任宇坤，張 瓊，張 晴，林 麗，楊素清，安月鵬*

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，哈爾濱 150040）

課題組在既往對(duì)于T淋巴細(xì)胞亞群研究的基礎(chǔ)之上[1]，對(duì)濾泡輔助性T細(xì)胞（follicular helper T cell，Tfh）與其他T淋巴細(xì)胞亞群的交叉因子、B細(xì)胞淋巴因子（B cell lymphoma，Bcl）及信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）進(jìn)行了研究并提示中藥干預(yù)該通路及其靶點(diǎn)的可行性[2-3]，通過進(jìn)一步系統(tǒng)總結(jié)Tfh細(xì)胞的整體通路。本次實(shí)驗(yàn)擬在外周血的水平上，分析Tfh細(xì)胞的表達(dá)水平，同時(shí)對(duì)其上游刺激因子 IL-6（interleukin-6，IL-6）、IL-21，轉(zhuǎn)錄因子Bcl-6、STAT3，下游分泌因子趨化因子受體5（chemokine receptor 5，CXCR5）、可誘導(dǎo)共刺激分子（inducible co-stimulator，ICOS）、程序性死亡受體-1（programmed death receptor-1，PD-1）、血細(xì)胞簇分化抗原40 L（cluster of differentiation 40L，CD40L）進(jìn)行鏈鎖式研究，同時(shí)分析基于中醫(yī)“毒”“瘀”理論的中藥復(fù)方制劑蜈蚣敗毒飲的干預(yù)機(jī)制，為中醫(yī)藥的現(xiàn)代化研究及臨床治療銀屑病提供支持和佐證。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)C57BL/6小鼠30只，其中雌性小鼠15只、雄性小鼠15只，體質(zhì)量在15～24 g之間，鼠齡在4～7周之間，所有小鼠均來(lái)源于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)為SCXK（滬）2017-0005。小鼠經(jīng)常規(guī)單籠適應(yīng)性飼養(yǎng)（溫度在20～25 ℃之間，濕度在40%～65%之間，安靜通風(fēng)）3 d，自由飲水及采食。

1.2 主要試劑

紅細(xì)胞裂解液（大連美侖生物技術(shù)有限公司，MA0207）；PBS（北京索萊寶科技有限公司，P1022）；Anti-CD4（ 美 國(guó) Biolegend公 司，100510）；Anti-CXCR5（ 美 國(guó) Biolegend公 司，129804）；IL-6試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，ml002293）；IL-21試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，ml037878）；Bcl-6試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，ml028016）；STAT3試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，ml900517）；CXCR5試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，ml11179）；ICOS試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，ml600140）；PD-1試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，ml628616）；CD40L試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，ml202193）；甲氨蝶呤片（上海上藥信宜藥廠有限公司，210512）；咪喹莫特乳膏（四川明欣藥業(yè)有限責(zé)任公司，210715）；0.9%氯化鈉注射液（哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)股份有限公司，21051023）；蜈蚣敗毒飲中藥組分（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院門診中草藥局）。

1.3 主要儀器

流式細(xì)胞儀（美國(guó)Agilent公司，NovoCyte 3110）；低溫離心機(jī)（美國(guó)Thermo Fisher公司，SORVALL ST8/8R）；呼吸麻醉機(jī)（上海玉研科學(xué)儀器公司，Y1001410002）；電子天平（瑞士METTLER TOLEDO公司，ME104E）；振蕩器（美國(guó) Scientific Industries公司，Genie2）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 小鼠分組 30只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為6組，分別為生理鹽水空白對(duì)照組（空白組）、生理鹽水模型對(duì)照組（模型組）、甲氨蝶呤西藥對(duì)照組（西藥組）、蜈蚣敗毒飲中藥低劑量組（低劑量組）、蜈蚣敗毒飲中藥中劑量組（中劑量組）、蜈蚣敗毒飲中藥高劑量組（高劑量組），每組5只。

