劉 瑤，潘亞慕，付 堅△，金 瑩△

十堰市人民醫(yī)院 1神經疾病中心 2心血管內科臨床研究所，十堰 442000

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是冠心病及卒中等心腦血管事件發(fā)生的重要病理基礎，它是由內皮功能障礙和內皮下脂蛋白積聚相互作用引起的一種慢性適應不良，且不可逆轉的炎癥性疾病[1]。NLRP3炎癥小體參與機體多種危險因素驅動的血管炎癥反應，對動脈粥樣硬化的發(fā)生及發(fā)展極其重要。本文主要概括了脂質及體細胞TET2突變等危險因素介導NLRP3炎癥小體的激活作用及機制，并簡述NLRP3炎癥小體靶向治療的現(xiàn)狀，為探討冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(冠心病，coronary heart disease，CHD)及卒中等疾病的治療提供新思路。

1 NLRP3炎癥小體及其激活過程

NLRP3炎癥小體主要由受體蛋白NLRP3、接頭蛋白ASC和效應蛋白pro-Caspase-1構成[2]。NEK7作為NLRP3炎癥小體的新成員，可直接結合NLRP3并調控其蛋白復合物的多聚化和激活[3]。機體損傷相關分子模式(damage-associated molecular patterns，DAMPs)或病原相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)促進NLRP3炎癥小體的組裝與活化。首先，啟動信號(priming signal)刺激NF-κB信號通路誘導IκB磷酸化[4]，促進NLRP3和IL-1β等前體蛋白轉錄上調[5]；其次，NLRP3炎癥小體響應激活信號(activation signal)招募并組裝ASC和pro-Caspase-1并促使后者酶解為Caspase-1，活化的Caspase-1加工修飾IL-1β及IL-18等促炎因子并切割Gasdermin-D(GSDMD)[6]，GSDMD-N端與細胞膜結合形成孔隙促進炎性因子釋放[7-8]，誘發(fā)細胞焦亡等一系列生物學效應[9]，具體激活途徑見圖1。此外，Caspase-8或Caspase-9依賴性細胞凋亡通路中，糖蛋白Pannexin-1亦可促進NLRP3炎癥小體活化，從而介導細胞死亡[10]。NLRP3炎癥小體異常激活造成宿主損傷，與炎癥性疾病、自身免疫性疾病、代謝性疾病及腫瘤等疾病的發(fā)生和發(fā)展有密切關系。

2 NLRP3炎癥小體活化的影響因素

有關NLRP3炎癥小體的激活機制尚未完全闡明，其活化的影響因素可以概括為以下幾種。①泛素化狀態(tài)：NLRP3被K48和K63泛素鏈多聚泛素化來維持其失活狀態(tài)。泛素特異性肽酶1-分配因子1(ubiquitin specific peptidase 1-associated factor 1，UAF1)通過靶向NLRP3和p65(NF-κB)增強NLRP3和pro-IL-1β的表達[11]。ABRO1募集BRCC3(Lys63-特異性去泛素化酶)并去除K63連接的NLRP3泛素化[12]，促進NLRP3炎癥小體的組裝和激活[13]。也有研究提示NLRP3泛素化促進NLRP3炎癥小體活化。調控NLRP3泛素化被認為是NLRP3炎癥小體激活的關鍵步驟[14]。②細胞器功能：線粒體穩(wěn)態(tài)失衡導致NAD(+)依賴性的α-微管蛋白脫乙酰酶失活，乙酰化的α-微管蛋白介導線粒體動力蛋白依賴性運輸，促進線粒體ASC與內質網(wǎng)NLRP3結合及組裝[15]。動力蛋白適配器組蛋白脫乙?；?(the dynein adapter histone deacetylase 6，HADC6)介導炎癥小體的微管組織中心(the microtubule-organizing center，MTOC)定位和活化[16]，MTOC充當樞紐促進自噬體和溶酶體融合。溶酶體釋放組織蛋白酶誘導氧化應激，導致大量活性氧(ROS)產生及硫氧還蛋白相互作用蛋白/硫氧還蛋白-1(TXNIP/TRX-1)分離，在內質網(wǎng)(ER)水平與NLRP3相互作用，促進NLRP3炎癥小體激活及促炎因子IL-1β釋放[17]。此外，機體接受刺激誘導反式高爾基體網(wǎng)絡分解為分散的反式高爾基體網(wǎng)絡(dTGN)，后者充當炎癥體復合物聚集的支架促使NLRP3炎癥小體組裝和激活[18]。③離子通道開放：ATP結合嘌呤能受體(P2X7R)激活誘導鉀外流、鈣內流，導致胞內鈣離子持續(xù)增加[19]；TWIK2亦作為巨噬細胞中鉀流出通道[20]，導致鉀外流、線粒體損傷和ROS產生，氯化物細胞通道(CLICs)作用于鉀外排-線粒體ROS軸的下游[21]，促進NEK7-NLRP3相互作用和炎癥小體信號轉導[22]。最新研究顯示[23]，特征性神經損傷誘導蛋白-1(nerve injury-induced protein 1，NINJ1)介導質膜破裂和損傷相關分子模式釋放，啟動并擴大炎癥反應，參與細胞焦亡、凋亡和壞死等過程。以上激活及調控機制僅在部分途徑實現(xiàn)，具有一定局限性，其關鍵激活機制仍有待進一步研究。

