姜曉靜伍和平曲春娟焦 坤曲明靜任 艷*鞠 倩*

(1.山東省花生研究所,山東 青島 266100;2.惠州海關(guān)綜合技術(shù)中心,廣東 惠州 516001)

黑絨鰓金龜(MaladeraorientalisMotschulsky)又名東方金龜子、天鵝絨金龜子,隸屬于鞘翅目(Coleoptera)金龜甲總科(Scarabaeoidea)鰓金龜科(Melolonthidae),在東亞的中國(guó)、日本、朝鮮、蒙古和地處亞歐大陸的俄羅斯均有分布,其中以我國(guó)的東北和華北地區(qū)危害最為嚴(yán)重[1]。黑絨鰓金龜?shù)募闹髦参飺?jù)統(tǒng)計(jì)高達(dá)149種,成蟲主要危害楊樹、柳樹、榆樹、刺槐、蘋果、梨子、葡萄、桑樹、向日葵等的葉片和幼芽,食性雜、食量大;它的幼蟲又稱為蠐螬,可取食萌發(fā)的林木種子,以及植物的根部和果實(shí),如花生、大豆等作物,是重要的地下害蟲,也是國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的最難防治的土棲性害蟲[2-3]。染色體是生物遺傳物質(zhì)的載體,伴隨著基因組測(cè)序技術(shù)的發(fā)展,將害蟲的染色體核型分析與基因組數(shù)據(jù)相結(jié)合開(kāi)展研究,不僅對(duì)于加深了解物種遺傳與進(jìn)化具有十分重要的意義,而且為害蟲防治提供了新思路和新方法。

昆蟲是地球生物圈的重要成員,也是種類最多的生物類群,而鞘翅目是昆蟲綱乃至動(dòng)物界物種最豐富、分布最廣的一個(gè)目。鞘翅目包括四個(gè)亞目:原鞘亞目(Archostemata)、菌食亞目(Myxophaga)、肉食亞目(Adaphaga)和多食亞目(Polyphaga)。國(guó)內(nèi)對(duì)鞘翅目昆蟲的染色體研究較少,主要是多食亞目的幾個(gè)物種。楊致遠(yuǎn)等1989年報(bào)道了米象(Sitophilusoryzae)和玉米象(Sitophiluszeamais)的染色體數(shù)目均為2n=22[4];邵紅光等1994年報(bào)道了新疆6種芫菁染色體核型,染色體數(shù)目2n=18~21,性別決定機(jī)制為XY或者XO型[5];陳斌等2005年報(bào)道了金龜總科碼絹金龜50個(gè)精巢分裂中期細(xì)胞的85%細(xì)胞的染色體數(shù)目n=9[6];董原等2008年報(bào)道了蓼藍(lán)齒脛葉甲的單倍染色體數(shù)目n=13+Xyp[7];劉平等2010年報(bào)道了松墨天牛(Monochamusalternatus)和光肩星天牛(Anoplophoraglabripennis)的染色體核型,它們的染色體數(shù)目均為2n=20,性別決定機(jī)制為XY[8]。國(guó)外對(duì)鞘翅目昆蟲的染色體研究起步較早,已經(jīng)有一百多年的時(shí)間,并且積累了很多物種的染色體核型數(shù)據(jù)。Yadav等于1979年總結(jié)了已發(fā)表的多食亞目的金龜總科的物種有209個(gè),分布于16個(gè)科73個(gè)屬,染色體個(gè)數(shù)2n=12、14、18、19、20、21、22、30,其中有160個(gè)物種的染色體個(gè)數(shù)是2n=20[9]。而Diogo等在2008年再次更新總結(jié)了金龜總科已發(fā)表染色體核型的物種大約有380個(gè)[10]。Sendogan等在2016年總結(jié)了已知染色體核型的多食亞目擬步甲科(Tenebrionidae)的物種超過(guò)250種,該科的大多數(shù)物種染色體數(shù)目也是2n=20[11]。Angus等在2021年的文章中總結(jié)了已知染色體核型的多食亞目水龜甲科(Hydrophilidae)的物種有95個(gè),分布于33個(gè)屬,染色體個(gè)數(shù)2n=18、20、22、24、26、28、30、32[12]。多食亞目的其他科如郭公甲科(Cleridae)、擬花瑩科(Melyridae)、天?？?Cerambycidae)以及吉丁蟲科(Buprestidae)也有少數(shù)物種的染色體核型得到研究[13-14]。另外,肉食亞目的豉甲科(Gyrinidae)和龍虱科(Dytiscidae)的十幾個(gè)物種的染色體核型也獲得鑒定[15]。雖然已知染色體的物種數(shù)目有近千種,但與鞘翅目高達(dá)350 000個(gè)物種的數(shù)量比較還相差甚遠(yuǎn),因此鞘翅目昆蟲的核型分析研究顯得迫在眉睫。

