于明良，李 鵬，余 丹，尹平平，彭曉紅

武漢市第四醫(yī)院麻醉科,武漢 430022

骨癌痛是由原發(fā)性腫瘤或者其他部位腫瘤骨轉(zhuǎn)移所引起的一種頑固而難治的慢性疼痛綜合征，其兼具炎性痛和神經(jīng)病理性疼痛的部分特質(zhì)，又不同于這兩種疼痛。因其獨(dú)特而復(fù)雜的病理發(fā)展過(guò)程，目前人們對(duì)其生物學(xué)機(jī)制尚不完全清楚，癌痛三階梯靶控治療效果不甚理想，超過(guò)90%的進(jìn)展期及終末期癌癥患者幾乎難以控制癌痛[1]。因此，研究骨癌痛的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，尋找和開(kāi)發(fā)新的疼痛阻斷途徑具有重要意義?；|(zhì)金屬蛋白酶-13(MMP-13)作為內(nèi)源性酶超家族中唯一能夠裂解膠原分子三維螺旋結(jié)構(gòu)的酶類，其結(jié)構(gòu)高度保守。生理?xiàng)l件下，MMP-13能夠通過(guò)降解細(xì)胞外基質(zhì)影響細(xì)胞分化、遷移、血管形成、存活和凋亡[2-3]。病理?xiàng)l件下，其參與關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈粥樣硬化、血管炎癥反應(yīng)及惡性腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移等病理過(guò)程[4-5]。目前的研究表明，MMP-13參與了軟骨重塑和骨替代過(guò)程中對(duì)軟骨細(xì)胞外膠原基質(zhì)(ECM)的降解過(guò)程，其可通過(guò)降解和破壞Ⅱ型膠原及聚蛋白多糖而引發(fā)軟骨細(xì)胞的變形壞死，因而與影響骨骼重塑和炎癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[6]。目前骨癌痛的調(diào)控機(jī)制尚不完全清楚，MMP-13在其發(fā)生發(fā)展過(guò)程中作用的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究擬探討MMP-13在骨癌痛產(chǎn)生和維持中的作用。

1 材料與方法

1.1 試劑及主要儀器

Walker 256乳腺癌細(xì)胞(上海雅吉生物，貨號(hào)YS1363C)，MMP-13特異性抑制劑CL-82198(北京百奧萊博科技有限公司，貨號(hào)M01395)，兔抗鼠MMP-13多克隆抗體(三鷹生物，貨號(hào)18165-1-AP)，多聚甲醛(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，貨號(hào)80096618)，蘇木精(美國(guó)Sigma公司，貨號(hào)H9627-25G)，倒置白光/熒光拍照顯微鏡(日本OLYMPUS)，Von Frey纖維絲(美國(guó)North Coast Medical公司)，7370型熱痛儀(意大利UGO公司)，病理切片機(jī)(上海徠卡儀器有限公司)，Trizol(美國(guó)Invitrogen公司)。

1.2 動(dòng)物模型制備及用藥

選擇雌性SD大鼠，SPF級(jí)，體質(zhì)量(170±20)g，幼鼠體質(zhì)量(60±10)g，由湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供。動(dòng)物自由飲水進(jìn)食，12 h晝夜循環(huán)，實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)武漢市第四醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審議并批準(zhǔn)。雌性幼鼠腹腔注射Walker 256乳腺癌細(xì)胞0.5 mL，7 d后取腹水，調(diào)整細(xì)胞密度為1×104個(gè)/mL。40只雌性SD大鼠，每組10只，隨機(jī)分為假手術(shù)組(S組)、骨癌痛組(BCP組)、骨癌痛+生理鹽水組(NS組)、骨癌痛+CL-82198組(CL組)。參考Shenoy等[7]的方法構(gòu)建乳腺癌骨轉(zhuǎn)移模型，大鼠腹腔注射10%水合氯醛(4 mL/kg)，麻醉后左后肢備皮，消毒，脛骨上段行約1 cm切口，鈍性分離軟組織，于脛骨平臺(tái)下約0.5 cm處用1 mL注射器針頭鉆至骨髓腔，微量注射器緩慢注射0.01 mL Walker 256腫瘤細(xì)胞懸液。骨蠟封孔，消毒傷口，創(chuàng)面給予青霉素，縫合。S組骨髓腔注射0.01 mL 0.9 %氯化鈉注射液。NS組和CL組術(shù)后第7天起分別腹腔注射給藥干預(yù)，NS組腹腔注射生理鹽水1 mL、CL組腹腔注射CL-82198 5 mg/kg，每48 h給藥1次，連續(xù)2周。

1.3 X線檢測(cè)大鼠脛骨破壞情況

術(shù)后21 d，為了確定造模成功及觀察腫瘤對(duì)骨質(zhì)的破壞情況，將S組和BCP組大鼠給予10%水合氯醛麻醉后，仰臥固定，行脛骨X線檢查，觀察骨質(zhì)破壞情況。

1.4 蘇木精-伊紅染色(HE)檢測(cè)