1.4.2 小鼠建模 采用外用咪喹莫特誘導(dǎo)建模的方法進(jìn)行銀屑病模型鼠的建立。具體方法為對(duì)除空白組外的其余25只小鼠進(jìn)行背部皮膚的備皮，備皮區(qū)域選擇背部3 cm×3 cm的光滑平整區(qū)域，盡可能保證每只小鼠的備皮區(qū)面積相同。每日以5%的咪喹莫特乳膏62.5 mg進(jìn)行局部涂擦1次，且于涂擦前剃除備皮區(qū)前日新生毛發(fā)，以相同的方法建模8 d。第9天時(shí)建模完成，觀察此時(shí)小鼠的銀屑病皮損指數(shù)并進(jìn)行記錄，再進(jìn)行后續(xù)的灌胃處理。

1.4.3 藥液灌胃 低劑量組、中劑量組、高劑量組藥液配制時(shí)分別取蜈蚣敗毒飲組分蜈蚣3 g，烏梢蛇20 g，紫草30 g，土茯苓30 g，鬼箭羽30 g，甘草10 g，按常規(guī)方法煎煮2次，經(jīng)人與小鼠的單位體表面積等藥量換算法，將其調(diào)配成濃度為0.08 g·mL-1、0.16 g·mL-1、0.32 g·mL-1的溶液，分別相當(dāng)于人口服蜈蚣敗毒飲藥量的0.5倍、1倍、2倍。西藥組的藥液配制時(shí)取甲氨蝶呤片以相同的方法調(diào)配成濃度為0.003 mg·mL-1的混懸液，相當(dāng)于人口服甲氨蝶呤片藥量的1倍?？瞻捉M、模型組的灌胃藥液則直接選擇0.9%氯化鈉注射液。

在第9天建模完成時(shí)即進(jìn)行灌胃，除西藥組外的其余5組均以對(duì)應(yīng)的藥液進(jìn)行灌胃，灌胃劑量為每次1 mL·200 g-1，頻次為每日2次，均在小鼠早晚進(jìn)食后的30 min進(jìn)行，共灌胃8 d。西藥組亦在建模完成時(shí)進(jìn)行灌胃8 d，前4 d選擇甲氨蝶呤混懸液，后4 d選擇0.9%氯化鈉注射液，其灌胃的劑量、頻次、方法同其余各組，因此種灌胃方法與臨床銀屑病患者口服甲氨蝶呤片治療銀屑病的方法相一致，以保證實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果更加貼近于臨床[4]。

1.4.4 皮損指數(shù)評(píng)價(jià) 采用課題組改良的鼠銀屑病皮損面積和嚴(yán)重程度指數(shù)（MPASI）評(píng)分法對(duì)各小鼠的皮損指數(shù)進(jìn)行量化評(píng)分。MPASI評(píng)分法較之PASI評(píng)分法，一方面增加了鼠特有的尾部結(jié)構(gòu)，另一方面重新定義了鼠的各部位體表組織占總體表面積的百分比，依次為頭部20%、上肢10%、軀干50%、下肢10%、尾部10%[5]。

因本實(shí)驗(yàn)銀屑病鼠的皮損均存在于背部（軀干部），其余體表部位無(wú)誘導(dǎo)出現(xiàn)的皮損，因此在計(jì)算MPASI分值時(shí)單純計(jì)算軀干部的分值即可。根據(jù)皮損嚴(yán)重程度情況，對(duì)紅斑、浸潤(rùn)、鱗屑三個(gè)指標(biāo)進(jìn)行由輕至重的0～4分量化評(píng)分；根據(jù)皮損所占軀干部整體皮膚的面積情況，對(duì)皮損面積比例進(jìn)行0～6分量化評(píng)分；MPASI=MPASI軀干=0.5×（紅斑分值+浸潤(rùn)分值+鱗屑分值）×皮損面積比例分值，并計(jì)算出灌胃前后MPASI分值的變化量（△MPASI），△MPASI= MPASI灌胃前－MPASI灌胃后。

