張愛菊，白瑩，薛林科，戴興德，張小林，董娜

甘肅醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，甘肅 平?jīng)?744000

過氧化氫酶（catalase，CAT）廣泛存在于人體內(nèi)［1-4］，CAT 活度是與抗腫瘤及抗衰老密切相關(guān)的酶學(xué)指標(biāo)，已納入臨床常規(guī)檢測。CAT 活度測定方法有紫外-可見光度法、滴定法等［5-7］，近年研發(fā)的顯色光度法和褪色光度法備受關(guān)注［8-12］，其中顯色光度法的顯色劑溶液需現(xiàn)用現(xiàn)配，難以滿足臨床快速檢驗要求；褪色光度法的準(zhǔn)確度相對較低。因此，亟需研發(fā)一種高效、快速、實(shí)用的新方法。

熒光檢測法具有背景信號小、靈敏度及準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)，已應(yīng)用于活度分析［13-14］?；贔enton 試劑（H2O2／Fe2+）作用下的熒光試劑臧紅 T（safranine T，ST）在 575 nm 發(fā)射波長處有最大熒光峰［15-19］，本研究利用CAT 對H2O2氧化ST 反應(yīng)具有抑制作用的原理，建立測定CAT 活度的熒光猝滅法，該方法分為酶促反應(yīng)和熒光猝滅反應(yīng)2個階段，并對方法中的酶促反應(yīng)和熒光猝滅反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，以期將建立的方法應(yīng)用于CAT 活度的臨床快速檢測。

1 材料與方法

1.1 血清 人血清樣品（共6 份，編號1 ～6，性別分別為男、女、男、女、男、女，年齡分別為 8、8、38、38、69、69歲）由甘肅醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院體檢中心提供。

1.2 主要試劑及儀器 30%的雙氧水（分析純）購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；CAT 固體（生物試劑，標(biāo)示量 ≥ 3 000 U ／ mg）購自如吉生物科技發(fā)展有限公司；ST 固體（生物試劑）購自天津市大茂化學(xué)試劑廠；FeSO·47 H2O 固體（分析純）購自福晨化學(xué)試劑有限公司；930N 熒光分光光度計購自上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 溶液配制 H2O2底液：用蒸餾水將0.50 mL 30%的雙氧水稀釋至250 mL，高錳酸鉀法測定其濃度，根據(jù)測定值稀釋至 1 mmol ／ L（即 1 μmol ／ mL）；CAT 標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取CAT 固體5 mg，蒸餾水定容至100 mL，高錳酸鉀法測定其活度，根據(jù)測定結(jié)果稀釋為 1 U ／ mL；ST 溶液：稱取 0.701 6 g ST 固體，蒸餾水定容至 1 000 mL，即濃度為 2 mmol ／ L；Fe2+溶液：稱取0.695 0 g FeSO·47 H2O 固體，用蒸餾水溶定容至250 mL，即濃度為 0.01 mol ／ L。

1.4 方法的建立 取人體血清25 ～100 μL，置50 mL容量瓶中，加入H2O2底液，30 ℃恒溫反應(yīng)；立即加入催化劑和ST，室溫反應(yīng)后定容。以ST 空白作參比，在1 cm 吸收池中測定575 nm 發(fā)射波長處熒光強(qiáng)度F，同步測定酶空白體系F（0在H2O2之前加入Fe2+完成酶失活，其他方法同上），CAT 活度E 由△F（F - F0）、標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、樣品稀釋倍數(shù)計算確定。用 μmol ／ mL（U ／ mL）表示酶活度，即 1 mL 酶液所能分解過氧化氫物質(zhì)的量（μmol）。

1.5 熒光猝滅反應(yīng)條件優(yōu)化

1.5.1 催化劑的確定 取4個50 mL 容量瓶，分別加入 ST、H2O2+ST、H2O2+ST+Fe3+、H2O2+ST+Fe2+，其中 ST 為 3.00 mL，H2O2為 1.00 mL，F(xiàn)e3+和 Fe2+均為0.80 mL，室溫反應(yīng)15 min，蒸餾水定容，按1.4項方法測定F。

