徐慧雯 王珍珍 李 情 馬晶晶 陳 錕 林之光 馬 燕 陳波斌△

（1復旦大學附屬華山醫(yī)院血液科 上海 200040；2復旦大學附屬華山醫(yī)院北院血液科，3檢驗科 上海 201907）

原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤（primary central nervous system lymphoma，PCNSL）是一種非常罕見的非霍奇金性淋巴瘤（non-Hodgkin lymphoma，NHL），約占NHL 發(fā)病的1%，占原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤發(fā)病的2%～3%［1-2］。90%以上的PCNSL 在病理類型上屬于彌漫大B 細胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）。隨著化療、放療、自體造血干細胞移植等治療方法的不斷改進，以及新型靶向藥物的應用，PCNSL 的生存率有了較大的提高，但5年生存率（約38%）仍較低，是預后最差的淋巴瘤亞型 之 一［3］。 以 大 劑 量 甲 氨 蝶 呤（high-dose methotrexate，HD-MTX）為基礎的化療是目前治療PCNSL 的一線化療方案。盡管基于HD-MTX 的治療方案對于多數(shù)患者有效，但僅少數(shù)患者可獲得持久的緩解，PCNSL 總體療效欠佳。

PCNSL 具有異質性，不同患者預后差別較大，尋找合適的生物學指標以準確地判斷患者的預后，按照疾病危險分層進行治療，有助于改善PCNSL患者的生存。根據(jù)國際結外淋巴瘤研究組的研究，目前對于PCNSL 的預后判斷主要包括5 個獨立的影響因子：年齡、ECOG 體能狀態(tài)評分（performance status，PS） 、血 清 乳 酸 脫 氫 酶（lactate dehydrogenase，LDH）水平、腦脊液蛋白含量、腦深部區(qū)域累及［4-5］。目前的預后評分系統(tǒng)以臨床和生化特征為基礎，對PCNSL 預后的判斷存在一定的局限性。因此，進一步尋找新的可靠的生物標志物，以評估PCNSL 患者的治療反應及預后具有重要意義。

MicroRNAs（miRNAs）是 一 種 小 的 非 編 碼RNA 分子，可以通過與靶mRNA 的互補區(qū)域結合來抑制mRNA 翻譯。目前研究發(fā)現(xiàn)miRNAs 與多種實體腫瘤以及包括DLBCL 在內(nèi)的多種血液系統(tǒng)腫瘤預后有關。有研究報道m(xù)iR-21 和miR-222 與DLBCL 預后相關，是DLBCL 預后標志物之一，但miRNAs 在PCNSL 中研究較少［6-7］。曾有研究發(fā)現(xiàn)PCNSL 患者腦脊液及血漿中miR-21 表達水平異常升高，但對PCNSL 的預后作用尚存在爭議［3，8］。本研究進一步探索miRNAs 在PCNSL 預后評估中的作用，通過檢測PCNSL 患者在初治前血漿miR-21和miR-222 的表達水平，分析其與PCNSL 預后的關系，明確血漿miR-21 和miR-222 作為PCNSL 預后生物標志物的價值。

資料和方法

研究對象回顧性納入2011 年9 月至2016 年12 月期間復旦大學附屬華山醫(yī)院確診的PCNSL 患者共41 例。所有患者均為免疫功能正常人群、有明確的組織或細胞病理學證據(jù)，臨床資料完整，且留存有首次化療前外周血標本。本研究獲復旦大學附屬華山醫(yī)院倫理委員會批準（批準號：2017-325），所有受試者均簽署書面知情同意書。