1.4.5 含藥血清制備 在灌胃結(jié)束并進(jìn)行皮損指數(shù)評(píng)價(jià)后，采用呼吸麻醉的方法對(duì)各小鼠進(jìn)行麻醉，在無(wú)菌的環(huán)境下取腹主動(dòng)脈血8 mL，經(jīng)混勻和離心后制備成含藥的外周血單個(gè)核細(xì)胞，取部分血液于2 h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)，其余血液保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.6 流式細(xì)胞法檢測(cè) 血液經(jīng)離心后去上清，應(yīng)用無(wú)菌去離子水稀釋紅細(xì)胞裂解液，裂解2 min，再次離心去上清，經(jīng)洗滌1～2次后使用500 μL的PBS溶液，重懸沉淀。按照1:200的比例加入稀釋后的Anti-CD4、Anti-CXCR5，避光4℃孵育30 min，染色后的細(xì)胞經(jīng)離心5 min，去上清，加入500 μL的PBS溶液，重懸沉淀。選擇FITC、PE、APC、PE/Cyanine7通道，上機(jī)40 000個(gè)細(xì)胞，進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(cè)分析，以CD4+CXCR5+標(biāo)記的細(xì)胞表示外周血中Tfh細(xì)胞的表達(dá)量。

1.4.7 ELISA法檢測(cè) 血液樣本經(jīng)離心收集上清，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，除空白組外依次經(jīng)加樣、加酶、溫育、洗滌、顯色等步驟，最后終止反應(yīng)（藍(lán)色立轉(zhuǎn)為黃色），在15 min內(nèi)以450 nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度，通過軟件描繪標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算出各孔的濃度值。

1.4.8 相關(guān)性分析 除空白組外，整體分析其余5組共25只銀屑病模型鼠灌胃前后皮損指數(shù)的變化量（△MPASI）與灌胃治療后Tfh細(xì)胞表達(dá)量、Tfh細(xì)胞主導(dǎo)通路中的刺激因子（IL-6、IL-21）、轉(zhuǎn)錄因子（Bcl-6、STAT3）、分泌因子（CXCR5、ICOS、PD-1、CD40L）之間的相關(guān)性，從而分析經(jīng)不同的藥物干預(yù)后，銀屑病小鼠皮損的改善與Tfh細(xì)胞及其主導(dǎo)通路之間的關(guān)聯(lián)。分別求得回歸方程，描繪回歸曲線，計(jì)算相關(guān)系數(shù)（γ），并分析統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，所有數(shù)據(jù)均滿足正態(tài)分布，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）的形式表示，計(jì)數(shù)資料采用頻數(shù)或百分?jǐn)?shù)的形式表示，計(jì)量資料采用配對(duì)或獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，相關(guān)性比較采用Pearson相關(guān)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，以P＜0.01為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組皮損指數(shù)（MPASI）比較

見表1。

表1 各組皮損指數(shù)（MPASI）比較（±s，n = 5） 分

表1 各組皮損指數(shù)（MPASI）比較（±s，n = 5） 分

注：與模型組比較，# P＜0.05，## P＜0.01；與西藥組比較，△P＜0.05

組別 灌胃前MPASI 灌胃后MPASI △MPASI空白組 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00模型組 10.20±1.13 9.80±1.02 0.40±0.02西藥組 11.00±1.82 2.20±0.47## 8.20±2.32##低劑量組 10.60±2.01 7.80±3.08#△ 2.40±0.59#△中劑量組 9.60±1.76 5.60±1.59##△ 3.60±1.01##△高劑量組 10.40±1.85 2.40±0.55## 7.80±1.87##

2.2 各組外周血中Tfh細(xì)胞表達(dá)量比較

見表2。組別 Tfh細(xì)胞數(shù)/個(gè) Tfh細(xì)胞比例/%

表2 各組外周血中Tfh細(xì)胞表達(dá)量比較（±s，n= 5）

表2 各組外周血中Tfh細(xì)胞表達(dá)量比較（±s，n= 5）

注：與空白組比較，## P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01；與西藥組比較，▲P＜0.05

空白組 647.33±263.23 0.14±0.03模型組 2 773.00±350.66## 0.42±0.15西藥組 1 200.67±259.39##△△ 0.20±0.02低劑量組 1 981.00±307.36##△△▲ 0.32±0.13中劑量組 1 768.33±201.16##△△▲ 0.22±0.02高劑量組 1 242.00±146.50##△△ 0.19±0.05

