楊欣悅李佳佳董 翔是文輝李建瑛魏雪梅劉江偉?

(1.石河子大學醫(yī)學院,新疆 石河子 832000;2.新疆軍區(qū)總醫(yī)院肛腸診療中心,烏魯木齊 830000;3.新疆軍區(qū)總醫(yī)院新疆特殊環(huán)境醫(yī)學重點實驗室,烏魯木齊 830000;4.新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院呼吸危重癥醫(yī)學中心,烏魯木齊 830000)

高原急性肺水腫是急性高原疾病的肺部表現(xiàn)[1]。 高原肺水腫起病急、進展快、死亡率高,是一種潛在的威脅生命的疾病[2]。 當快速上升到海拔2500 m 以上的人不適應高原環(huán)境時,就會發(fā)生高原肺水腫[3]。 臨床上明顯的高原肺水腫以嚴重發(fā)紺、呼吸困難和咳嗽為特征[4]。 目前對于急性高原肺水腫,我們?nèi)匀蝗狈M意的預防和治療手段。 高原寒冷環(huán)境具有氣壓低、缺氧、寒冷、紫外線輻射強、植被稀疏、人口稀少等一系列特點。 目前,世界高原面積約為四千八百萬平方千米,約占世界總面積的10%,中國是世界上高原面積最大的國家,海拔最高,人口最多[5]。 暴露在高原寒冷環(huán)境中的人,如工人、士兵、旅行者和高原常駐人群,都有發(fā)生高原肺水腫的可能[6]。

因此,開展急性高原肺水腫有效防治藥物的研究非常必要。 而這些研究的基礎就是建立重復性好、評價體系健全的急性高原肺水腫動物模型。 目前高原肺水腫的發(fā)病機制還未十分明確[7],可能與海拔高度[8]、運動強度[9]及機體的適應與重塑有關,但至今仍無一種制作高原肺水腫模型的標準方法。 更重要的是,高原低壓缺氧常伴隨寒冷環(huán)境,即使在夏天,高原地區(qū)白天溫度常常在15℃以下,但目前出現(xiàn)的高原肺水腫模型大部分在常溫環(huán)境中建立,未考慮寒冷環(huán)境對肺水腫形成的影響,目前尚未見高原寒冷環(huán)境的肺水腫模型的文獻報道,因此建立一個符合高原實際環(huán)境的肺水腫模型是一個亟待解決的問題。 在本研究中,我們使用模擬氣候艙來建立高原寒冷環(huán)境大鼠肺水腫模型,并評估肺濕/干重比、肺泡灌洗液中的總蛋白質(zhì)含量、肺泡組織的病理學的變化。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

實驗采用SPF 級雄性SD 大鼠80 只(6~8 周齡、體重220~260 g),購自新疆醫(yī)科大學實驗動物中心[SCXK(新)2018-0002]。 實驗大鼠飼養(yǎng)在新疆軍區(qū)總醫(yī)院實驗動物科SPF 級動物實驗室中[SYXK(軍) 2017-0050],環(huán)境條件:12 h/12 h 光暗循環(huán),溫度(21 ± 1)℃、濕度(45±5)%,充足供應水與飼料。 所有實驗方案獲新疆軍區(qū)總醫(yī)院動物倫理委員會批準(DWLL20190320),遵從3R原則。

1.2 主要試劑與儀器

西北特殊環(huán)境人工實驗艙(新疆軍區(qū)總醫(yī)院研制);BCA 蛋白濃度測定試劑盒(北京索萊寶科技有限公司);戊巴比妥鈉(Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co.Ltd.)。 電子秤(上海儀器廠);光學顯微鏡CKX41(日本Olympus);TS-12U 生物組織脫水機(中國亞鵬);LEICA RM213 型組織切片機(德國);BI-2000 醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)(成都泰盟科技公司 ;YB-6D 型生物組織石蠟包埋機(湖北孝感亞光電子技術公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 高原寒冷環(huán)境肺水腫模型建立

將100 只健康標準大鼠隨機分為2 組(每組50只):高原常溫組(HN 組)和高原寒冷組(HC 組)。每組按不同時間點分為5 個亞組:0 h 組、24 h 組、48 h 組、72 h 組、120 h 組。 0 h 組置于常溫環(huán)境中[溫度(21±1)℃,相對濕度(45±5)%],其余組放置在西北特殊環(huán)境人工實驗艙(新疆軍區(qū)總醫(yī)院研制)的高原環(huán)境中。 HN 組實驗艙條件設置12 h/12 h的光暗循環(huán),溫度(21±1)℃、相對濕度(45±5) %。HC 組實驗艙條件設置:12 h/12 h 光暗循環(huán),白天12 h 15℃,夜間12 h 5℃,濕度(45±5)%。