3 NLRP3炎癥小體在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中的作用

NLRP3炎癥小體是脂質驅動血管炎癥反應的關鍵因素，在動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展中起著根本性的作用[24]。研究顯示，NLRP3炎癥小體在人頸動脈粥樣硬化斑塊中表達增加，特別是在不穩(wěn)定斑塊中，導致動脈粥樣硬化形成和斑塊易損性增加[25]。糖尿病性動脈粥樣硬化小鼠模型中，NLRP3敲低可抑制NLRP3炎癥小體激活及內膜中粘附分子ICAM-1和VCAM-1的表達，減少動脈粥樣硬化并穩(wěn)定動脈粥樣硬化斑塊[26]。NLRP3炎癥小體主要表達于斑塊內的泡沫細胞中，可誘導IL-1β及IL-18在炎癥區(qū)域迅速聚集，協(xié)同增加其生物學效應，參與血管內皮損傷及動脈粥樣硬化形成[27]?？傊?，NLRP3炎癥小體參與動脈粥樣硬化斑塊的形成，與斑塊不穩(wěn)定性密切相關，是冠狀動脈粥樣硬化嚴重程度的預測因子。

4 脂質與NLRP3炎癥小體

NLRP3炎癥小體將脂質及脂蛋白的動脈沉積與介導動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的炎癥反應聯(lián)系在一起[28]。單核細胞在內皮下分化而成的巨噬細胞吞噬氧化修飾低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，oxLDL)并激活NLRP3炎癥小體，導致泡沫細胞形成及膽固醇結晶體積累，NLRP3炎癥小體在動脈粥樣硬化病變早期即發(fā)揮重要作用[29]。oxLDL誘導非選擇性陽離子通道P2X7R表達上調并增強蛋白激酶R(PKR)磷酸化，協(xié)助組裝并激活NLRP3炎癥小體，從而刺激巨噬細胞產生并釋放炎癥因子IL-1β[30]。oxLDL與脂肪轉位酶CD36結合介導微血管內皮細胞的炎癥反應，影響ROS生成、鉀流出和組織蛋白酶B活性，促進NLRP3炎癥小體激活和炎癥因子的成熟分泌，參與泡沫細胞形成和動脈粥樣硬化發(fā)展[31]。oxLDL在NLRP3炎癥小體啟動和激活過程中具有雙重作用，成為動脈粥樣硬化發(fā)展的主要驅動力。

