劉 玉，劉 影，伍志發(fā)，鹿靜雅

中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院影像科，合肥 230001

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)是干細(xì)胞家族成員之一，不僅具有分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞的潛能，還可通過攜帶并表達(dá)外源治療基因來促進(jìn)受損神經(jīng)功能的恢復(fù)，為腦梗死的治療提供了一種新方法[1-2]。此外，BMSCs能夠修復(fù)血管損傷，防止組織缺血，且能夠分泌血管內(nèi)皮生長因子，誘導(dǎo)缺血組織的血管再生和功能恢復(fù)[3-4]。許多動物實(shí)驗[5-6]和臨床研究[7]表明干細(xì)胞移植可促進(jìn)腦缺血時神經(jīng)功能的恢復(fù)。相關(guān)實(shí)驗表明，其治療效果可能與BMSCs的分泌功能有關(guān)，BMSCs會分泌不同類型的營養(yǎng)因子，導(dǎo)致神經(jīng)發(fā)生和血管生成。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)是重要的神經(jīng)元保護(hù)因子和維持海馬功能不可或缺的多肽物質(zhì)，具有較強(qiáng)的刺激和促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞生長分化的作用，同時參與突觸間神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞和突觸重建。BDNF在腦缺血的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，對腦卒中后活動能力改善具有重要意義[8-11]。酪氨酸酶基因(tyrosinase，TYR)作為MR報告基因已引起眾多學(xué)者的關(guān)注，它是以內(nèi)源性Fe3+為成像基礎(chǔ)，成像過程中避免了外源性示蹤劑會隨著細(xì)胞的分裂分化信號逐漸丟失的缺點(diǎn)，也不需要分子探針作用于底物，因此是一種較為理想的MR成像基因。

BMSCs可以分泌內(nèi)皮生長因子和BDNF，但分泌水平低。我們希望開發(fā)一種基于慢病毒載體技術(shù)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞BDNF過度表達(dá)和分泌系統(tǒng)，提高BMSCs的治療效果，促進(jìn)功能恢復(fù)。本實(shí)驗構(gòu)建攜帶報告基因TYR及治療基因BDNF的重組慢病毒載體，且載體中含有熒光素酶(luciferase)報告基因。體外轉(zhuǎn)染BMSCs，構(gòu)建過表達(dá)TYR和BDNF的細(xì)胞株。建立大鼠中動脈梗塞模型，利用載體中含有的熒光蛋白進(jìn)行光學(xué)顯像，示蹤干細(xì)胞腦內(nèi)分布情況，為下一步以TYR為報告基因的MR分子成像及評價細(xì)胞與基因雙重治療腦梗死的療效奠定實(shí)驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗動物和細(xì)胞株 7～8周齡SD大鼠24只，購自南京大學(xué)模式研究所，于SPF級動物房內(nèi)飼養(yǎng)。BMSCs細(xì)胞株購自北納生物公司。

1.1.2 主要試劑與儀器 質(zhì)粒DNA提取試劑盒、T4 DNA連接酶、DNA凝膠回收試劑盒(TaKaRa，日本)，EcoRⅠ和BamHⅠ限制性內(nèi)切酶、MluⅠ和BsiWI限制性內(nèi)切酶(Fermantas，中國)，E.coliDH5a感受態(tài)細(xì)胞、293T細(xì)胞、含綠色熒光蛋白的慢病毒載體H7656由和元生物公司提供。ELISA試劑盒(Biosciences，中國)，TTC(T8877，Sigma，美國)。凝膠成像分析儀(培清科技)，PCR儀(Applied Biosystems，美國)，Western blot及IP細(xì)胞裂解液(碧云天)，Pierce BCA Protein Assay Kit(ThermoFisher，美國)，熒光顯微鏡(DMI8，LEICA，中國)，激光多普勒血流儀(Moor，美國)，光學(xué)活體成像儀(IVIS Lumina Ⅱ，美國)。