2.3 各組血清中Tfh細(xì)胞通路各因子含量比較

見表3、表4。

表3 各組Tfh細(xì)胞通路中刺激因子IL-6、IL-21及轉(zhuǎn)錄因子Bcl-6、STAT3含量比較（±s，n= 5）

表3 各組Tfh細(xì)胞通路中刺激因子IL-6、IL-21及轉(zhuǎn)錄因子Bcl-6、STAT3含量比較（±s，n= 5）

注：與空白組比較，# P＜0.05，## P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與西藥組比較，▲P＜0.05

組別 IL-6/（pg·mL-1） IL-21/（pg·mL-1） Bcl-6/（ng·mL-1） STAT3/（ng·mL-1）空白組 97.33±8.75 268.08±15.56 22.58±3.59 105.26±5.85模型組 163.75±37.79## 367.77±36.80## 47.73±9.36## 188.68±19.21##西藥組 119.76±15.28#△△ 308.41±22.67##△△ 30.61±5.24#△△ 120.03±8.20##△△低劑量組 140.03±22.61##△▲ 340.05±25.52##△▲ 45.50±10.21##▲ 161.22±17.74##△▲中劑量組 131.18±16.56##△▲ 334.69±29.77##△▲ 39.29±6.63##△▲ 158.81±18.29##△▲高劑量組 122.31±10.20#△△ 315.50±30.38##△△ 28.34±5.60#△△ 117.73±10.10##△△

表4 各組Tfh細(xì)胞通路中分泌因子CXCR5、ICOS、PD-1、CD40L含量比較（±s，n= 5）

表4 各組Tfh細(xì)胞通路中分泌因子CXCR5、ICOS、PD-1、CD40L含量比較（±s，n= 5）

注：與空白組比較，# P＜0.05，## P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與西藥組比較，▲P＜0.05

組別 CXCR5/（pg·mL-1） ICOS/（ng·mL-1） PD-1/（pg·mL-1） CD40L/（ng·mL-1）空白組 4.46±1.61 5.58±0.25 14.20±2.14 7.80±0.50模型組 15.42±2.05## 9.59±0.43# 2.59±0.31## 13.02±2.76#西藥組 5.95±1.48△△ 6.42±0.39△ 10.05±1.38#△△ 8.52±0.77△△低劑量組 11.57±2.23##△▲ 8.85±0.57#▲ 5.61±2.22##△△▲ 8.59±0.51△△中劑量組 7.15±1.89#△△ 8.28±0.50#▲ 5.35±1.97##△△▲ 8.54±0.80△△高劑量組 5.60±0.90△△ 6.11±0.72△ 9.64±2.00#△△ 8.25±0.57△△

2.4 皮損指數(shù)變化量（△MPASI）與Tfh細(xì)胞及其主導(dǎo)通路的相關(guān)性分析

見表5、圖1-9。

表5 皮損指數(shù)變化量（△MPASI）與Tfh細(xì)胞及其主導(dǎo)通路的相關(guān)性分析（n= 5）

圖1 △MPASI與Tfh回歸曲線

圖2 △MPASI與IL-6回歸曲線

圖3 △MPASI與IL-21回歸曲線

圖4 △MPASI與Bcl-6回歸曲線

圖5 △MPASI與STAT3回歸曲線

圖6 △MPASI與CXCR5回歸曲線

圖7 △MPASI與ICOS回歸曲線

圖8 △MPASI與PD-1回歸曲線

圖9 △MPASI與CD40L回歸曲線

3 討論

基于對(duì)Tfh細(xì)胞復(fù)雜免疫學(xué)通路的認(rèn)識(shí)，課題組以體現(xiàn)“毒”“瘀”致病理論的中藥制劑蜈蚣敗毒飲為干預(yù)藥物，研究其針對(duì)于Tfh細(xì)胞及其主導(dǎo)通路的相關(guān)靶點(diǎn)，從中醫(yī)的毒邪致病到銀屑病皮損的瘀滯所成，有機(jī)的結(jié)合西醫(yī)學(xué)Tfh通路的細(xì)胞因子紊亂到紅斑鱗屑的病理狀態(tài)，將中西醫(yī)二者從病因、病機(jī)、臨床表現(xiàn)等方面進(jìn)行合理的整合。蜈蚣敗毒飲是課題組多年來(lái)致力于銀屑病治療研究的經(jīng)驗(yàn)方劑，其由蜈蚣、烏梢蛇、紫草、土茯苓、鬼箭羽、甘草組成，以蜈蚣、烏梢蛇為君，紫草、土茯苓、鬼箭羽為臣，甘草為佐使，在發(fā)揮蟲類藥物以毒攻毒、熄風(fēng)散毒、走竄通路的“解毒”“化瘀”作用的同時(shí)，與臣藥相互配合，發(fā)揮清熱毒、除濕毒、化瘀毒的“祛毒”作用，以及活血瘀、除痹瘀、逐滯瘀的“祛瘀”功效，加之甘草的解百毒、和諸藥之品，六藥配伍，充分體現(xiàn)出中醫(yī)學(xué)“毒”“瘀”理論在銀屑病辨治中的特色和獨(dú)到之處。