樣品采集在化療開始前采集外周血標本，2 000 r/min 離心5 min，離心半徑為22.5 cm，分離上層血漿，凍存于-80 ℃保存。

qRT-PCR 檢測血漿miR-21 及miR-222 表達水平采用mirVana ?miRNA 分離試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific 公司）從血漿樣品中提取總RNA。用Takara PrimeScript RT Master Mix 試劑盒（日本Takara 公司）逆轉錄獲得cDNA。MX3000 P Real-time PCR 儀器（德國Stratagene 公司）進行qRT-PCR 擴 增，加 入miR-21 和miR-222 特 異 性 引物（IBSBIO-1978021，IBSBIO-1978222，上海艾博思生物技術有限公司）。反應條件：94 ℃預變性3 min后，94 ℃變性20 s、62 ℃退火及延伸40 s，共40 個循環(huán)。以cel-miR-39 作為內(nèi)參，每組取3 個復孔Ct 均值做計算，通過2-ΔΔCt方法分析數(shù)據(jù)。

臨床資料收集及隨訪收集病史資料，包括患者性別、身高、體重、初次診斷時年齡、確診時間、病理檢測結果、病理獲取方法、可能與預后相關的指標（包括ECOG PS 評分、腦脊液壓力、腦脊液常規(guī)及生化檢查結果、LDH 水平、血β2微球蛋白）以及收集患者病情進展/復發(fā)時間，若已死亡則收集其死亡時間等。末次隨訪時間截至2019 年1 月。

統(tǒng)計學分析計量資料以±s、中位數(shù)和百分位數(shù)等表示。分類資料統(tǒng)計使用χ2檢驗。使用Kaplan-Meier 繪制生存曲線；單因素和多因素分析分別使用Log-rank 檢驗和Cox 回歸分析。采用14.2版STATA 進行統(tǒng)計分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

入組患者臨床特點根據(jù)病理和影像學檢查結果共納入41 名新確診為PCNSL 的患者?；颊咧形荒挲g為56 歲，其中58.54%為男性。DLBCL 是最常見的病理診斷類型（占90.24%）?；颊咂鸩r最常表現(xiàn)的臨床癥狀為：顱高壓（48.78%）、運動障礙（48.78%）、認知障礙（39.02%）、視力障礙（29.27%）和言語障礙（21.95%）等。所有患者均接受以HDMTX 為基礎的化療方案，其中接受HD-MTX 單藥治療的患者占26.83%，HD-MTX 與Vm26、利妥昔單抗以及伊達比星聯(lián)合使用的患者分別占41.46%、21.95% 及9.76%。表1 總結了41 例患者的臨床特征。

表1 41 例PCNSL 患者的一般臨床資料Tab 1 Clinical characteristics of 41 PCNSL patients ［n（%）］

血漿miR-21 和miR-222 表達水平與PCNSL 患者的臨床病理特征比較以cel-miR-39 為內(nèi)參，本隊列以miR-21 相對表達量的中位數(shù)1.17、miR-222相對表達量的中位數(shù)0.86 作為界值，將患者分為miR-21 高表達和低表達組、miR-222 高表達和低表達組。對miR-21 兩組間及miR-222 兩組間患者的年齡、性別、病理類型、腫瘤深部累積、LDH 水平、ECOG 評分等臨床病理特征分別進行分析，結果表明miR-21 兩組間以及miR-222 兩組間的患者在以上臨床特征方面均無統(tǒng)計學意義（表2）。

表2 miR-21 和miR-222 表達水平與PCNSL 患者的臨床病理特征比較Tab 2 Comparison of plasma miR-21 and miR-222 with clinicopathological characteristics of PCNSL （n）

血漿miR-21 和miR-222 對PCNSL 的預后評估價值本研究中位隨訪時間為44.47 個月，入組患者的中位PFS 和OS 值分別為18.7 和47.1 個月。生存分析顯示，miR-21 高表達組中位PFS 較長，達到22.63 個月，顯著長于miR-21 低表達組的15.5 個月，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.049，圖1A）。但是兩組間的中位OS 并無顯著差異（47.27 個月vs.47.1 個月，P=0.397，圖1B）。同樣，根據(jù)miR-222 表達水平將患者分成兩組，對miR-222 高表達及低表達組患者進行生存分析，Kaplan-Meier 曲線顯示兩組患者間的PFS 和OS 差異無統(tǒng)計學意義，中位PFS 分別為18.37 和19.8 個 月，中 位OS 分 別 為47.87 和44.2 個月（圖1C 和1D），差異也無統(tǒng)計學意義。