1.2 重組慢病毒載體構(gòu)建與鑒定

在GenBank中查詢目的基因以及上下游的序列，用VectorNTI軟件進(jìn)行引物設(shè)計。設(shè)計包含酶切位點(diǎn)的TYR和BDNF擴(kuò)增引物。PCR擴(kuò)增獲取目的基因。慢病毒載體H7656(PLENTI-CBH-3XFLAG-LUC2-TCMV-MNEONGREEN-F2A-PURO-WPRE)中包含熒光素酶報告基因luc2和綠色熒光蛋白基因mNeonGreen。利用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和BamHⅠ，MluⅠ和BsiWⅠ將PCR產(chǎn)物和慢病毒載體H7656進(jìn)行雙酶切，PCR酶切產(chǎn)物回收備用，通過凝膠回收法回收大片段載體，用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆，提取質(zhì)粒，測序鑒定。

1.3 慢病毒的包裝及病毒滴度測定

取對數(shù)生長期的293T細(xì)胞，接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，細(xì)胞密度達(dá)60%～70%時，將重組慢病毒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后離心5 min收集含病毒顆粒的上清液，標(biāo)定滴度。在倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.4 慢病毒載體感染BMSCs

BMSCs細(xì)胞培養(yǎng)液為RPMI-1640+10%FBS，在37℃，5%CO2中培養(yǎng)。將BMSCs細(xì)胞接種到24孔板，配成6×104個/mL的細(xì)胞懸液，鋪板，12～20 h后感染病毒。每孔加2.5 μL 1 mg/mL polybrene，病毒載體H7656以感染復(fù)數(shù)MOI=10、20、40、80、100體外轉(zhuǎn)染BMSCs，感染72 h后熒光顯微鏡下觀察綠色熒光表達(dá)以判斷轉(zhuǎn)染是否成功，選取最佳MOI。

1.5 RT-PCR檢測TYR及BDNF mRNA的表達(dá)

RT-PCR檢測重組慢病毒H16189感染BMSCs后目的基因的表達(dá)，GAPDH為內(nèi)參基因。引物序列見表1。采用RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增cDNA，PCR檢測細(xì)胞中TYR和BDNF的表達(dá)情況。對照組為空細(xì)胞和H7656質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的BMSCs。通過對樣本Ct值的測算，用相對定量法檢測目的基因mRNA的表達(dá)水平。

1.6 Western blot檢測TYR蛋白表達(dá)

細(xì)胞加入預(yù)冷的PBS及IP細(xì)胞裂解液，冰上裂解細(xì)胞30 min，轉(zhuǎn)移至含裂解細(xì)胞的離心管，置于預(yù)冷的高速離心機(jī)，4℃，12000 r/min離心5～10 min，提取細(xì)胞總蛋白，測定蛋白濃度。蛋白樣品水浴變性后，10%聚丙烯酰胺凝膠電泳。蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，加入一抗，4℃孵育過夜，洗膜3次，加入二抗，室溫孵育1～2 h，用TBST在室溫下脫色搖床上洗3次，每次10 min，進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)。將發(fā)光液滴加在膜上，充分覆蓋膜表面，然后放入成像儀中拍照。

1.7 ELISA法檢測BDNF蛋白的表達(dá)

按照ELISA試劑盒操作說明，將抗原用包被稀釋液稀釋到適當(dāng)濃度，每孔抗原加入100 μL；棄去孔中液體。5%小牛血清置37℃封閉40 min。封閉結(jié)束后。將稀釋好的樣品加入酶標(biāo)反應(yīng)孔中。每孔加入酶標(biāo)試劑50 μL，溫育并洗滌。每孔先加入顯色劑A 50 μL，再加入顯色劑B 50 μL，輕輕振蕩混勻，37℃避光顯色15 min。每孔加入終止液終止反應(yīng)。以空白孔調(diào)零，450 nm波長依序測量各孔的吸光度(A)值。

1.8 制備大鼠大腦中動脈梗塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型

SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后進(jìn)行手術(shù)，手術(shù)過程中大鼠注射5%異氟醚后補(bǔ)注1%～1.5%異氟醚進(jìn)行麻醉，術(shù)中直腸溫度維持在(37.0±0.5)℃；將單纖維絲插入左側(cè)頸內(nèi)動脈并經(jīng)頸總動脈引起局灶性腦缺血，并用激光多普勒血流儀監(jiān)測MCA區(qū)腦血流；缺血處理60 min后，去除單纖維絲，縫合皮膚切口。MCAO為模型組，Sham組為假手術(shù)組。

