郁天澤 裘卓瓊 李 巍

（復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院皮膚科 上海 200040）

皮膚表面定植的細菌、真菌和病毒組成了皮膚共生微生物組，又稱皮膚菌群［1］。皮膚菌群和宿主相互作用，共同抵御外來病原體、維持皮膚屏障、調(diào)節(jié)皮膚免疫［2-3］。以往皮膚菌群研究主要采用高通量測序的方法，揭示皮膚菌群的組成、分布和代謝功能等特征，探索菌群與疾病的相關(guān)性，但存在測序深度不夠［4］、菌株水平信息缺乏、菌群功能研究難以深入等問題［5］。為彌補高通量測序的局限性，同時得益于微生物培養(yǎng)技術(shù)的快速發(fā)展，培養(yǎng)組學(xué)技術(shù)逐漸被用于探索人體共生菌群的組成和功能。培養(yǎng)組學(xué)已經(jīng)成功培養(yǎng)了許多此前未被分離鑒定的菌種，揭示了宏基因組學(xué)研究所發(fā)現(xiàn)的未知菌群的詳細分類和具體功能［6］，在皮膚病研究領(lǐng)域顯示出良好前景。本文就菌群研究方法的沿革、測序技術(shù)的局限性、培養(yǎng)組學(xué)的技術(shù)路線和技術(shù)進展、生理狀態(tài)下人皮膚菌群培養(yǎng)組學(xué)研究、培養(yǎng)組學(xué)在皮膚病研究中的應(yīng)用等方面進行綜述。

菌群研究方法的沿革及培養(yǎng)組學(xué)的優(yōu)勢微生物培養(yǎng)的起源可以追溯到19 世紀中葉，傳統(tǒng)微生物研究通常使用少數(shù)幾種經(jīng)驗性的固體、液體培養(yǎng)基，直接觀察不同細菌在特定培養(yǎng)基中的生理行為和表型特征［7］，并結(jié)合染色試驗［8］，作為微生物種屬鑒定的金標準。20 世紀70 年代初，細菌培養(yǎng)開始被用于腸道菌群組成和功能的研究［9］，厭氧培養(yǎng)技術(shù)的進步推動了腸道菌群研究的進展［10］。盡管早期的微生物培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)了許多重要的人體共生菌種，但大多數(shù)共生細菌仍然未能被成功培養(yǎng)。

進入21 世紀，高通量測序技術(shù)快速拓展了人們對人體共生菌群的認識，超過80%的以往無法被培養(yǎng)的細菌種類通過測序被發(fā)現(xiàn)［11］，測序技術(shù)迅速取代了傳統(tǒng)培養(yǎng)方法，成為了共生菌群研究的主流方法。但測序技術(shù)在實現(xiàn)高靈敏度的同時，存在一些缺陷和偏倚。例如環(huán)境微生物的污染、宿主測序信息的干擾、取樣方法的局限、DNA 提取過程中的試劑污染等，降低了測序結(jié)果的準確性和可信度［12-13］。

由于測序方法的局限性，以及細菌培養(yǎng)方法的重大革新，培養(yǎng)組學(xué)重新受到了微生物學(xué)研究的重視。培養(yǎng)組學(xué)是指基于多樣化的培養(yǎng)條件，分離培養(yǎng)得到盡可能多的菌株，并結(jié)合基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDITOF MS）和16S rRNA 測序技術(shù)，鑒定細菌種類并深入研究其功能的研究方法［14］。MALDI-TOF MS技術(shù)于2009 年被首次報道用于培養(yǎng)組學(xué)屬和種水平的精確鑒定［15］，這一技術(shù)與傳統(tǒng)菌種鑒定技術(shù)相比更快速、經(jīng)濟而準確，極大推動了培養(yǎng)組學(xué)的發(fā)展［16］。且與傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)相比，培養(yǎng)組學(xué)的培養(yǎng)條件更全面，可以得到更多的可培養(yǎng)菌，包括在以往研究中被認為“不可被培養(yǎng)”的物種［17］。培養(yǎng)組學(xué)可以確定宏基因組學(xué)發(fā)現(xiàn)的不能歸入已知微生物物種基因序列的準確種屬［18-19］?；跍y序的方法通常只能進行相關(guān)性分析，無法確定微生物分類單元與功能之間的因果關(guān)系，培養(yǎng)組學(xué)還可以揭示單個菌種和菌株的詳細信息，深入解釋測序的結(jié)果［20］，與宏基因組學(xué)研究形成了良好的互補作用。

