韓 清，周婷婷△，樊娜娜，徐 文

(1.棗莊市婦幼保健院產(chǎn)科，山東 棗莊 277000；2.青島大學(xué)附屬醫(yī)院藥學(xué)部，山東 青島 266003 )

GDM是一種妊娠期常見并發(fā)癥，臨床發(fā)現(xiàn)GDM孕婦容易合并妊娠期高血壓。目前，對(duì)于GDM合并妊娠期高血壓的具體發(fā)病機(jī)制尚不清楚，而腎損傷是GDM合并妊娠期高血壓的微血管病變的主要表現(xiàn)之一，給母嬰健康帶來(lái)危害。因而，敏感有效的腎臟功能監(jiān)測(cè)指標(biāo)對(duì)GDM合并妊娠期高血壓評(píng)估尤為重要。目前，研究者在診斷方面的指標(biāo)如胱抑素、β微球蛋白、同型半胱氨酸等取得了一定成果，但早期診斷仍有一定難度[1]。近年來(lái)，研究者通過代謝組學(xué)進(jìn)行一些研究，譚兵等[1]用三重四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜設(shè)備篩選出LPC18:0在重度子癇前期孕婦及正常孕婦存在差異。LPC在糖尿病動(dòng)物中可以促進(jìn)腎臟炎癥和腎小管間質(zhì)纖維化[2]，從而可以損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞引起腎功能損傷。而LC-MS/MS是一種針對(duì)性較強(qiáng)代謝譜的分析技術(shù)，對(duì)設(shè)計(jì)的代謝物進(jìn)行定量或半定量測(cè)定，達(dá)到驗(yàn)證代謝標(biāo)記物的目的，且在測(cè)定樣本前經(jīng)過系統(tǒng)的方法學(xué)驗(yàn)證，結(jié)果更準(zhǔn)確。本文利用LC-MS/MS對(duì)可能與GDM合并高血壓有關(guān)的代謝物L(fēng)PC18:0水平進(jìn)行測(cè)定，并對(duì)其與腎功能損傷的相關(guān)性進(jìn)行研究，希望在早期發(fā)現(xiàn)腎損傷，以控制疾病的發(fā)展。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2021年1—12月棗莊市婦幼保健院住院的GDM孕婦120例作為觀察組，按是否合并高血壓分為GDM合并妊娠期高血壓組(60例)和GDM組(60例)，入組患者均根據(jù)第9版《婦產(chǎn)科學(xué)》[3]中相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)鑒別并確診。 根據(jù)血清LPC18:0水平，將GDM合并妊娠期高血壓組分為L(zhǎng)PC18:0≥110 μg/mL組(24例)和LPC18:0<110 μg/mL組(36例)，另選同期住院的健康孕婦60例作為對(duì)照組。排除標(biāo)準(zhǔn)：存在慢性高血壓、多胎妊娠、羊水過少、羊水過多等妊娠相關(guān)疾病者; 存在前置胎盤、子宮肌瘤、胎盤早剝、腎病、病毒性肝炎、糖尿病、心臟病、自身免疫性疾病等其他妊娠并發(fā)癥。所有納入研究的孕婦均簽署了知情同意，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2方法

1.2.1儀器與試劑 患者于孕周34～40周時(shí)采集清晨空腹肘靜脈血 5 mL，HbA1c檢測(cè)采用高壓液相層析法，儀器為愛科萊HA-8160全自動(dòng)HbA1c分析儀。采用西門子ADVIA2400全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)空腹葡萄糖(FBG)、血清素氮(BUN)、血清肌酐(Cr)、尿微量白蛋白(UmA1b)、尿微量蛋白/肌酐(ACR)等指標(biāo)。采用固相競(jìng)爭(zhēng)化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫法檢測(cè)FINS，根據(jù)公式計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)，HOMA-IR=FBG(mmol/L)×FINS(mU/L)/22.5。血清LPC18:0水平的檢測(cè)與處理采用Agilent 1290Ⅱ高效液相色譜儀(配備G7120高壓二元泵，G7167B自動(dòng)進(jìn)樣器，G7116B柱溫箱，美國(guó)Agilent 公司)、API4000+三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)和Analyst 1.6.3質(zhì)譜數(shù)據(jù)處理軟件(美國(guó)AB公司)；LPC18:0(純度大于99%)，所有試劑均由上海蔚霆生物科技有限公司提供。

1.2.2代謝組學(xué)樣品制備 取禁食6 h研究孕婦的肘靜脈血液5 mL于促凝管中，12 000 r/min速度的離心機(jī)內(nèi)離心10 min，取上清液作為樣品放置于-80 ℃冰箱中待檢。實(shí)驗(yàn)時(shí)常溫解凍，將樣本血清常溫解凍后,取100 μL樣本血清與30 μL甲醇混合，渦旋振蕩30 s后,4 ℃下靜置5 min。將混合物在4 ℃，離心半徑為8 cm，12 000 r/min離心速度的條件下離心5 min，取5 μL上清液待測(cè)。