1.5.2 催化劑用量的確定 取7個50 mL 容量瓶，均加入1.00 mL H2O2及3.00 mL 的ST，再分別加入0.00 ～ 1.20 mL 的 Fe2+溶液，室溫反應(yīng) 15 min，蒸餾水定容，按1.4 項方法測定F。

1.5.3 ST 用量的確定 取7個50 mL 容量瓶，分別加入0 ～6 mL 的ST，蒸餾水定容，按1.4 項方法測定F。

1.5.4 硫酸用量的確定 取6個50 mL 容量瓶，均加入 1.00 mL H2O2、0.80 mL Fe2+和 3.00 mL ST，分別加入0 ～1 mL 的硫酸，室溫反應(yīng)15 min，蒸餾水定容，按1.4 項方法測定F。同時設(shè)ST 對照（僅加ST，不加 H2O2和 Fe2+）。

1.5.5 熒光猝滅時間的確定 取12個50 mL 容量瓶，均加入 1.00 mL H2O2、0.80 mL Fe2+和 3.00 mL ST，于室溫分別反應(yīng) 0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0、20.0、30.0、40.0、50.0、60.0 min，蒸餾水定容，按1.4 項方法測定F。

1.6 酶促反應(yīng)條件的優(yōu)化

1.6.1 反應(yīng)底物H2O2用量的確定 取11個50 mL容量瓶，分別加入 0.00、0.25、0.05、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75、2.00、2.50、3.00 mL 的 H2O2，再加入0.80 mL Fe2+和 3.00 mL ST，室溫反應(yīng) 15 min，蒸餾水定容，按1.4 項方法測定F。

1.6.2 酶促反應(yīng)時間的確定 取7個50 mL 容量瓶，均加入1.00 mL CAT 標(biāo)準(zhǔn)溶液及1.00 mL 的H2O2底液，室溫分別反應(yīng)0 ～30 min，蒸餾水定容，按1.4 項方法測定△F。

1.7 方法的驗證

1.7.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 取CAT 標(biāo)準(zhǔn)溶液0、125、250、375、500、750、1 000 μL，按 1.4 項方法測定 F，計算△F 和 CAT 活度，以 CAT 活度（U ／ mL）為橫坐標(biāo)，△F 為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；平行測定酶空白10次，計算標(biāo)準(zhǔn)偏差，標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率除以3 倍的標(biāo)準(zhǔn)偏差獲得檢測限。

1.7.2 干擾試驗 取1.00 mL CAT 標(biāo)準(zhǔn)溶液，置50 mL容量瓶，按1.4 項方法檢測酶活度；另取1.00 mL CAT標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入濃度小于H2O2底液1 ／ 2 的共存還原性物質(zhì)（1 mmol ／ L Vc、葡萄糖、果糖、乳糖、半乳糖各0.5 mL），按1.4 項方法檢測酶活度。

1.7.3 準(zhǔn)確性 取編號1 ～3 的人血清樣品，分別加入終濃度 5.0 U ／ mL 的 CAT 標(biāo)準(zhǔn)溶液；取編號 4 ～ 6的人血清樣品，分別加入終濃度10.0 U ／ mL 的CAT標(biāo)準(zhǔn)溶液。按建立的方法檢測CAT 活度，每份樣品檢測6次，并按下式計算回收率。

回收率（%）=（加標(biāo)樣品檢測值-未加標(biāo)樣品檢測值）／加標(biāo)樣品檢測值× 100%

2 結(jié) 果

2.1 熒光猝滅條件的優(yōu)化

2.1.1 最佳催化劑 在ST 基礎(chǔ)上單純加入H2O2，反應(yīng)不明顯，熒光強(qiáng)度下降幅度僅為5%；Fe3+對H2O2氧化ST 無催化作用，熒光強(qiáng)度保持不變；加入Fe2+后，ST 熒光猝滅，猝滅率達(dá)70%。見圖1。表明Fe2+可有效降低H2O2的分解活化能，產(chǎn)生更具氧化功能的羥自由基。因此選擇Fe2+作為催化劑。