動脈粥樣硬化發(fā)展的最初病理改變是內皮損傷，膽固醇通過低密度脂蛋白(LDL)顆粒沉積于動脈壁內膜，膽固醇晶體可上調斑塊中NLRP3炎癥小體成分的表達[27]。正常生理狀態(tài)下，巨噬細胞通過新生高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)促進膽固醇逆向轉運并進入腸肝循環(huán)，HDL可溶解部分膽固醇晶體并抑制巨噬細胞中膽固醇誘導的NLRP3炎癥小體活化及促炎因子IL-1β分泌[32]。持續(xù)性炎癥反應會導致HDL功能障礙，尤其是膽固醇外排能力降低，這將進一步加劇膽固醇結晶形成和細胞死亡。超負荷的膽固醇晶體在巨噬細胞攝取及降解過程中會造成溶酶體損傷及自噬功能障礙，促進NLRP3炎癥小體激活及促炎因子IL-1β的產生和分泌[33]。膽固醇晶體通過刺激中性粒細胞外陷阱(NETs)形成，進一步觸發(fā)病變斑塊區(qū)域內巨噬細胞中NLRP3炎癥小體激活[34]。此外，膽固醇晶體還通過調控氧化應激轉錄因子Nrf2相關機制介導NLRP3炎癥小體的激活[35]。膽固醇結晶除具有機械和毒性作用，還通過引發(fā)炎癥反應來誘導動脈壁損傷，誘導細胞死亡并造成纖維帽穿孔，出現(xiàn)斑塊破裂、出血及血栓形成等一系列變化[28]。總體來講，脂質與NLRP3相互作用誘導不可逆轉的炎癥反應是動脈粥樣硬化病變的基礎。

5 TET2突變與NLRP3炎癥小體

老化相關的體細胞突變體在高齡人群中普遍存在，并且體細胞突變介導的克隆性造血參與動脈粥樣硬化性疾病的發(fā)生和發(fā)展[36]。正常衰老與造血系統(tǒng)中體細胞突變積累相關，體細胞突變賦予其一定的競爭生長優(yōu)勢進行異常自我更新和髓系擴張，即克隆性造血[37]。不確定潛質的克隆性造血(CHIP)在老年人群中最為常見(65歲以上人群中>10%)，又被稱為與年齡相關的克隆造血(ARCH)，涉及已識別的癌癥驅動基因TET2和DNMT3A的突變[38]。TET2突變誘導的CHIP是新的心血管疾病危險因素[39]，這與部分攜帶TET2突變的炎癥性巨噬細胞有關，TET2在動脈粥樣硬化進程中發(fā)揮重要作用[40]。

在TET2-/-小鼠的骨髓巨噬細胞中，oxLDL和內毒素導致溶酶體功能障礙并促使CXC家族趨化因子分泌增加，增強單核細胞和其他血細胞向炎癥反應區(qū)域募集。oxLDL作用于內皮細胞抑制TET2蛋白表達，協(xié)同增加NF-κB/NLRP3活化，促進Caspase-1和IL-1β成熟及分泌，參與動脈粥樣斑塊的形成[41](圖1)。研究顯示，造血系統(tǒng)或髓樣TET2缺乏導致心臟重塑和功能惡化，并伴有促炎因子IL-1β表達增加，選擇性NLRP3炎癥小體抑制劑治療可預防心力衰竭的發(fā)展[42]。體細胞突變所致CHIP與冠心病或早發(fā)性心肌梗死的風險增加有明顯相關性[43]。TET2通過招募HDAC2調控IL-6基因啟動子從而抑制炎癥持續(xù)發(fā)展，在炎癥后期反饋抑制IL-6的分泌[44]。TET2通過抑制JAK/STAT信號通路的負調控因子mRNA合成，促進髓系細胞的生成及免疫細胞增殖，從而使機體針對病原微生物的入侵及時進行免疫反應[45]。CHIP惡化小鼠動脈粥樣硬化，增加IL-6及IL-1β的表達[46]。Kaasinen等[47]則認為，在老年人體內出現(xiàn)TET2突變克隆反映出對衰老的抵抗力增強，TET2與NLRP3炎癥小體的典型或非典型激活劑有關。TET2突變介導的CHIP通過NLRP3/IL-1β炎癥通路途徑，影響動脈粥樣硬化進展[48]。為模擬TET2介導的克隆性造血作用，利用混合骨髓嵌合體策略來改造小鼠，斑塊中招募少量的TET2突變細胞足以激活NF-κB/NLRP3炎癥小體途徑來驅動血管炎癥，而NLRP3抑制劑(MCC950)可顯著改善ApoE-/-小鼠體內由TET2體細胞突變介導的動脈粥樣硬化[49]?？傊?，NLRP3炎癥小體在TET2突變驅動的動脈粥樣硬化中的重要作用，同時上調TET2表達亦是治療動脈粥樣硬化的新策略。