1.2.3代謝組學(xué)樣本分析[4]色譜條件色譜柱為Ultimate AQ-C18column(3.0 μm,2.1 mm×100 mm，上海月旭科技有限公司)；流動(dòng)相乙腈(A)-0.1%的甲酸溶液(B)梯度洗脫(0～0.5 min，8% A；0.5～1 min，8%→100% A；1 ～ 6 min，100% A)；流速為0.4 mL/min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量為5 μL。質(zhì)譜條件采用電噴霧離子源(ESI),正離子模式，質(zhì)譜參數(shù)：碰撞氣6×104Pa，氣簾氣2×105Pa，霧化氣4.48×105Pa,輔助氣4.48×105Pa，噴霧電壓5 500 V，霧化溫度550 ℃;負(fù)離子模式,質(zhì)譜參數(shù)：碰撞氣6×104Pa，氣簾氣2×105Pa，霧化氣4.48×105Pa,輔助氣4.48×105Pa,噴霧電壓4 500 V,霧化溫度550 ℃。LPC18:0的MRM條件為正離子模式。DP 60,CE 40,母離子524.7，子離子184.2。

2 結(jié) 果

2.1各組孕婦臨床資料比較 各組一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組孕婦臨床資料比較

2.2各組血清指標(biāo)水平比較 GDM合并妊娠期高血壓組與GDM組血清LPC 18:0，UmA1b，ACR水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。GDM組與正常對(duì)照組血清LPC 18:0、FBG、FINS，HbA1c、HOMA-IR水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。LPC18:0≥110 μg/mL組與LPC18:0<110 μg/mL組UmA1b、ACR水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組血清指標(biāo)水平比較

注：與GDM組比較，aP<0.05;與正常對(duì)照組比較，bP<0.05。

2.3血清LPC18:0水平與血糖及腎功能指標(biāo)的相關(guān)性 Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示：GDM合并妊娠期高血壓孕婦血清LPC18:0水平與BUN、Cr、UmA1b、ACR水平均呈正相關(guān)(P<0.05)。與FBG、FINS、HbA1c水平均無(wú)相關(guān)性(P>0.05)。與HOMA-IR呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。見表3。

表3 血清LPC18:0水平與血糖及腎功能指標(biāo)水平的相關(guān)性

3 討 論

GDM合并妊娠期高血壓是一種嚴(yán)重影響母嬰健康的疾病，由此引起的腎功能損害是種嚴(yán)重影響孕婦及遠(yuǎn)期健康的一種并發(fā)癥。故希望可以找到一種體現(xiàn)病情變化的小分子代謝物，可以早期發(fā)現(xiàn)及控制病情發(fā)展。代謝組學(xué)研究的是恰恰能夠真實(shí)反映人體各系統(tǒng)的生理、病理狀態(tài),為臨床診治提供有力依據(jù)的小分子[5]。

LPC可以招募巨噬細(xì)胞參與吞噬，釋放抗炎介質(zhì)[6]，收縮血管[7]，促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的增殖，增加血管剪應(yīng)力][8]，損害血管皮組織的連續(xù)性，促進(jìn)血管炎癥反應(yīng)，影響了血小板聚集及血栓形成[9]。LPC這些作用與妊娠期高血壓目前發(fā)病機(jī)制具有一致性，妊娠期高血壓是一種代謝性疾病，LPC可能參與了妊娠期高血壓的發(fā)生和發(fā)展，高血壓是腎損傷的主要因素，故LPC有可能作為腎損傷的代謝指標(biāo)。YEA等[10]利用色譜質(zhì)譜聯(lián)合的方法發(fā)現(xiàn)LPC可調(diào)節(jié)血糖水平。本研究發(fā)現(xiàn)，血清LPC18:0水平與HOMA-IR呈負(fù)相關(guān)，血清LPC18:0可能參與血糖的調(diào)節(jié)。有學(xué)者用LC-MS/MS驗(yàn)證出尿二棕櫚酰磷脂酰膽堿是腎功能損傷的一種敏感標(biāo)志物[11]。LPC由白蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)闃O低密度脂蛋白、低密度脂蛋白,這種作用不依賴于高脂血癥,LPC增高可能是腎病低蛋白血癥患者心血管疾病不成比例增加的重要因素[12]。本研究顯示，血清LPC18:0水平在GDM孕婦中水平升高，在GDM合并妊娠期高血壓孕婦水平更高，說明LPC18:0在GDM合并妊娠期高血壓孕婦體內(nèi)代謝更加活躍，并且與腎功能損傷指標(biāo)BUN、Cr、UmA1b、ACR均有一定的相關(guān)性，故血清LPC18:0可能是妊娠期高血壓合并GDM腎功能損傷的監(jiān)測(cè)指標(biāo)。GDM與妊娠期高血壓均為代謝性疾病，GDM孕婦容易出現(xiàn)妊娠期高血壓，研究發(fā)現(xiàn)LPC18:0≥110 μg/mL組與LPC18:0<110 μg/mL組UmA1b、ACR水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，故LPC18:0水平有可能通過一些代謝通路影響腎臟疾病的發(fā)生和發(fā)展。根據(jù)上述研究，可能在子治療時(shí)通過改變這些溶血性磷脂的含量，改善腎臟功能，從而可能預(yù)防或者延緩改善患者的癥狀。

綜上所述，代謝組學(xué)研究的是人體最終的代謝產(chǎn)物，能真實(shí)反映人體的代謝狀態(tài)，代謝物穩(wěn)定，LC-MS/MS技術(shù)嚴(yán)謹(jǐn)、準(zhǔn)確，可更好地應(yīng)用于臨床；考慮樣本量小，還需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量及監(jiān)測(cè)范圍。隨著研究的進(jìn)展，聯(lián)合不同代謝物及其通路相關(guān)研究方法對(duì)妊娠期糖尿病及妊娠期高血壓進(jìn)行研究，可更好地發(fā)揮其臨床應(yīng)用價(jià)值。