圖1 催化劑的優(yōu)化結(jié)果Fig.1 Optimization of catalyzer

2.1.2 最佳Fe2+用量 Fe2+溶液體積為0.00 mL時，ST 與 H2O2幾乎不反應(yīng)；Fe2+溶液體積在 0.10 ～0.80 mL 范圍內(nèi)時，熒光猝滅反應(yīng)程度直接取決于Fe2+用量；Fe2+溶液體積 ＞ 0.80 mL 時，高濃度 Fe2+將促使H2O2分解，熒光猝滅反應(yīng)受抑制。見圖2。因此，確定催化劑Fe2+的最佳用量為0.80 mL。

圖2 Fe2+用量的優(yōu)化結(jié)果Fig.2 Optimization of dosage of Fe2+

2.1.3 最佳ST 用量 隨著ST 體積的增加，F(xiàn) 逐漸升高，2 mmol ／ L ST 溶液在 0.00 ～ 3.00 mL 范圍內(nèi)與熒光強(qiáng)度呈線性關(guān)系，見圖3。因此確定ST 最佳體積為為3.00 mL。

圖3 ST 用量的優(yōu)化結(jié)果Fig.3 Optimization of dosage of ST

2.1.4 最佳硫酸用量 隨著硫酸加入體積的增大，高酸度使ST 質(zhì)子化效應(yīng)增強(qiáng)，熒光強(qiáng)度減弱；ST 猝滅反應(yīng)體系受H2SO4影響較小，熒光強(qiáng)度基本保持恒定。即H2SO4取0.00 mL 時，ST 對照溶液的pH為4.82，ST 猝滅反應(yīng)體系的pH 為4.11，相對熒光強(qiáng)度變化量達(dá)最大。見圖4。因此，確定熒光猝滅反應(yīng)不需加入硫酸（pH 范圍為4.11 ～4.82）。

圖4 硫酸用量的優(yōu)化結(jié)果Fig.4 Optimization of dosage of sulfuric acid

2.1.5 最佳熒光猝滅時間 隨著熒光猝滅時間的延長，F(xiàn) 快速下降。猝滅時間在2.5 ～10 min 內(nèi)，與F 呈線性關(guān)系，15 min 后F 降至最低并趨于恒定，60 min 內(nèi)F 保持不變。見圖5。因此，確定最佳猝滅時間為15 min。

圖5 熒光猝滅反應(yīng)時間的優(yōu)化結(jié)果Fig.5 Optimization of time for fluorescence quenching

2.2 酶促反應(yīng)條件優(yōu)化

2.2.1 反應(yīng)底物H2O2的最佳用量 隨著H2O2加入量的增加，F(xiàn) 逐漸降低。H2O2加入量在0.00 ～1.00 mL 范圍內(nèi)時，其體積與F 呈良好的線性關(guān)系；H2O2加入量＞1.50 mL 時，熒光猝滅程度降低。見圖6。因此，確定H2O2溶液的最佳用量為1.00 mL。

圖6 底液H2O2 用量的優(yōu)化結(jié)果Fig.6 Optimization of consumption of H2O2

2.2.2 最佳酶促反應(yīng)時間 酶促時間在0 ～5 min內(nèi)與△F 成線性；延長至10 min 后，△F 趨于恒定。見圖7。因此確定酶促反應(yīng)時間為10 min。

圖7 酶促反應(yīng)時間的優(yōu)化結(jié)果Fig.7 Optimization of time for enzymatic reaction

2.3 方法的驗證

2.3.1 線性范圍 CAT 活度的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖8。CAT 活度在 5 × 10-5～ 0.02 U ／ mL 范圍內(nèi)，與△F 呈良好的線性關(guān)系，線性方程為y=180 7 x + 0.752 7，r = 0.998 0，檢測限為 3.81 × 10-5U ／ mL。