1.9 腦組織TTC染色

在腦缺血手術(shù)完成72 h后處死大鼠，取新鮮腦組織，切成1 mm左右冠狀面切片。使用2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)染色，在活組織中，TTC在脫氫酶的作用下還原為紅色的甲氧嘧啶產(chǎn)物，而蒼白的區(qū)域則對應(yīng)于梗死區(qū)域。

1.10 神經(jīng)功能學(xué)評分

神經(jīng)功能缺損采用48分制評分。該評分系統(tǒng)由一般狀態(tài)(自發(fā)活動、身體對稱性、步態(tài)；0～12分)、簡單運(yùn)動缺陷(前肢不對稱、旋轉(zhuǎn)、后肢放置；0～14分)、復(fù)雜運(yùn)動障礙(垂直爬屏、游梁；0～8分)和感覺缺陷(后肢、軀干、振動和面部觸摸；0～14分)組成。總分為4個單項得分之和，0分代表無缺陷，48分代表最大缺陷。

1.11 紋狀體細(xì)胞注射

將成年雄性大鼠24只隨機(jī)分為4組，假手術(shù)組(Sham組)8只，模型組(組)16只，兩組中大鼠再平均分為BMSCs-H7656組和BMSCs-H16189組。大鼠接受5%異氟醚注射和1%～1.5%異氟醚補(bǔ)充。用5 μL漢密爾頓注射器將含200萬個細(xì)胞的5 μL生理鹽水注射到內(nèi)側(cè)紋狀體，持續(xù)10 min，然后取出注射器，縫合大鼠。Sham組注射右側(cè)，MCAO組注射左側(cè)。

1.12 小動物成像觀察BMSCs腦內(nèi)分布

MCAO組及Sham組分別注射H16189-BMSCs及H7656-BMSCs入紋狀體，在72 h內(nèi)收集腦組織，用PE IVIS Lumina系統(tǒng)檢測干細(xì)胞分布和干細(xì)胞熒光強(qiáng)度。在BMSC-H16189組損傷區(qū)域及未損傷區(qū)域半球的紋狀體上切取20 μm腦片，采用熒光顯微鏡觀察，并拍照。

1.13 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 5.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組內(nèi)比較采用總體均數(shù)的假設(shè)檢驗(t-test)，多組間比較采用Anova方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 慢病毒載體構(gòu)建及鑒定

H7656質(zhì)粒(PLENTI-CBH-3XFLAG-LUC2-TCMV-MNEONGREEN-F2A-PURO-WPRE)、H16188質(zhì)粒(PLENTI-CBH-TYR-3XFLAG-P2A-LUC2-TCMV-MNEONGRE-F2A-PURO-WPRE)及H16189質(zhì)粒(PLENTI-CBH-TYR-3XFLAG-P2A-LUC2-TCMV-BDNF-6XHIS-F2A-PURO-WPRE)圖譜如圖1所示。引物序列見表1。

圖1 H7656、H16188及H16189載體圖譜Fig.1 The vector maps of H7656，H16188 and H16189

表1 目的基因引物序列Table 1 The primer sequences of target genes

2.2 重組慢病毒的包裝及病毒滴度測定

將慢病毒表達(dá)質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，24 h后在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光表達(dá)(圖2)，說明重組病毒包裝成功。重組慢病毒載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，測定慢病毒滴度約為2.6×108TU/mL。

A：熒光視野；B：白光視野圖2 慢病毒載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞24 h后熒光表達(dá)(×200)Fig.2 The fluorescence expression of 293T cells was observed 24 h after transfection with lentiviral vector(×200)

2.3 病毒載體MOI篩選

BMSCs細(xì)胞感染慢病毒H7656 72 h后，MOI為10時感染效率未達(dá)到80%，MOI為20、40、80、100時感染效率均達(dá)到80%(圖3)。以感染效率高、MOI值低、對細(xì)胞毒性低為前提，實(shí)驗結(jié)果提示最佳感染條件是MOI為20。

圖3 不同MOI值慢病毒載體轉(zhuǎn)染BMSCs(×100)Fig.3 BMSCs were transfected by lentiviral vectors with different MOI(×100)

2.4 重組慢病毒中TYR和BDNF mRNA及蛋白表達(dá)