2012 年，Lagier 等［21］首次發(fā)表了基于培養(yǎng)組學(xué)的腸道菌群研究，使用212 種不同的培養(yǎng)條件，從糞便樣本中分離出了174 種此前未被報道的腸道細菌，其中包括31 個新物種。截至2018 年，培養(yǎng)組學(xué)顯著增加了培養(yǎng)得到的與人類相關(guān)的細菌物種數(shù)量，可培養(yǎng)的人類相關(guān)細菌數(shù)量從2012 年首個培養(yǎng)組學(xué)研究前的2172 個物種上升到了2671 個［22］。運用多樣化的細菌培養(yǎng)條件，聯(lián)合培養(yǎng)組和宏基因組等多組學(xué)分析的方法，可以更好地揭示人體共生菌群的全貌，探究菌株水平的改變對疾病的影響，為研究宿主-菌群相互作用提供了更廣闊的視角［23］。

培養(yǎng)組學(xué)的技術(shù)路線及技術(shù)進展培養(yǎng)組學(xué)的基本策略是用盡可能全面的培養(yǎng)條件，培養(yǎng)得到盡可能多的菌種［24］。培養(yǎng)組學(xué)的第一步是收集樣本，并根據(jù)研究需要設(shè)計盡可能全面的培養(yǎng)條件，分別培養(yǎng)所得樣本中的細菌。為了能在復(fù)雜的共生菌群中分離純化特定的菌株，需要設(shè)置不同溫度、pH 及氣體環(huán)境，添加選擇性抑制劑，并使用含有特殊碳源、微量元素、生長因子的專用培養(yǎng)基在低濃度下促進苛養(yǎng)菌的生長［25-26］。此外，還需要厭氧罐、GasPak 系統(tǒng)和厭氧室等系統(tǒng)用于厭氧菌的分離培養(yǎng)。在不同培養(yǎng)條件的固體培養(yǎng)基中獲得單菌落后，對單菌落進行傳代分離培養(yǎng)，再進行后續(xù)菌種鑒定。

基于培養(yǎng)組學(xué)的細菌物種鑒定通常使用MALDI-TOF MS 和16S rRNA 測序兩種方法。16S rRNA 測序成本高、耗時長，限制了其在高通量培養(yǎng)研究中的應(yīng)用。MALDI-TOF MS 鑒定快速、經(jīng)濟、準確，但其依賴于不斷更新的細菌蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，受限于已被分離鑒定的細菌種類，部分無法被MALDI-TOF MS 鑒定的細菌仍然需要通過16S rRNA 測序進行鑒定。如果16S rRNA 測序結(jié)果與最接近的已知菌株的相似度小于98.65%，則該菌株可能是一個新物種，這一新物種的發(fā)現(xiàn)可以被全基因組測序證實［27］。此外，全基因組測序還可以進一步得到菌株水平的基因組成和功能特征。通過對菌株全基因組序列的功能注釋，以及耐藥基因、毒力因子、代謝產(chǎn)物特征等關(guān)鍵功能基因的分析，可以預(yù)測特定菌株的功能特點，并據(jù)此開展后續(xù)的功能驗證。此外，培養(yǎng)組學(xué)可以與宏基因組、代謝組、蛋白組等多組學(xué)研究相結(jié)合，深化對培養(yǎng)得到細菌的功能認識。皮膚菌群培養(yǎng)組學(xué)的技術(shù)路線如圖1所示。

圖1 皮膚菌群培養(yǎng)組學(xué)的技術(shù)路線Fig 1 The technical route of skin microbiota culturomics