取S組和BCP組大鼠患側(cè)脛骨，4%多聚甲醛固定，脫鈣3周。常規(guī)脫水、石蠟包埋切片、染色、膠封固定，顯微鏡下觀察脛骨組織形態(tài)，拍照。

1.5 疼痛評(píng)估

通過(guò)Von Frey絲和熱輻射儀測(cè)量大鼠模型的機(jī)械縮足閾值(paw withdrawl threshold，PWT)和熱縮足潛伏期(paw withdrawl latency，PWL)，以評(píng)估機(jī)械痛閾和熱痛閾[8]。對(duì)于PWT測(cè)量，將大鼠放于金屬透明網(wǎng)格籠里，先適應(yīng)30 min，Von Frey纖維絲自下而上刺激大鼠后足足趾底部中心，大鼠迅速退縮或舔爪子則記為陽(yáng)性，否則為陰性。用up-and-down法計(jì)算100%機(jī)械縮足閾值即為機(jī)械痛閾值。對(duì)于PWL測(cè)量，將大鼠置于透明玻璃上，強(qiáng)熱光照射大鼠左后足腳掌中心皮膚，記錄大鼠縮爪反應(yīng)時(shí)間，代表熱痛閾值(為防止?fàn)C傷大鼠，熱痛刺激儀切斷時(shí)間為20 s，間隔5 min)。

1.6 Western blot檢測(cè)MMP-13蛋白表達(dá)

取部分瘤組織加入裂解液，裂解勻漿后提取總蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法行蛋白濃度定量，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入相應(yīng)一抗室溫孵育2 h，TBST洗滌3次，每次5 min，加入二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜8次，每次5 min，加入ECL顯像曝光。Image J軟件對(duì)條帶灰度值進(jìn)行定量分析，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參GAPDH的比值作為其相對(duì)含量。

1.7 qRT-PCR法測(cè)定MMP-13、RANK、RANKL和OPG mRNA表達(dá)

取部分瘤組織，液氮研磨，采用Trizol試劑法從組織細(xì)胞中提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成互補(bǔ)鏈cDNA。隨后，使用SYBR GREEN PCR試劑盒(Applied Biosystems，中國(guó)上海)行RT-PCR檢測(cè)，參照試劑盒說(shuō)明書(shū)設(shè)定反應(yīng)體系。以GAPDH基因作為內(nèi)參，對(duì)樣品校正后采用2-ΔΔCt法計(jì)算各基因相對(duì)表達(dá)量。骨保護(hù)素(OPG)、核因子κB受體活化因子(RANK)、核因子κB受體活化因子配體(RANKL)及MMP-13的引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 骨癌痛模型建立

與S組相比，BCP組大鼠術(shù)后7 d接種腫瘤的左后肢開(kāi)始出現(xiàn)骨質(zhì)膨脹、肢體腫脹。術(shù)后21 d脛骨X線檢測(cè)，與S組相比，BCP組大鼠脛骨有明顯的骨質(zhì)破壞，骨皮質(zhì)不連續(xù)，明顯缺損，髓質(zhì)骨損失，有腫瘤生長(zhǎng)(圖1)。HE染色顯示，與S組相比，BCP組大鼠脛骨骨小梁及骨髓腔內(nèi)充滿腫瘤細(xì)胞，生長(zhǎng)活躍，穿破骨皮質(zhì)，出現(xiàn)骨質(zhì)破壞。腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)異形核、多核、分葉核等(圖2)，提示骨癌痛模型建立成功。

A：S組；B：BCP組圖1 大鼠脛骨X線檢查結(jié)果Fig.1 X-ray results of rat tibia

A：S組；B：BCP組圖2 大鼠脛骨蘇木精-伊紅染色結(jié)果(×200)Fig.2 HE staining results of rat tibia(×200)

2.2 大鼠機(jī)械痛閾與熱痛閾改變情況

各組大鼠在術(shù)前1 d的機(jī)械痛閾和熱痛閾比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。較術(shù)前1 d及S組，BCP組大鼠術(shù)后7 d出現(xiàn)了機(jī)械痛閾和熱痛閾的明顯降低，并持續(xù)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束(均P<0.05)，說(shuō)明骨癌痛大鼠出現(xiàn)了機(jī)械痛和熱痛敏；較BCP組和NS組，CL組大鼠在術(shù)后的11、14及21 d都出現(xiàn)了機(jī)械痛閾值和熱痛閾值的明顯升高(均P<0.05)，提示MMP-13特異性抑制劑CL-82198可緩解骨癌痛大鼠的機(jī)械痛和熱痛敏(均P<0.05)。見(jiàn)表2、表3。

表2 各組大鼠不同時(shí)點(diǎn)機(jī)械縮足閾值的變化Table 2 Changes of paw withdrawl threshold in rats among differert groups at different time

表3 各組大鼠不同時(shí)點(diǎn)熱縮足潛伏期的變化Table 3 Changes of paw withdrawl latency in rats among different groups at different time

2.3 大鼠腫瘤組織中OPG、RANK及RANKL的mRNA表達(dá)

