zhǔn)確檢測(cè)。