研究昆蟲核型要選擇細(xì)胞分裂旺盛的組織為材料,這樣才易觀察到合適的有絲分裂和減數(shù)分裂的染色體行為。昆蟲的染色體研究所選用的材料有卵、精巢、卵巢、唾腺、馬氏管、腦神經(jīng)節(jié)等組織。一般來(lái)說(shuō)雙翅目昆蟲取唾腺來(lái)觀察染色體核型,也有蚊蟲、果蠅、赤眼蜂、蚤類的染色體研究取幼蟲的腦神經(jīng)節(jié)來(lái)觀察,而蚜蟲取3~4齡有翅或無(wú)翅若蟲胚胎觀察染色體核型,絕大多數(shù)昆蟲的染色體研究以精巢為材料。國(guó)內(nèi)鞘翅目昆蟲染色體研究主要用雄蟲的精巢[4-5,7],國(guó)外則會(huì)用到卵、中腸以及精巢[16]。

本文用黑絨鰓金龜?shù)某上x精巢來(lái)研究染色體核型,同時(shí)報(bào)道了一種制備時(shí)間短,步驟少,操作簡(jiǎn)單的鞘翅目昆蟲染色體核型制備方法。

1 材料和方法

1.1 材 料

試蟲采集及飼養(yǎng):供試?yán)ハx黑絨鰓金龜成蟲于2021年6月上旬采集于山東省花生研究所萊西試驗(yàn)基地。采集的成蟲雌雄分開(kāi),放在有透氣孔的箱子中用新鮮的榆樹葉喂養(yǎng),保持箱內(nèi)土壤的濕度。

試劑和儀器:秋水仙素(上海麥克林生化科技有限公司);卡寶品紅染色液(北京酷來(lái)搏科技有限公司);粘附載玻片(江蘇世泰實(shí)驗(yàn)器材有限公司);OLYMPUS SZ51體式顯微鏡和OLYMPUS BX53正置熒光顯微鏡、OLYMPUS DP74顯微成像系統(tǒng)(奧林巴斯株式會(huì)社)。

1.2 方 法

1.2.1 染色體標(biāo)本制備

前處理:將待處理昆蟲黑絨鰓金龜雄性成蟲洗凈備用。蟲體解剖:用昆蟲針將黑絨鰓金龜固定在體式顯微鏡蠟盤內(nèi),加生理鹽水(NaCl 6.8 g/L、CaCl20.2 g/L、KCl 0.2 g/L、MgCl2·6H2O 0.2 g/L、Na HCO30.15 g/L、葡萄糖7.7 g/L、蒸餾水1000 m L)至完全浸沒(méi)蟲體,用鑷子和解剖剪刀從昆蟲的腹部取出精巢組織。

標(biāo)本制備包括5個(gè)步驟:① 秋水仙素處理:將解剖出的精巢置于0.05%的秋水仙素(生理鹽水溶解秋水仙素粉末)處理30 min。② 低滲:秋水仙素處理后加入0.075 mol/L的KCl低滲處理20 min。③染色:用鑷子取出精巢置于載玻片上,滴幾滴卡寶品紅染液染色28 min。④ 壓片:用50%的冰醋酸分色后壓片,用冰醋酸分色時(shí)盡量使背景染料顏色褪去,并用濾紙吸去多余染料和冰醋酸;在壓片時(shí)蓋玻片輕輕放下,避免與載玻片之間有過(guò)多氣泡;蓋上蓋玻片后,雙層濾紙蓋在載玻片上,用食指按壓,注意不要垂直按壓,食指由左到右逐漸施力,不要使蓋玻片移動(dòng)。⑤ 鏡檢:將標(biāo)本放在油鏡下面,在正置熒光顯微鏡的40倍物鏡下觀察,找到處于分裂中期的細(xì)胞,選擇染色體分散效果好且形態(tài)好的細(xì)胞在100倍物鏡下拍照,鏡臺(tái)測(cè)微尺的單位是20μm。

1.2.2 染色體核型分析

用Photoshop圖像軟件進(jìn)行核型分析,計(jì)算每條染色體的實(shí)際長(zhǎng)度、相對(duì)長(zhǎng)度、臂比值和著絲粒指數(shù)。染色體實(shí)際長(zhǎng)度的測(cè)量使用軟件標(biāo)尺工具,依次打開(kāi):圖像—分析—設(shè)置測(cè)量比例,根據(jù)照片中的標(biāo)準(zhǔn)刻度,設(shè)置合適的測(cè)量比例,量取染色體的實(shí)際長(zhǎng)度,計(jì)算所需數(shù)據(jù)。染色體實(shí)際長(zhǎng)度隨染色體收縮程度不同而有顯著變化,對(duì)同一種生物的染色體絕對(duì)長(zhǎng)度,各人所測(cè)結(jié)果往往差異較大,故多用相對(duì)長(zhǎng)度。

