蔣 純，劉書帆，何晶晶，鄭立文，吳曉妹，蔣亞超

(1 南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院，湖南 衡陽 421002；2 湘南學(xué)院，湖南 郴州 423099)

紫花地丁(Viola yedoensis)味苦、辛，性寒，為堇菜科堇菜屬植物紫花地丁的干燥帶根全草，主要功效為清熱解毒、涼血消腫[1]。國內(nèi)外研究表明紫花地丁主要成分為黃酮類化合物，已分離出幾十種個黃酮苷類成分，具有具有抗菌、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗病毒、抗氧化、抗腫瘤等多種藥理活性[2-5]。工業(yè)上黃酮類化合物以回流提取和超聲提取為主，其中酶解輔助-超聲提取法即可保證提取率，同時催化反應(yīng)條件溫和，更有利于黃酮類化合物穩(wěn)定[6]，因此酶解輔助-超聲提取紫花地丁總黃酮工藝研究具有實際研究價值。

1 儀器與材料

UV-1280紫外可見分光光度計，日本島津；ATX124電子分析天平，日本島津；KM-600DE超聲清洗器，昆山美美超聲儀器有限公司。

亞硝酸鈉，無水乙醇，氫氧化鈉，硝酸鋁等均為分析純。紫花地丁為湖南省郴州4月采摘，經(jīng)湘南學(xué)院藥學(xué)院蔣亞超主管藥師鑒定為正品；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(LC220726)，純度≥98%(HPLC)，購自合肥博美生物科技有限公司；纖維酶(10萬U/g)和果膠酶(5萬U/g)均購自山東隆科特酶制劑有限公司。

2 實驗方法

2.1 溶液的配置

2.1.1 酶溶液的配制

精密稱取含纖維酶、果膠酶各0.5 g放入100 mL容量瓶中，加蒸餾水40 mL溶解后，用無水乙醇定容至刻度線，即得纖維酶、果膠酶各5 mg/mL的60%乙醇溶液。

2.1.2 供試品的制備

取新鮮紫花地丁，50 ℃烘箱干燥，粉碎機打粉。精密稱定紫花地丁粉末5 g，置于錐形瓶中，加入60%乙醇40 mL和混合酶溶液10 mL，pH值調(diào)至3.5，催化反應(yīng)10 min，在35 ℃條件下超聲提取20 min，60%乙醇補足減失重量，濾紙過濾，即得含量為0.1 g/ mL供試品，取續(xù)濾液1.5 mL，按標(biāo)準(zhǔn)曲線法測量吸光度。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

精密稱量蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品18.2 mg于50 mL容量瓶中，60%乙醇稀釋、定容至刻度，得0.364 mg/ mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品。精密吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液 1，2，3，4，5，6 mL分別置于25 m L容量瓶中，加入5%亞硝酸鈉溶液 1.0 mL，搖勻，放置5 min，再加入10%硝酸鋁溶液1.0 mL，搖勻，放置5 min，再加入4%的氫氧化鈉溶液10.0 mL，加入60%乙醇至刻度，搖勻，靜置 15 min。隨行試劑為空白，λ=501 nm處測定吸光度，以含量為縱坐標(biāo)，以吸光度A為橫坐標(biāo)，作蘆丁總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：Y=87.533X-4.8611； R2=0.9991。如圖1所示。

圖1 紫花地丁總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of total flavones of Rhoditin

2.3 酶解輔助超聲法研究

精密稱取2份紫花地丁粉末5 g，分別置于250 mL具塞錐形瓶中，一份加酶溶液10 mL，另一份不加酶溶液，其他步驟按2.1.2，2.2進(jìn)行提取、顯色測量吸光度。得酶解輔助超聲提取比單純超聲提取率高89.4%；詳見表1所示。

表1 酶解輔助超聲法結(jié)果Table 1 Results of enzymolysis assisted ultrasound method

2.4 單因素考察

2.4.1 單因素考察pH的影響

精密稱取5份紫花地丁粉末5 g，置于250 mL具塞錐形瓶中，pH值分別調(diào)至2.5、3.5、4.5、5.5、6.5，其他步驟按2.1.2，2.2進(jìn)行提取、顯色測量吸光度。

2.4.2 提取溫度

精密稱取5份紫花地丁粉末5 g，置于250 mL具塞錐形瓶中，超聲溫度分別調(diào)至35、40、45、50 、55 ℃，其他步驟按2.1.2，2.2進(jìn)行提取、顯色測量吸光度。

2.4.3 提取時間

精密稱取5份紫花地丁粉末5 g，置于250 mL具塞錐形瓶中，超聲提取時間分別為10、20、30、40、50 min，其他步驟按2.1.2，2.2進(jìn)行提取、顯色測量吸光度。

2.4.4 乙醇濃度

精密稱取5份紫花地丁粉末5 g，置于250 mL具塞錐形瓶中，提取乙醇濃度分別為40%、50%、60%、70%、80%，其他步驟按2.1.2，2.2進(jìn)行提取、顯色測量吸光度。