圖8 CAT 活度的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.8 Standard curve for determination of catalase activity

2.3.2 干擾試驗 未加干擾物質(zhì)時，CAT 活度為0.02 U ／ mL；當(dāng)反應(yīng)液中存在 1 × 10-5mol ／ L 的 Vc、葡萄糖、果糖、乳糖、半乳糖時，CAT 活度分別為0.020 5、0.020 2、0.020 6、0.020 1、0.020 3 U ／mL，測定誤差＜5%。

2.3.3 準(zhǔn)確性 6 份血清加標(biāo)樣品的檢測值在40.7 ～ 69.7 U ／ mL 范圍內(nèi)，加標(biāo)回收率為 98.0% ～102.0%，均在95% ～105%范圍內(nèi)，見表1。表明該方法具有良好的準(zhǔn)確性。

表1 準(zhǔn)確性驗證結(jié)果Tab.1 Verification for accuracy

3 討 論

ST 是一種水溶性偶氮染料，帶黃紅色熒光，具有一定的還原性。H2O2具有一定的氧化能力，在Fe2+的作用下，形成更具氧化性的羥基自由基，使ST 熒光猝滅，猝滅程度取決于H2O2的含量；CAT 是H2O2的專用分解酶，CAT 使熒光猝滅受抑制，因此加CAT 前后熒光變化可表明CAT 活度。

本研究建立了血清CAT 活度的ST 熒光猝滅檢測法，并對ST 熒光猝滅反應(yīng)和酶促反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明，最佳催化劑為Fe2+，用量為0.80 mL；ST 用量為 3.00 mL；熒光猝滅反應(yīng) pH 范圍為4.11 ～4.82，不需加入硫酸；猝滅時間為15 min；H2O2溶液用量為1.00 mL；酶促反應(yīng)時間為10 min。兩個反應(yīng)環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)，反應(yīng)快速，測定過程更為簡化。同時，對建立的方法進(jìn)行了驗證，結(jié)果表明，CAT活度在 5 × 10-5～ 0.02 U ／ mL 范圍內(nèi)，與△F 呈良好的線性關(guān)系，線性方程為y = 180 7 x + 0.752 7，r = 0.998 0，檢測限為 3.81 × 10-5U ／ mL；檢測體系液中存在 1 × 10-5mol ／ L 的 Vc、葡萄糖、果糖、乳糖、半乳糖時測定誤差為＜5%，由于人體血清樣品每次取樣約50 μL，即樣品中上述干擾物的濃度控制在10 mmol ／ L 以內(nèi)時，不影響酶活度測定；6 份血清加標(biāo)樣品的回收率均在95% ～105%范圍內(nèi)，與文獻(xiàn)［20］結(jié)果一致，并發(fā)現(xiàn)正常人血清CAT 活度與年齡相關(guān)，兒童及老年人血清中的CAT 活度較高，由于檢測樣品數(shù)量較少，該結(jié)論有待進(jìn)一步驗證。

綜上所述，本研究建立的方法具有良好的準(zhǔn)確性，檢測限更低，進(jìn)一步克服了血清樣品共存還原性物質(zhì)的干擾，且操作程序簡便，可直接用于人體血清CAT 活度分析，用于臨床疾病診斷，具有廣闊的應(yīng)用前景。今后，將進(jìn)行大范圍血清樣品的CAT 活度分析，包括正常人、臨床患者等，針對性別、年齡及患者疾病類型進(jìn)行系統(tǒng)分析，進(jìn)一步探討CAT 活性與患者疾病間的相關(guān)性；另外，還將對方法的實(shí)驗條件和試劑用量等進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，為研發(fā)低成本、實(shí)用性好的血清熒光試劑盒奠定基礎(chǔ)。