目前培養(yǎng)組學(xué)采用的細菌培養(yǎng)方法存在養(yǎng)出率低、培養(yǎng)工作量大等限制［28］，一些新技術(shù)和新方法的出現(xiàn)正在解決這些問題。Whelan 等［18］采用平板覆蓋算法（plate coverage algorithm，PLCA），對肺囊性纖維化痰標本進行富集培養(yǎng)。與直接測序分析相比，富集培養(yǎng)后進行的宏基因組學(xué)分析可以實現(xiàn)更豐富的分類學(xué)多樣性、更優(yōu)質(zhì)的宏基因組組裝、更長的重疊群以及更全面的功能注釋。Cross等［29］采用了一種“反向基因組學(xué)”方法，使用抗體來預(yù)測膜蛋白，并從一個特定的分類單元中對微生物進行分類和培養(yǎng)。該方法已成功從環(huán)境樣本、口腔菌群樣本、唾液樣本中定向富集和培養(yǎng)得到了常規(guī)方法未能培養(yǎng)的菌種。Fenn 等［30］將糞便樣本中的緩慢生長細菌與快速生長細菌進行共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)大腸埃希菌（Escherichia coli）的存在允許糞桿菌屬（Faecalibacterium）、嗜膽菌屬（Bilophila）、擬桿菌屬（Bacteroides）、薩特氏菌屬（Suterella）、戈登氏桿菌屬（Gordonibacter）的幾種細菌通過甲基萘醌（Menaquinone）生物合成途徑生長。此外，使用半透膜分離的雙層軟瓊脂模擬共生細菌間的體外交流，也可以分離以前未被培養(yǎng)的物種［31］。

生理狀態(tài)下人皮膚菌群培養(yǎng)組學(xué)研究既往生理狀態(tài)下皮膚菌群多樣性研究主要基于高通量測序分析［32］，近年來皮膚菌群培養(yǎng)組學(xué)豐富了測序所得的結(jié)果。Shami 等［33］的研究分析了80 名健康沙特人3 個部位可培養(yǎng)需氧皮膚菌群的多樣性，發(fā)現(xiàn)足部需氧菌多樣性最高，手部其次，頭皮需氧菌多樣性最低。其中微球菌屬（Micrococcus）和凝固酶陰性葡萄球菌（coagulase-negativeStaphylococcus，CNS）是最主要的皮膚可培養(yǎng)須氧菌。老年人樣本中培養(yǎng)得到了鮑曼不動桿菌（Acinetobacter baumannii）、糞腸球菌（Enterococcus faecalis）和肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae），而在年輕人樣本中培養(yǎng)得到了銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa），推測這些細菌可能來源于醫(yī)院相關(guān)的環(huán)境微生物。皮膚菌群的培養(yǎng)須排除環(huán)境微生物的干擾，但有時環(huán)境微生物和共生菌群并不能嚴格區(qū)分，環(huán)境微生物在病理情況下可能干擾皮膚共生菌群的組成。

2020 年Microbiology首次報道了基于嚴格意義上培養(yǎng)組學(xué)設(shè)計的生理狀態(tài)下皮膚菌群研究。Timm 等［34］采集了17 名22～45 歲健康人的皮膚菌群樣本，選取前額、前臂、肘窩等3 個部位，設(shè)置了12種不同的分離培養(yǎng)條件，共得到842 個菌株，分別屬于38 個不同的細菌屬。研究發(fā)現(xiàn)了人類微生物組計劃未報道的12 株類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）、8株玫瑰單胞菌屬（Roseomonas）和7 株迪茨氏菌屬（Dietzia）的細菌。研究還發(fā)現(xiàn)皮膚菌群碳源利用模式具有多樣性，系統(tǒng)發(fā)育相近的種屬碳源利用模式具有相似性，但同屬的細菌碳源利用模式不盡相同。這一發(fā)現(xiàn)有助于解釋健康人皮膚菌群多樣性，也說明皮膚菌群研究中關(guān)注物種和菌株水平差異的必要性。

培養(yǎng)組學(xué)在鑒定皮膚菌群的多樣性和個體特異性、部位特異性中具有獨特優(yōu)勢。利用培養(yǎng)組學(xué)可以發(fā)現(xiàn)低豐度的物種以及鑒定與16S rRNA 測序不同的菌種，也可以作為高通量測序的重要互補實驗技術(shù)，完善對人體皮膚菌群組成的認識。

培養(yǎng)組學(xué)在皮膚疾病研究中的應(yīng)用隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，人們逐漸認識了整體皮膚菌群多樣性和單個皮膚菌株改變對皮膚疾病的影響［35］。近年來培養(yǎng)組學(xué)與測序技術(shù)互相補充，進一步推動了疾病狀態(tài)下的皮膚菌群研究。