圖1 血漿miR-21 和miR-222 表達對PCNSL 患者生存的影響Fig 1 Kaplan-Meier curves of PCNSL patients with different expression level of miR-21 or miR-222

PCNSL 患者預后的單因素分析為了明確各種因素對PCNSL 患者PFS 及OS 的影響，我們對可能影響PCNSL 預后的臨床特征分別進行單因素分析（表3）。結果表明ECOG 評分≤1 組中位PFS 為29.67 個月，長于ECOG 評分≥2 組（15.5 個月），差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.018，圖2A）。LDH 正常的患者中位PFS 為25.83 個月，而LDH 異常升高的患者中位PFS 僅有16.4 個月（P=0.002，圖2B），但兩組患者的OS 無顯著差異。分析不同用藥組間的生存差異，結果表明HD-MTX 與Vm26 聯(lián)合的患者中位PFS 為26.43 個月，高于HD-MTX 單藥組14.47個月（P=0.003，圖2C），但兩組間OS 無差異。其他因素的分析結果見表3。

表3 單因素分析PCNSL 預后影響因素Tab 3 Prognostic factors for survival in PCNSL by univariate analysis

圖2 影響PCNSL 預后的危險因素的Kaplan-Meier 曲線Fig 2 Kaplan-Meier curves of PCNSL patients with prognostic risk factors

PCNSL 患者預后的多因素分析將單因素分析中對PCNSL 患者PFS 有顯著影響的指標，包括miR-21 表 達 水 平、ECOG PS 評 分、LDH 水 平 以 及HD-MTX 與Vm26 聯(lián)合用藥方案，以及對PCNSL預后較為公認的影響因素年齡，納入COX 回歸進行多因素分析。將自變量miR21≥1.17、miR222≥0.88、ECOG PS 評 分≥2、LDH＞225、年齡≥55 歲以及采用Vm26 賦值為1，我們進行了比例風險假設（即PH 假設），所有P值均＞0.05，滿足Cox 回歸的等比例風險模型的條件；將因變量PFS 中疾病復發(fā)或進展的結局賦值為1，疾病未進展的結局賦值為0。結果表明miR21 表達水平、ECOG PS 評分水平以及LDH 水平HD-MTX 是影響PCNSL 患者PFS的獨立預后因素（表4），COX 回歸進一步說明血漿miR-21 具有PCNSL 預后評估潛能。

表4 多因素分析PCNSL 的預后影響因素Tab 4 Multivariate analysis of prognostic factors of PCNSL

討 論

自20 世紀90 年代發(fā)現(xiàn)miRNAs 以來，miRNAs已被證實在多種血液腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起作用［9］。異常表達的miRNAs 除了存在于腫瘤組織，還能在腦脊液、外周血等體液中檢測到。因此miRNAs 有望成為腫瘤診斷及預后的生物標志物。miR-21 是最早發(fā)現(xiàn)在腫瘤中高表達的miRNAs 之一，包括DLBCL 在內(nèi)的多種腫瘤均檢測到異常表達的miR-21，但miR-21 在PCNSL 中的研究仍舊較少［6］。曾有研究報道，PCNSL 患者腦脊液中miR-21 水平顯著高于對照組，診斷靈敏度為97.4%，腦脊液miR-21 被認為對PCNSL 具有診斷價值［10-11］；然而，外周血miR-21 在評估PCNSL 預后方面的作用仍存在爭議［12-14］。因 此，本 研 究 收 集 并 隨 訪PCNSL 患 者 信息，檢測外周血miR-21 表達水平，通過生存分析發(fā)現(xiàn)miR-21 可能是PCNSL 的獨立預后因素，為明確miR-21 對PCNSL 預后的影響提供了新的依據(jù)。