慢病毒感染BMSCs后，以GAPDH為內(nèi)參，BMSC-H16189組、BMSCs-H7656組及BMSCs組的TYR基因相對表達(dá)值分別為(134483.40±3904.50)、(1.03±0.29)、(0.37±0.23)，BDNF的基因相對表達(dá)(756.60±8.02)、(1.00±0.03)、(1.41±0.05)，顯示BMSC-H16189組TYR和BDNF mRNA表達(dá)量明顯高于BMSCs-H7656組及BMSCs組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。

以GAPDH為內(nèi)參，Western blot檢測細(xì)胞中TYR-3XFLAG-P2A蛋白質(zhì)表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在70～100 kD之間檢測到蛋白條帶，預(yù)測蛋白大小約為66 kD(圖4)。Western blot未檢測到BDNF蛋白的表達(dá)，利用ELISA實(shí)驗檢測到BDNF蛋白表達(dá)(表2)。

1：Marker；2：BMSCs；3：BMSCs-H7656；4：BMSCs-H16189圖4 Western blot檢測TYR蛋白的表達(dá)結(jié)果Fig.4 The expression level of TYR protein detected by Western blotting

表2 ELISA檢測BDNF表達(dá)Table 2 The expression level of BDNF protein detected by ELISA

2.5 SD大鼠腦梗死模型的建立

SD大鼠MCAO模型構(gòu)建成功，激光多普勒檢測大腦中動脈區(qū)腦血流改變?nèi)鐖D5A。72 h后，取新鮮腦組織TTC染色，如圖5B所示，MCAO組右側(cè)梗死區(qū)為蒼白色，正常區(qū)域為紅色。兩組大鼠神經(jīng)功能評分如圖5C所示。Sham組神經(jīng)功能無缺陷，MCAO組神經(jīng)功能評分19～22分。

A：激光多普勒血流儀監(jiān)測MCAO區(qū)腦血流；B：TTC染色顯示MCAO組右側(cè)梗死區(qū)為蒼白色，正常區(qū)域為紅色；C：MCAO模型神經(jīng)功能學(xué)評分圖5 大鼠腦梗死模型的建立Fig.5 Establishment of cerebral infarction model in rats

2.6 熒光成像

紋狀體注射后，用PE IVIS Lumina系統(tǒng)檢測顯示，Sham組注射BMSC-H16189和BMSC-H7656后，BMSCs可擴(kuò)散到對側(cè)，但MCAO組注射BMSC-H16189、BMSC-H7656后主要集中在損傷一側(cè)(圖6)，說明干細(xì)胞具有梗死區(qū)聚集現(xiàn)象，后續(xù)的腦切片紋狀體熒光觀察也證明了這一點(diǎn)。MCAO組BMSC-H16189腦片結(jié)果顯示：3 d后腦損傷紋狀體區(qū)域有大量綠色熒光標(biāo)記的干細(xì)胞(圖7)。

圖像分別來源于4只BMSC-H7656大鼠和4只BMSC-H16189大鼠圖6 熒光成像觀察干細(xì)胞腦內(nèi)分布Fig.6 Fluorescent imaging was used to observe the distribution of stem cells in the brain

圖7 MCAO組BMSC-H16189的腦切片熒光標(biāo)記結(jié)果(×200)Fig.7 Brain section fluorescence results of MBSC-H16189 in MCAO group(×200)

3 討論

腦梗死是臨床上最常見的心腦血管疾病，發(fā)病率和死亡率高。目前，急性腦梗死最有效的治療方法是在代謝半暗帶恢復(fù)血流，靜脈注射組織纖溶酶源激活劑。然而，其狹窄的治療時間窗使得治療對較少患者有效?；诩?xì)胞的治療被認(rèn)為是急性缺血性卒中的潛在治療方法[12]。腦梗死可導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙，影響生活質(zhì)量，因此在腦梗死早期提供一種強(qiáng)有力的促進(jìn)血管生成的治療方法非常必要，血管生成可以改善腦梗死區(qū)域的血流灌注，促進(jìn)中樞神經(jīng)再生。BMSCs能夠在許多非造血組織中自我更新，并且具有分化為多種組織的多能性。BMSCs能分泌許多生長因子和細(xì)胞因子，可以促進(jìn)各種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的功能恢復(fù)[12]。越來越多研究表明，干細(xì)胞療法有望修復(fù)各種原因引起的腦損傷[13-14]。BDNF是主要的神經(jīng)營養(yǎng)因子，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)起著極其重要的作用[15]。采用活體示蹤技術(shù)是干細(xì)胞移植治療從基礎(chǔ)走向臨床需要解決的問題，報告基因只有在活細(xì)胞中表達(dá)后才能在影像上表現(xiàn)出來，故可以反映移植干細(xì)胞的運(yùn)動、存活能力及功能等。我們希望通過基因重組技術(shù)，將細(xì)胞治療和基因治療相結(jié)合，將BDNF輸送到腦梗死部位，使BDNF長期穩(wěn)定表達(dá)和分泌，增強(qiáng)BMSCs治療效果的同時，采用無創(chuàng)性成像技術(shù)在體內(nèi)對干細(xì)胞進(jìn)行實(shí)時檢測。