6 NLRP3炎癥小體作為動脈粥樣硬化治療的新靶點

血漿膽固醇水平升高，尤其是低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)被認為是動脈粥樣硬化的首要危險因素。因此，以降低LDL為目標的他汀類藥物是目前治療AS的主要舉措。雖然他汀類藥物可通過干預NLRP3蛋白的表達從而減少炎癥因子的釋放并減輕動脈粥樣硬化病變，但是血液膽固醇水平下降的大部分人群中動脈粥樣硬化病變仍有很大程度發(fā)展。因此，單純依靠降脂治療不能夠降低所有患者未來發(fā)生心血管事件的風險。2-羥丙基-β-環(huán)糊精(CD)作為膽固醇晶體溶解劑，不僅可以減少動脈粥樣硬化病變并減輕膽固醇負荷，而且能夠誘導膽固醇外排并促進動脈斑塊溶解及消退[50]。膽固醇晶體消融療法適用于預防或臨床治療人類動脈粥樣硬化，有望提供一種替代方法來穩(wěn)定易損斑塊。

CANTOS實驗表明[51]，康納單抗(Canakinumab，靶向IL-1β的治療性單克隆抗體)在不影響血脂水平的前提下，可減少促炎因子產生及釋放并降低心血管疾病的風險。在動脈粥樣硬化方面，NLRP3炎癥小體顯示出關鍵作用及治療潛能?，F(xiàn)階段，針對NLRP3炎癥小體正進行各種基礎研究和臨床試驗，以評估抗炎藥對動脈粥樣硬化的治療效果。數(shù)據(jù)顯示[52]，MCC950是一種有效的選擇性NLRP3抑制劑，可抑制LPS和膽固醇刺激時巨噬細胞及樹突細胞中IL-1β的成熟和分泌，改善動脈粥樣硬化病變發(fā)展。降糖藥物二甲雙胍可通過抑制AMPK激活和調節(jié)TRX-1/TXNIP表達，減弱NLRP3炎癥小體的激活效應，抑制糖尿病模型中動脈粥樣硬化的進展[53]。此外，靶向TET2突變體和其他CHIP及其炎癥環(huán)境的基本原理和前景，作為抑制CHIP相關動脈粥樣硬化性疾病的潛在手段。攜帶TET2體細胞突變的個體可能比普通人群采用NLRP3炎癥小體靶向治療獲益更大，這將為TET2體細胞突變的動脈粥樣硬化患者的精準個性化治療提供基礎。圍繞NLRP3炎癥小體展開的動脈粥樣硬化研究為冠心病及卒中等疾病治療提供新策略，其臨床使用效率仍需要進一步探索。

oxLDL、ROS等代謝因子激活NLRP3炎癥小體，活化的Caspase-1切割下游因子IL-1β及GSDMD等前體分子，隨后促炎因子經由GSDMD-pore釋放并加速動脈粥樣硬化進程。TET2抑制IκB磷酸化及NLRP3炎癥小體活化，影響IL-1β等促炎因子和CXC趨化因子成熟及釋放。此外，TET2經由JAK-STAT通路負反饋調控IL-6表達。圖1 NLRP3炎癥小體激活及抑制途徑Fig.1 Activation and inhibition of the NLRP3 inflammasome

7 小結與展望

近年來，有關動脈粥樣硬化研究進展較快，尤其是NLRP3炎癥小體在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中的作用方面。NLRP3炎癥小體參與動脈粥樣硬化病變過程中的免疫應答及炎癥反應，介導全身性炎癥反應可能導致機體免疫穩(wěn)態(tài)失衡，因此靶向NLRP3炎癥小體減少、促炎因子的成熟及分泌并減弱其生物學效應，被視為AS預防及治療的新方向。目前，關于脂質介導的NLRP3炎癥小體活化在動脈粥樣硬化中作用的研究已經有所進展，但有關于TET2介導的克隆性造血在炎癥通路中作用的研究才剛開始。我們不僅需要探索NLRP3炎癥小體具體的激活機制以及體細胞TET2突變對DNA甲基化及克隆性造血的作用，還需進一步研究NLRP3炎癥小體與TET2及其他體細胞突變的交互作用，從而加深我們對動脈粥樣硬化的發(fā)病機制的理解，為動脈粥樣硬化性心血管疾病的臨床診斷、預防及治療提供新策略。