本次研究結(jié)果可以看出，在作用療效方面，蜈蚣敗毒飲各劑量組均能夠降低銀屑病模型鼠的皮損指數(shù)，其程度依次為高劑量組＞中劑量組＞低劑量組，且高劑量組的作用療效與甲氨蝶呤相似。在影響Tfh細(xì)胞方面，建模后的銀屑病小鼠表現(xiàn)出外周血中Tfh細(xì)胞數(shù)的顯著升高，模型組Tfh細(xì)胞比例為空白組均數(shù)的3倍左右，藥物干預(yù)后的外周血中Tfh細(xì)胞數(shù)均有不同程度的降低，干預(yù)程度依次為西藥組≈高劑量組＞中劑量組＞低劑量組。在對(duì)Tfh細(xì)胞通路的檢測(cè)方面，銀屑病小鼠的Tfh細(xì)胞通路因子均呈現(xiàn)出異常表達(dá)，以刺激、轉(zhuǎn)錄因子高表達(dá)，CXCR5、ICOS、CD40L的分泌因子高表達(dá)，及PD-1的分泌因子低表達(dá)為主要變化趨勢(shì)。在經(jīng)藥物的干預(yù)后，高劑量組和西藥組均能夠顯著影響Tfh細(xì)胞通路的各關(guān)鍵因子，調(diào)控其恢復(fù)平衡狀態(tài)，尤其對(duì)于CD40L的干預(yù)作用，不同濃度的蜈蚣敗毒飲均表現(xiàn)出相似的調(diào)控功效，體現(xiàn)出藥物干預(yù)的敏感性，對(duì)PD-1的干預(yù)呈現(xiàn)出上調(diào)趨勢(shì)，這與文獻(xiàn)[6]所述的PD-1具有反向抑制T細(xì)胞活化和增殖作用，PD-1的不足是銀屑病發(fā)病的內(nèi)在重要因素的闡述相互吻合。在相關(guān)性的研究方面，經(jīng)過整體分析小鼠皮損指數(shù)的變化與藥物干預(yù)后Tfh細(xì)胞及其通路中各因子表達(dá)量的相關(guān)程度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，皮損的緩解與Tfh細(xì)胞及其通路因子間均具有較為密切的關(guān)系，除與PD-1呈正相關(guān)外（皮損緩解程度越大，PD-1越高表達(dá)），△MPASI與Tfh、IL-6、IL-21、Bcl-6、STAT3、CXCR5、ICOS、CD40L均呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)（皮損緩解程度越大，各細(xì)胞或因子越低表達(dá)），相關(guān)性的研究也是對(duì)本實(shí)驗(yàn)中皮損、通路研究?jī)?nèi)容的有機(jī)整合。

本研究初步對(duì)蜈蚣敗毒飲干預(yù)下的Tfh細(xì)胞主導(dǎo)通路的靶點(diǎn)進(jìn)行了探索，在深化中醫(yī)學(xué)“毒”“瘀”理論辨治銀屑病的同時(shí)，也為后續(xù)針對(duì)于T淋巴細(xì)胞機(jī)制網(wǎng)絡(luò)的系統(tǒng)研究奠定了基礎(chǔ)，將中醫(yī)經(jīng)典理論與西醫(yī)微觀機(jī)制相互融合，對(duì)中西醫(yī)結(jié)合方法在銀屑病臨證中的科學(xué)應(yīng)用具有重要的促進(jìn)和推動(dòng)作用。