慢病毒載體是一種高效、低毒且穩(wěn)定的病毒載體系統(tǒng)，是目前基因治療最有效的載體之一。本研究成功構(gòu)建攜帶TYR和BDNF的重組慢病毒載體，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞進(jìn)行慢病毒包裝，以最佳MOI為20的病毒顆粒轉(zhuǎn)染BMSCs，可見細(xì)胞呈熒光陽性，RT-PCR和Western blot、ELISA檢測結(jié)果表明，TYR和BDNF基因成功轉(zhuǎn)染至BMSCs中，并可穩(wěn)定表達(dá)TYR和BDNF蛋白。Western blot中沒有檢測到BDNF，采用ELISA能檢測到蛋白的表達(dá)，分析可能的原因是BDNF為分泌蛋白，蛋白已分泌到細(xì)胞外，細(xì)胞內(nèi)蛋白量少，運(yùn)用Western blot法難以檢測到。我們構(gòu)建的慢病毒載體H16189，帶有熒光素酶報告基因，為后續(xù)熒光成像奠定了實(shí)驗基礎(chǔ)。

大鼠腦MCAO可以通過顱內(nèi)、動脈內(nèi)和靜脈內(nèi)途徑進(jìn)行BMSCs移植治療。靜脈或動脈內(nèi)注射途徑在侵襲和安全性方面似乎優(yōu)于顱內(nèi)，但缺血區(qū)的細(xì)胞密度低，循環(huán)損失的體積大，注射所需的細(xì)胞量也較大。此外，靜脈或動脈內(nèi)注射的途徑可能會因毛細(xì)血管微血管血栓形成而增加實(shí)驗大鼠的死亡率[12]。因此，為了減少體內(nèi)干細(xì)胞數(shù)量的循環(huán)損傷，我們采用了立體定向輔助注射到大腦的代謝半暗帶，注射產(chǎn)生效果所需時間更短，需要的細(xì)胞數(shù)量更少。我們構(gòu)建大鼠MCAO模型，腦組織TTC染色顯示模型組大鼠大腦右側(cè)可見白色梗死組織，且模型組神經(jīng)功能缺損評分明顯高于假手術(shù)組，表明模型構(gòu)建成功。將攜帶目的基因的BMSCs原位移植，注入大腦紋狀體內(nèi)，通過PE IVIS Lumina系統(tǒng)檢測顯示Sham組注射BMSCs后，是可以擴(kuò)散到對側(cè)的，這一結(jié)果表明移植的BMSCs具有遷移能力；但MCAO組注射后干細(xì)胞主要集中在損傷一側(cè)，說明移植的干細(xì)胞具有梗死區(qū)聚集現(xiàn)象，且可以在缺血區(qū)存活。

綜上所述，我們的重組質(zhì)粒同時具有熒光素酶和TYR兩種報告基因，可以進(jìn)行光學(xué)及MRI成像，在該研究中我們利用載體中含有的熒光蛋白進(jìn)行光學(xué)顯像，成功示蹤BMSCs在腦內(nèi)分布情況，同時表明BMSCs可以將重組質(zhì)粒運(yùn)輸?shù)饺毖Ｋ绤^(qū)。熒光成像敏感度高，但分辨率低，MRI敏感度和分辨率都較高，我們下一步將進(jìn)行MRI顯像，對干細(xì)胞在梗死治療效果方面進(jìn)行可視化研究。利用TYR基因產(chǎn)生黑色素在MRI T1WI中呈高信號，動態(tài)觀察干細(xì)胞的分布及存活情況，并評價治療效果。