2.4.5 液料比

精密稱取5份紫花地丁粉末5 g，置于250 mL具塞錐形瓶中，料液比分別用1:5，1:10，1:15，1:20，1:25，其他步驟按2.1.2，2.2進(jìn)行提取、顯色測量吸光度。

2.4.6 酶用量

精密稱取5份紫花地丁粉末5 g，置于250 mL具塞錐形瓶中，酶用量分別用5 mL，10 mL，15 mL，20 mL，25 mL，用60%乙醇溶液補至總液量為50 mL，其他步驟按2.1.2，2.2進(jìn)行提取、顯色測量吸光度。

2.5 正交設(shè)計實驗

根據(jù)單因素實驗結(jié)果綜合考慮，設(shè)定乙醇濃度、酶用量、料液比、超聲次數(shù)為正交考察因素。采用L9(34)正交表設(shè)計，以總黃酮為考察指標(biāo)，得到最佳紫花地丁總黃酮提取工藝，見表2所示。

表2 正交因素試驗水平Table 2 Test level of orthogonal factors

2.6 驗證實驗

采用正交試驗優(yōu)化出的最佳提取方法，提取三次樣品，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線顯色方法，定吸光度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算含量。

3 實驗結(jié)果

3.1 單因素實驗結(jié)果

3.1.1 pH結(jié)果顯示

在pH=2.5時，總黃酮提取率最高，但在實驗過程中出現(xiàn)溶液濃稠，紫花地丁變黃，不利于工業(yè)生產(chǎn)，所以pH定在3.5最適合提取，詳見圖2所示。

圖2 pH對提取的影響Fig.2 Influence of pH on extraction

3.1.2 提取溫度結(jié)果顯示

溫度對紫花地丁總黃酮影響為先高后低再高，考慮溫度為35 ℃最適合酶的活性，溫度高于50 ℃后酶活性被抑制，但熱提取影響較大。綜合工業(yè)成本與黃酮分解影響，35 ℃最適合紫花地丁提取，詳見圖3所示。

圖3 超聲溫度對提取的影響Fig.3 Influence of ultrasonic temperature on extraction

3.1.3 提取時間結(jié)果顯示

時間越長，總黃酮提取率越高，但相差不大，且后續(xù)考慮提取次數(shù)因素，所以提取時間定為20 min，詳見圖4所示。

圖4 超聲時間對提取的影響Fig.4 Influence of ultrasonic time on extraction

3.1.4 醇濃度結(jié)果顯示

60%乙醇濃度總黃酮提取率最高，70%，80%相對較高，詳見圖5所示。

圖5 醇濃度對提取的影響Fig.5 Influence of alcohol concentration on extraction

3.1.5 料液比結(jié)果顯示

紫花地丁總黃酮提取率與液料比程正相關(guān)性，在20倍最高，詳見圖6所示。

圖6 液料比對提取的影響Fig.6 Influence of liquid to material ratio on extraction

3.1.6 酶用量結(jié)果顯示

紫花地丁總黃酮在5 mL酶用量最高，且10 mL，15 mL，20 mL結(jié)果影響不大，證明在5 mL用量下能達(dá)到輔助超聲效果。詳見圖7所示。

圖7 酶用量對提取的影響Fig.7 Influence of enzyme dosage on extraction

3.2 正交實驗結(jié)果

紫花地丁總黃酮正交設(shè)計提取結(jié)果詳見表3所示。直觀分析四個影響因素大小順序為D>B>A>C；其中A3>A2>A1；B1>B2>B3；C3>C1>C2；D3>D2>D1；方差分析結(jié)果顯示：提取次數(shù)(D)有**顯著性，為顯著因素；因此綜合分析得到紫花地丁總黃酮酶解超聲提取方案應(yīng)為D3B1A3C3，即80%乙醇，酶用量2.5 mL，料液比1:10，提取3次。

表3 紫花地丁總黃酮正交實驗結(jié)果Table 3 Results of orthogonal experiment of total flavonoids of Rhoditin

續(xù)表3

表4 總黃酮顯著性檢驗Table 4 Significance test of total flavonoids

3.3 驗證性試驗結(jié)果

表5 驗證實驗結(jié)果Table 5 Verifies the experimental results

采用正交試驗優(yōu)化出的最佳提取方法，平行提取三次樣品，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線顯色方法，λ=501 nm處測定吸光度，計算總黃酮含量，得紫花地丁總黃酮提取率為9.852 mg/g，均高于正交實驗9次結(jié)果。

4 結(jié) 論

紫花地丁總黃酮的酶解-輔助超聲提取法，初次提取率比普通超聲提取法提高89.4%，證明酶解-輔助超聲提取紫花地丁總黃酮的科學(xué)性。其中單因素考察實驗證明醇濃度、酶用量、液料比、提取次數(shù)對該方法影響較大，通過四因素三水平正交實驗優(yōu)選得出：最佳酶解-輔助超聲提取紫花地丁總黃酮工藝為：80%乙醇，酶用量2.5 mL，料液比1:20，提取3次；該工藝重現(xiàn)性好，提取率高，適合紫花地丁總黃酮提取。