實驗過程中,打開艙門,將高原24、48、72、120 h組的動物暴露在高原低壓低氧艙內(nèi)。 設置高原環(huán)境參數(shù),海拔設置為7000 m,高度以10 m/s 的速度上升,設備達到預定高度后,保持濕度(45±5)%,實驗艙壓力47.3 KPa,氧含量約9.9%[10]。

1.3.2 樣本解剖與采集

當?shù)竭_相應時間后,高度降低至海平面,打開艙門,在艙內(nèi)快速麻醉動物,每組大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)。 沿胸部正中逐層剪開胸壁,充分暴露胸腔后,先結扎右側主支氣管,將導管插入左主支氣管,經(jīng)氣管插管向左肺緩慢注入0.9%生理鹽水4 mL,緩慢回抽;反復沖洗2~3 次。收集肺泡灌洗液3 mL,用于肺泡灌洗液蛋白質(zhì)濃度測定。 分離右肺,取右肺上葉測量濕/干重比值。右肺中葉用4%多聚甲醛固定,用于病理HE 染色。

1.3.3 肺泡灌洗液蛋白質(zhì)濃度測定

取肺泡灌洗液,以3000 r/min 離心15 min,收集上清液,使用BCA 蛋白濃度測定試劑盒,采用Bicinchoninic acid 法(BCA 法)檢測肺泡灌洗液中總蛋白濃度。

1.3.4 肺組織濕/干重比測定

肺組織濕/干重比可評估肺含水量。 處死大鼠并徹底放血,取右肺上葉,用濾紙輕輕吸去肺組織表面的血污。 然后將其放在錫箔紙上,用電子天平測量濕重,精確度為0.1 mg。 然后將肺組織與錫箔紙一起放入電烤箱,80℃加熱72 h,達到恒定重量(重復2 次稱量干重誤差<0.002 g 為恒定重量),隨后記錄其重量為干重。 按Elliot 公式計算含水量:組織含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100 %。

1.3.5 肺組織HE 染色

右肺中葉在4%多聚甲醛中固定1 周后,不同濃度乙醇梯度脫水,包埋,切片,用HE 染色試劑盒染色。 染色后在光學顯微鏡下觀察肺部病理變化,肺損傷程度通過用肺損傷評分的方法評估。 光學顯微鏡下肺組織損傷程度基于以下指標:(1)肺泡和間質(zhì)有無水腫;(2)中性粒細胞浸潤程度;(3)出血程度。 肺的損傷嚴重程度分為以下幾類:無損傷得分為0;25%的肺野損傷得分為1;50%的肺野損傷得分為2;75%的肺野損傷得分為3;全肺野改變得分為4[11]。

1.4 統(tǒng)計學方法

統(tǒng)計學方法:采用SPSS 23.0 進行統(tǒng)計學分析。所有數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標準差(±s)表示。 組間比較采用單因素方差分析。 組內(nèi)比較采用獨立樣本t檢驗。P<0.05 認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 肺組織濕/干重比分析

如圖1 所示,48、72 和120 h 的HC 組肺濕/干重比均高于0 h 的HC 組(P<0.05), 72 和120 h 的HN 組肺濕/干重比均高于0 h 的HN 組(P<0.05);48、72 和120 h 的HC 組的肺濕/干重比均高于HN組(P<0.05)。 高原寒冷環(huán)境下暴露48 h 時HC 組肺濕/干重比達到最高值(5.4218 ± 0.3983),與72和120 h 的HC 組比較無顯著性差異(P>0.05)。

注:與高原常溫組0 h 相比, ?P<0.05;與高原寒冷組0 h 相比, #P<0.05;與高原常溫組48 h 相比,&P<0.05;與高原常溫組72 h 相比,※P<0.05;與高原常溫組120 h 相比,∮P<0.05。圖1 各組大鼠肺組織W/D 比的比較(±s)Note.Compared with the HN group for 0 h, ?P<0.05.Compared with the HC group for 0 h, # P<0.05.Compared with the HN group for 48 h,&P < 0.05.Compared with the HN group for 72 h,※P<0.05.Compared with the HN group for 120 h,∮P<0.05.Figure 1 Change of the lung water content in lung tissues in the rats of different groups

2.2 肺泡灌洗液蛋白質(zhì)含量分析

如圖2 所示,48、72 和120 h 的HC 組灌洗液蛋白含量均高于0 h 的HC 組(P<0.05),72 和120 h的HN 組灌洗液蛋白含量均高于0 h 的HN 組(P<0.05);48、72 和120 h 的HC 組的灌洗液蛋白含量均高于HN 組(P<0.05)。 高原寒冷環(huán)境下暴露48 h 時HC 組灌洗液蛋白含量達到最高值(5.4218±0.3983),與72 和120 h 的HC 組比較無顯著性差異(P>0.05)。