本研究結果顯示，血漿miR-21 高表達組患者有更好的PFS，但對OS 的影響不大。可能是因為患者在疾病進展后采用的治療方案異質性較大，多種因素對預后產(chǎn)生了影響，故我們認為miR-21 用以評估PCNSL 患者疾病早期進展具有一定臨床價值。miR-21 在腫瘤發(fā)病中的作用機制較為復雜，研究表明miR-21 既能夠通過上調(diào)STAT3、AP1 等促癌基因，下調(diào)PTEN、SPRY2、PDCD4 等抑癌基因，刺激腫瘤微環(huán)境中的Treg 逃逸免疫監(jiān)視促進腫瘤發(fā)生，也能夠促進P53 抑癌基因的轉錄與表達［15-18］。本研究結果提示miR-21 優(yōu)勢表達的PCNSL 腫瘤細胞可能對HD-MTX 為基礎的化療方案更為敏感，但miR-21 在PCNSL 發(fā)病機制中的具體作用以及對化療敏感性高的機制目前尚未闡明，有待進一步研究和驗證。

此前的研究顯示miR-222 與DLBCL 預后相關，它可作為預后評估的生物標志物。Thapa 等［19］在免疫缺陷人群中展開的研究表明，miR-222 能夠區(qū)分PCNSL 與非PCNSL，且表達水平與預后相關。但在免疫功能正常的人群中血漿miR-222 表達與PCNSL 的預后相關性尚不明確。本研究檢測免疫功能正常的PCNSL 患者血漿miR-222 表達水平，分析其與預后的關系，發(fā)現(xiàn)二者無顯著相關性，血漿miR-222 不能預測免疫正常PCNSL 人群的預后。因此，免疫功能正常與缺陷的個體之間，PCNSL 發(fā)病機制以及miR-222 在發(fā)病機制中的作用可能存在差異，值得進一步研究。

HD-MTX 為基礎的聯(lián)合化療方案對PCNSL的治療效果可能優(yōu)于HD-MTX 單一用藥方案，臨床常選用一些具有較強的血腦屏障通透性藥物進行聯(lián)合用藥，如阿糖胞苷、Vm26、伊達比星等。然而，目前尚無研究明確何種聯(lián)合用藥方案對PCNSL 治療效果最佳。有研究報道含Vm26 的HD-MTX 化療方案可以讓PCNSL 患者獲益，本研究結果表明，HD-MTX 聯(lián)合Vm26 化療方案能夠顯著提高PCNSL 中位PFS，但該結論仍需要擴大樣本量、開展前瞻性臨床試驗進一步驗證，HD-MTX與Vm26 聯(lián)合方案中的用藥劑量也需要進一步明確［3］。此外，近年來一些新型小分子藥物如BTK 抑制劑伊布替尼、免疫調(diào)節(jié)劑沙利度胺、PD-1 抑制劑納武單抗，在PCNSL 的基礎研究及臨床試驗中取得顯著進展［20-22］。miR-21 在此類新型靶向用藥治療中對患者預后的評估效果亦有待進一步研究與明確。

本研究存在一定局限性：（1）僅對單中心的41例PCNSL 進行了回顧性分析，可能存在選擇性偏倚。（2）由于樣本量有限，無法對性別、年齡、病理類型等因素進行深入分析。但是鑒于該病的罕見性，本研究仍有一定臨床意義。

本研究結果表明血漿miR-21 或可作為PCNSL預后的獨立危險因素。除了PS 及LDH 這2 個較為公認的影響PCNSL 預后因素外，本研究結果還表明HD-MTX 聯(lián)合Vm26 方案可以使PCNSL 患者生存獲益。

作者貢獻聲明徐慧雯 數(shù)據(jù)采集，論文構思、撰寫和修訂。王珍珍 數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析，論文修訂。李情 臨床樣本分析。馬晶晶 文獻調(diào)研和整理。陳錕 數(shù)據(jù)采集與檢測。林之光 數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析。馬燕 論文修訂。陳波斌 研究指導，論文修訂。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。