Langan 等［36］同時應(yīng)用培養(yǎng)組學(xué)和16S rRNA 測序，揭示了銀屑病患者治療過程中皮膚菌群的變化：銀屑病皮損處可培養(yǎng)需氧菌中厚壁菌門（Firmicutes）的豐度增加，放線菌門（Actinobacteria）的豐度降低；皮損處皮膚菌群多樣性降低，而在銀屑病系統(tǒng)治療期間皮膚菌群多樣性部分恢復(fù)。

皮膚菌群的改變參與了皮膚慢性創(chuàng)傷的恢復(fù)過程［37］，但皮膚菌群在慢性創(chuàng)傷恢復(fù)中的具體改變以及個體特異性的菌群組成變化尚未明確［38］。Oates 等［40］培養(yǎng)了26 例皮膚慢性創(chuàng)傷患者的皮膚菌群，發(fā)現(xiàn)傷口部位的皮膚菌群多樣性高于對照側(cè)，而分離出已知病原體傷口和未感染傷口的皮膚菌群多樣性沒有顯著差異［39］。一項納入2 963 例慢性創(chuàng)傷患者的16S rRNA 測序分析表明，慢性創(chuàng)傷處皮膚菌群多樣性顯著升高，葡萄球菌屬（Staphylococcus）和假單胞菌屬（Pseudomonas）的比例升高，患者的人種特征和創(chuàng)傷類型不會影響慢性創(chuàng)傷皮膚的菌群組成。培養(yǎng)結(jié)果與測序方法所得的皮膚菌群多樣性結(jié)果相符，培養(yǎng)組學(xué)可以揭示特定菌株在維持慢性創(chuàng)傷皮膚菌群多樣性中的作用。

通常認為皮膚局部抗生素和其他抗皮膚致病菌治療措施可能降低皮膚菌群多樣性［41］，干擾正常的皮膚共生菌群組成，并可能導(dǎo)致特應(yīng)性皮炎等炎癥性皮膚病的發(fā)生［42］。Burnham 等［43］通過培養(yǎng)組學(xué)技術(shù)分析了7 例ICU 患者和8 例局部應(yīng)用去金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）定植治療的健康居民的皮膚菌群。研究運用多種培養(yǎng)條件，共得到174 株分屬于158 個不同種的皮膚細菌。健康人治療后皮膚金黃色葡萄球菌的豐度降低，皮膚菌群多樣性和豐度沒有顯著改變；而ICU 患者在外用抗菌治療后，皮膚菌群的多樣性和豐度均降低。該研究表明局部抗菌療法不會對健康人的皮膚菌群造成重大干擾，仍然可以保留其皮膚的“有益”共生菌；而重癥患者的皮膚菌群更脆弱，需要謹慎使用抗生素，警惕細菌耐藥性的產(chǎn)生以及皮膚菌群穩(wěn)態(tài)的破壞。

結(jié)語培養(yǎng)組學(xué)方法的不斷改進與完善，為皮膚菌群培養(yǎng)組學(xué)在皮膚病研究中的應(yīng)用提供了更廣闊的空間。培養(yǎng)組學(xué)與高通量測序技術(shù)的結(jié)合將龐大的菌群測序數(shù)據(jù)與精確的物種分類和功能研究相結(jié)合，從而更好地了解皮膚菌群的組成和功能，并為后續(xù)通過調(diào)節(jié)皮膚菌群來預(yù)防和治療皮膚疾病提供依據(jù)。在解決了培養(yǎng)、分離、純化、鑒定細菌的問題之后，如何建立特定菌株與皮膚疾病的因果關(guān)系是目前皮膚菌群培養(yǎng)組學(xué)研究需要解決的重要問題。構(gòu)建合適的動物模型進行體內(nèi)實驗［44］，運用現(xiàn)有的體外實驗技術(shù)證明候選病原體或保護性微生物在特定疾病中的作用［45］，將是皮膚菌群培養(yǎng)組學(xué)研究方向。

作者貢獻聲明郁天澤 文獻收集和整理，綜述構(gòu)思和撰寫，圖表繪制（使用BioRender.com 繪制）。裘卓瓊 綜述構(gòu)思和修訂。李巍 綜述構(gòu)思、修訂和審校。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。