2.3 肺組織病理學改變

注:與高原常溫組0 h 相比, ?P<0.05;與高原寒冷組0 h 相比, #P<0.05;與高原常溫組48 h 相比,&P<0.05;與高原常溫組72 h相比,※P<0.05;與高原常溫組120 h 相比,∮P<0.05。圖2 各組大鼠BALF 蛋白質(zhì)含量比較(±s)Note.Compared with the HN group for 0 h, ?P<0.05.Compared with the HC group for 0 h, # P<0.05.Compared with the HN group for 48 h,&P <0.05.Compared with the HN group for 72 h,※P<0.05.Compared with the HN group for 120 h,∮P<0.05.Figure 2 Comparison of bronchoalveolar lavage fluid protein content in the rats of different groups

大鼠肺組織HE 染色顯示,正常對照組肺泡結構完整,肺間隔無增厚,肺泡腔或肺間質(zhì)未見明顯水腫,肺泡和肺間質(zhì)未見白細胞及紅細胞滲出(圖3A)。 與正常對照組相比,HN 組及HC 組表現(xiàn)出不同程度的肺組織結構損傷,表現(xiàn)為肺泡結構完整性受損,肺泡腔相互融合擴張,形成巨大氣腫狀肺泡(圖3B),局部肺組織實變、部分肺泡塌陷(圖3C),部分靜脈血管水腫,肺間質(zhì)中有水腫液滲出(圖3D),部分肺泡管、肺泡囊及肺泡中有紅細胞浸潤(圖3E)。

圖3 肺病理組織學變化Figure 3 Lung histopathological changes

如圖4 所示,48、72 和120 h 的HC 組病理組織學評分均高于0 h 的HC 組(P<0.05),72 和120 h的HN 組病理組織學評分均高于0 h 的HN 組(P<0.05);48、72 和120 h 的HC 組的病理組織學評分均高于HN 組(P<0.05)。 高原寒冷環(huán)境下暴露48 h 時HC 組病理組織學評分達到最高值(5.4218±0.3983),與72 和120 h 的HC 組比較無顯著性差異(P>0.05)。

注:與高原常溫組0 h 相比, ?P<0.05;與高原寒冷組0 h 相比, #P<0.05;與高原常溫組48 h 相比,&P<0.05;與高原常溫組72 h 相比,※P<0.05;與高原常溫組120 h 相比,∮P<0.05。圖4 各組大鼠肺損傷評分的比較(±s)Note.Compared with the HN group for 0 h, ?P<0.05.Compared with the HC group for 0 h, #P<0.05.Compared with the HN group for 48 h ,&P< 0.05.Compared with the HN group for 72 h,※ P < 0.05.Compared with the HN group for 120 h,∮P<0.05.Figure 4 Comparison of score of lung injury in the rats of different groups

3 討論

長期以來,由于低壓缺氧、寒冷、復雜地形等極端環(huán)境因素,生活在高海拔地區(qū)一直是對人類的挑戰(zhàn)[12]。 高海拔地區(qū)降低的氧分壓創(chuàng)造了一個獨特的環(huán)境條件稱為高原低壓缺氧環(huán)境[13]。 在快速攀登海拔3000 m 以上地區(qū)的人群中,由急性高原病發(fā)展而來的急性高原肺水腫仍是一個未解決的問題。在高海拔地區(qū)出現(xiàn)呼吸困難、咳嗽、粉紅色泡沫痰[1],可能嚴重影響活動或緊急軍事任務。

急性高原肺水腫是急進高海拔地區(qū)時發(fā)生的一種非心源性肺水腫,通常發(fā)生在到達高海拔地區(qū)后2~5 d[6]。 高原環(huán)境大鼠肺水腫模型的成功建立受到海拔高度、減壓速度,持續(xù)時間、艙內(nèi)環(huán)境及機體情況等多種因素影響[14-16]。 現(xiàn)有的高原肺水腫動物模型的研究都使用了大鼠模型。 大鼠在低氧條件下可誘導低氧性肺血管收縮反應,嚴重的低氧性肺血管收縮反應會導致高原肺水腫的發(fā)生[17]。以往的高原肺水腫模型建立方法,著重于海拔高度、缺氧和勞累等因素,國內(nèi)目前還未見報道有研究關注溫度對于肺水腫模型建立的影響,為了更加符合高原環(huán)境寒冷、低壓、缺氧的極端環(huán)境,本次實驗在肺水腫模型建立的條件中加入了溫度這一影響因素,通過降低環(huán)境溫度結合低壓缺氧等條件更快、更全面的建立重復性好、最貼近高原真實環(huán)境的肺水腫模型,為急性高原肺水腫后續(xù)的治療創(chuàng)造基礎條件。