按照Levan等的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行染色體核型分析(表1),通過(guò)臂比值和著絲粒指數(shù)判斷染色體的類型[17],最后確定黑絨鰓金龜核型公式。

表1 染色體分類標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Chromosome classification criteria

2 結(jié)果與分析

2.1 黑絨鰓金龜染色體數(shù)目及性別決定機(jī)制

從鏡檢的細(xì)胞中可觀察到黑絨鰓金龜染色體行為的3個(gè)不同時(shí)期:減數(shù)分裂的粗線期、中期Ⅰ、中期Ⅱ(圖1)。選取染色體分散良好、結(jié)構(gòu)完整、形態(tài)清晰的減數(shù)分裂中期Ⅰ分裂相的精母細(xì)胞進(jìn)行觀察統(tǒng)計(jì)。在減數(shù)分裂中期Ⅰ這個(gè)時(shí)期,兩個(gè)同源染色體形成的二價(jià)體進(jìn)行最大的濃縮并縮短(圖2)。從精巢中找到10條二價(jià)體的細(xì)胞總數(shù)有30個(gè),二價(jià)體數(shù)目少于10的細(xì)胞所占比例極小,可能是制片的過(guò)程中由外因引起的個(gè)別染色體丟失。得出黑絨鰓金龜染色體數(shù)2n=20。同時(shí)可明顯觀察到減數(shù)分裂中期Ⅰ性染色體X相對(duì)大于呈點(diǎn)狀的性染色體Y,二者構(gòu)成典型的“降落傘狀二價(jià)體”結(jié)構(gòu)Xyp(圖2)。

圖1 黑絨鰓金龜精母細(xì)胞減數(shù)分裂不同時(shí)期的染色體形態(tài)Fig.1 Meiosis of M.orientalis from testis

圖2 黑絨鰓金龜精母細(xì)胞減數(shù)分裂中期Ⅰ分裂相Fig.2 The spermatogonial metaphaseⅠchromosomes of M.orientalis

綜上所述,黑絨鰓金龜?shù)碾p倍染色體組成為2n=20(9+Xyp),性別決定機(jī)制為Xyp型。

2.2 黑絨鰓金龜染色體核型

通過(guò)對(duì)黑絨鰓金龜精母細(xì)胞減數(shù)分裂中期Ⅰ和Ⅱ分裂相進(jìn)行鏡檢,并統(tǒng)計(jì)染色體的相對(duì)長(zhǎng)度、臂比值和染色體類型(圖3,表2)。結(jié)果顯示,黑絨鰓金龜?shù)某Ｈ旧w相對(duì)長(zhǎng)度為6.88~12.88,X染色體的相對(duì)長(zhǎng)度為6.22±0.14,Y染色體的相對(duì)長(zhǎng)度為2.85±0.13,Y染色體最小。7號(hào)和9號(hào)染色體的臂比值分別為2.24、1.70,著絲粒指數(shù)分別為30.86、37.04,在25.00~37.50之間,為亞中部著絲粒染色體;Y染色體為端部著絲粒染色體;其他染色體著絲粒指數(shù)為43.29~49.75,在37.50~50.00之間,均屬于中部著絲粒染色體。因此,黑絨鰓金龜?shù)暮诵蜑?n=16m+4sm(♀),2n=15m+4sm+t(♂)。

表2 黑絨鰓金龜?shù)娜旧w相對(duì)長(zhǎng)度、臂比值和著絲粒指數(shù)Table 2 The relative length and arm ratio of chromosomes of M.orientalis

圖3 黑絨鰓金龜精母細(xì)胞減數(shù)分裂中期Ⅰ和Ⅱ分裂相及核型Fig.3 The chromosomal metaphase and karyotypes of M.orientalis

3 討 論

在鞘翅目昆蟲中,目前報(bào)道的絕大部分物種的染色體數(shù)目為2n=20,因此這一染色體數(shù)目被稱為甲蟲的“典型數(shù)目”。本文研究的黑絨鰓金龜染色體,二倍體數(shù)目為2n=20,與鞘翅目昆蟲的“典型數(shù)目”一致。同時(shí),黑絨鰓金龜?shù)男匀旧wX、Y在減數(shù)分裂中期Ⅰ形成“降落傘狀二價(jià)體”,性別決定機(jī)制為Xyp,這也符合甲蟲性別決定機(jī)制的特點(diǎn)(其他目昆蟲很少或者完全沒(méi)有Xyp的性別決定機(jī)制),屬于鞘翅目昆蟲祖先保留下來(lái)的一種古老染色體特征[18-19]。甲蟲性染色體在減數(shù)分裂中期Ⅰ形成的Xyp二價(jià)體,對(duì)于減數(shù)分裂后期Ⅰ發(fā)生的性染色體正確分離有重要作用[20]。