本實驗通過特殊的低壓缺氧結合寒冷模擬高海拔暴露大鼠高原肺水腫的發(fā)生,即24、48、72 和120 h 的寒冷低壓缺氧狀態(tài)。 比較在不同環(huán)境溫度影響下不同暴露時間大鼠肺組織的變化及特異性指標,建立穩(wěn)定的急性高原肺水腫實驗模型。 本實驗通過肺組織的HE 染色發(fā)現(xiàn),相較于0 h 時,高原常溫及高原寒冷組其他時間點的大鼠均表現(xiàn)出不同程度的肺組織損傷表現(xiàn),尤其是高原寒冷48 h 組和高原常溫72 h 組,肺組織肺泡間隔明顯增寬,大量紅細胞和炎性細胞溢出,且出現(xiàn)肺泡間隔的明顯水腫,這一結果說明在缺氧刺激下,肺部血管收縮,使血液更多的分布在阻力較小的毛細血管,使水腫液從毛細血管漏出、轉(zhuǎn)移并潴留,引起肺間質(zhì)和肺泡水腫。 肺組織濕/干重比值是評估動物模型肺水腫整體嚴重程度的指標,肺泡灌洗液蛋白質(zhì)含量是評估肺泡毛細血管通透性的指標[18]。 有相關研究表明,高原肺水腫大鼠具有肺含水量增加,肺泡毛細血管通透性增高的特征[18-20]。 同樣的,在我們的研究中高原寒冷48 h 組和高原常溫72 h 組大鼠肺組織中的濕/干重比值和肺泡灌洗液蛋白質(zhì)含量明顯高于其他組,說明高原環(huán)境會使大鼠肺泡毛細血管通透性增強。 由此,結合上述3 項檢測指標的變化,在高原寒冷環(huán)境48 h 組和高原常溫72 h 組大鼠的肺水腫模型建立成功,并且我們可以推定寒冷因素加速了肺水腫的發(fā)展進程,可更快的建立急性高原大鼠肺水腫模型。

這種現(xiàn)象在肺組織病理變化中也同樣得到體現(xiàn)。 這說明了寒冷可以加劇高原肺水腫的形成。寒冷應激是一種嚴重的急性應激類型,可能導致局部及全身的免疫系統(tǒng)損傷[21],降低其防御功能,使其易受致病因素的影響[22],誘導氣道炎癥反應,導致肺功能下降[23]。 寒冷誘導的靶器官損害首先發(fā)生在血流豐富的組織中。 肺作為肺循環(huán)中的主要器官,為全身提供氧氣,是對血流變化最敏感的器官[24]。 寒冷應激是一種已知的誘發(fā)和加重呼吸系統(tǒng)疾病的環(huán)境因素[25]。 相關研究表明,暴露于冷應激可直接引起血流動力學改變,導致血栓形成、組織缺血再灌注和炎癥損傷[26]。 在寒冷應激期間,細胞外液的結晶會直接損傷細胞膜,使細胞膨脹[27],影響滲透壓,導致毛細血管通透性在快速血管收縮下發(fā)生變化[28]。 此外,肺直接暴露在冷空氣中,導致肺動脈平滑肌收縮甚至痙攣[29]。 在高原環(huán)境中,缺氧會導致肺血管平滑肌收縮[13],加上寒冷因素的影響,會加劇肺血管的收縮,進而形成肺動脈高壓。在本實驗中,由于設備和操作的復雜性,沒有測定肺動脈壓這項指標。 但在林雪等[30]研究中,與平原對照組相比,高原低壓低氧組大鼠的肺動脈壓力明顯增高。 高原寒冷組大鼠的肺組織濕/干重比值和肺泡灌洗液蛋白質(zhì)含量顯著高于高原常溫組,并且肺組織病理學顯示肺泡上皮完整性被破壞,肺泡-毛細血管屏障功能持續(xù)受損。 由此,我們可以推測,缺氧及寒冷聯(lián)合作用會顯著收縮肺部動脈,使肺動脈壓力升高,大量肺部血液積聚于壓力相對較小的毛細血管,導致毛細血管壓力升高,血液中蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)通過肺泡-毛細血管屏障進入肺泡腔,使毛細血管中的膠體滲透壓降低并且破壞了肺泡上皮的完整性,使更多的富含蛋白質(zhì)的水腫液流入肺泡。

最后,從肺組織病理、肺組織濕/干重比值及肺泡灌洗液蛋白質(zhì)含量的結果來看,在高原常溫環(huán)境暴露72 h 組可建立急性高原肺水腫模型,但高原寒冷組的大鼠只需48 h 就可形成急性高原肺水腫。所以,暴露在模擬海拔7000 m 高原寒冷低壓缺氧環(huán)境至48 h 可成功建立急性高原肺水腫模型,且造模方法簡便有效,用時更短,適合大批量快速的動物造模,可重復性好,為我們后續(xù)對急性高原肺水腫的發(fā)病機制與預防治療打下良好的基礎。