目前,國(guó)外對(duì)鰓金龜科甲蟲染色體核型的研究涉及的物種有40多種,絕大部分物種的染色體數(shù)目是20個(gè),性別決定機(jī)制為Xyp,也有個(gè)別物種的性別決定機(jī)制是XO型[9,21-23]。本文的黑絨鰓金龜染色體核型研究是國(guó)內(nèi)首次關(guān)于鰓金龜科物種的報(bào)道。

用于鞘翅目昆蟲染色體核型制片的常見(jiàn)組織類型有卵、中腸、腦、卵巢和精巢等,其中腦適用于幼蟲染色體制備[8,16]。本實(shí)驗(yàn)選取雄性成蟲的精巢,每個(gè)精巢由六個(gè)精巢管組成,相互分開(kāi)游離在腹節(jié)背隔之下,比較容易解剖,相比其他組織更容易獲得。同時(shí),我們也做了腦和卵的染色體制備,找到的分裂相細(xì)胞數(shù)目較少,而精巢染色體制備獲得清晰的分裂相細(xì)胞數(shù)目更多。另外,本文未使用離心機(jī)分離精巢細(xì)胞,降低了實(shí)驗(yàn)對(duì)儀器的依賴性,避免了離心操作對(duì)細(xì)胞的影響,提高了制備核型玻片標(biāo)本的成功率。本研究的黑絨鰓金龜染色體核型制備步驟包括:取材、預(yù)處理、低滲、染色、壓片,整個(gè)過(guò)程僅需要大約1.5 h,是一種取材容易,制備時(shí)間短,制備步驟少,操作簡(jiǎn)單的染色體核型確定方法(圖4)。精巢組織也沒(méi)有經(jīng)過(guò)勻漿離心,直接通過(guò)壓片處理獲得完整的染色細(xì)胞。在壓片時(shí)蓋玻片輕輕放下,避免與載玻片之間有過(guò)多氣泡。蓋上蓋玻片后,雙層濾紙蓋在載玻片上,用食指按壓,注意不要垂直按壓,食指由左到右逐漸施力,也不要使蓋玻片移動(dòng)。我們使用該方法也鑒定了一種麗金龜以及其他兩種鰓金龜物種的染色體核型(數(shù)據(jù)未發(fā)表)。固定是借助理化方法迅速將組織細(xì)胞殺死,并盡量保持其形態(tài)結(jié)構(gòu)及內(nèi)含物的真實(shí)狀態(tài)。傳統(tǒng)的吉姆薩染色固定液最好現(xiàn)配現(xiàn)用,長(zhǎng)時(shí)間放置影響固定效果,且固定時(shí)間過(guò)長(zhǎng),一般為15~1 440 min[7-8]。動(dòng)物細(xì)胞沒(méi)有細(xì)胞壁因而更容易處理,使用的卡寶品紅染色液的成分中含有酒精,酒精也可以起到固定作用,因此實(shí)驗(yàn)過(guò)程中低滲處理后直接進(jìn)行染色,無(wú)需固定,簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)程序,使步驟更簡(jiǎn)單、方便,且節(jié)省時(shí)間。

圖4 黑絨鰓金龜染色體核型制備步驟Fig.4 The karyotype and chromosome preparation steps of M.orientali

隨著基因組學(xué)的發(fā)展,生物染色體核型分析也越來(lái)越有必要。染色體研究對(duì)了解生物的遺傳變異、性別決定、個(gè)體發(fā)育和生理過(guò)程的調(diào)控等方面有重要意義,能為確定生物類群的地位、闡明物種的歷史及其演化提供重要的依據(jù),對(duì)解決近緣種之間的分類問(wèn)題亦有作用。本文通過(guò)對(duì)黑絨鰓金龜染色體的相對(duì)長(zhǎng)度、著絲粒指數(shù)、臂比值等核型指數(shù)的分析,確定了黑絨鰓金龜?shù)暮诵吞卣?為進(jìn)一步的細(xì)胞遺傳學(xué)研究提供了一定基礎(chǔ)。同時(shí),我們?cè)趯?shí)驗(yàn)過(guò)程中摸索建立了一種更為簡(jiǎn)單快速的金龜子染色體核型制備方法,方便了更多的鞘翅目物種進(jìn)行染色體核型鑒定研究。