與S組比較，BCP組及NS組RANK mRNA、RANKL mRNA的表達(dá)量均明顯升高，OPG mRNA表達(dá)量及OPG/RANKL比值均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；與BCP組比較，NS組RANK mRNA、RANKL mRNA、OPG mRNA及OPG/RANKL比值差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)；較BCP組和NS組，CL組RANK mRNA、RANKL mRNA的表達(dá)量均明顯降低，OPG mRNA表達(dá)量及OPG/RANKL比值均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 各組大鼠OPG、RANK、RANKL的mRNA表達(dá)Table 4 The expression levels of OPG mRNA，RANK mRNA and RANKL mRNA in each

2.4 大鼠腫瘤組織中MMP-13的表達(dá)

與S組比較，BCP組MMP-13 mRNA和蛋白的表達(dá)量均明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；與BCP組比較，NS組MMP-13 mRNA和蛋白的表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)；較BCP組和NS組，CL組MMP-13 mRNA和蛋白的表達(dá)量均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見(jiàn)圖3。

*P<0.05；**P<0.01圖3 各組大鼠腫瘤組織中MMP-13 mRNA及蛋白表達(dá)Fig.3 Expression levels of MMP-13 mRNA and protein in tumor tissues of rats in each group

3 討論

晚期癌癥患者經(jīng)常在骨轉(zhuǎn)移后出現(xiàn)癌痛，并伴有溶骨性病變和劇烈疼痛[9]。研究表明，約75%的晚期癌癥患者會(huì)經(jīng)歷中度或重度疼痛[10]，并且超過(guò)50%的轉(zhuǎn)移性癌痛患者，目前可用的藥物療法無(wú)法充分緩解疼痛[11]。轉(zhuǎn)移性癌癥患者的疼痛控制不充分通常伴隨著抑郁、焦慮、功能受損和生活質(zhì)量的顯著降低，導(dǎo)致發(fā)病率和死亡率增加[12]。骨骼需要不斷更新，骨重塑由成骨細(xì)胞進(jìn)行的骨沉積和破骨細(xì)胞負(fù)責(zé)的骨吸收之間的平衡精細(xì)調(diào)節(jié)[13]。而維持內(nèi)部環(huán)境中的礦物質(zhì)穩(wěn)態(tài)，主要由基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)介導(dǎo)。MMP-13是MMP中的一種，參與正常生理過(guò)程(如胚胎發(fā)育、繁殖和組織重塑)以及疾病過(guò)程(如關(guān)節(jié)炎和椎間盤(pán)退變)中細(xì)胞外基質(zhì)的分解。MMP-13的突變與包括癌癥和關(guān)節(jié)炎在內(nèi)的各種病理改變有關(guān)[14]。

RANKL及其受體RANK和OPG是腫瘤壞死因子(TNF)和TNF受體家族的一部分。它們都是骨代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑[15-16]。RANKL主要由成骨細(xì)胞分泌，通過(guò)與未成熟破骨細(xì)胞上的RANK結(jié)合，誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化為成熟破骨細(xì)胞，從而調(diào)節(jié)骨吸收。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明RANKL基因敲除的小鼠會(huì)出現(xiàn)明顯的破骨細(xì)胞分化障礙，表現(xiàn)為出牙困難和骨硬化病[17]。而RANK基因敲除的小鼠會(huì)出現(xiàn)成熟破骨細(xì)胞減少，B細(xì)胞、T細(xì)胞分化障礙，亦表現(xiàn)為嚴(yán)重的骨硬化病[18]。研究發(fā)現(xiàn)RANK需要通過(guò)接頭蛋白如TRAF(TNF-receptor associated factor)來(lái)傳遞細(xì)胞信號(hào)，與RANKL結(jié)合后，通過(guò)活化磷脂酰肌醇(-3)激酶(phosphatidylinositol 3-kinases，PI3K)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)、轉(zhuǎn)錄因子核因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)等信號(hào)通路來(lái)激活T細(xì)胞的胞質(zhì)核因子1(nuclear factor of activated T-cells cytoplasmic 1，NFATc1)。RANKL還能觸發(fā)c-Fos的表達(dá)，c-Fos是激活蛋白-1轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物的主要成分，可誘導(dǎo)NFATc1的表達(dá)[19]。激活的NFATc1可以誘導(dǎo)破骨前體細(xì)胞增殖，促進(jìn)骨重吸收，并形成酸性環(huán)境，使酸敏感離子通道3(ASIC-3)和辣椒素受體1(transient receptor potential vanilloid-1，TRPV1)激活，導(dǎo)致痛覺(jué)過(guò)敏，促進(jìn)骨癌痛的發(fā)展。

OPG是腫瘤壞死因子受體家族的一員，具有抑制破骨細(xì)胞分化和增加骨密度的作用[20]。OPG通過(guò)阻斷RANKL與RANK的結(jié)合來(lái)抑制破骨細(xì)胞分化和活性，從而抑制骨吸收[21-22]。因此，OPG表達(dá)與RANKL和RANK表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。OPG可以有效阻止RANKL和RANK相互作用從而抑制破骨細(xì)胞分化并促進(jìn)其凋亡。研究表明敲除OPG基因的小鼠會(huì)出現(xiàn)骨質(zhì)減少和骨質(zhì)疏松癥。血液中的RANKL/OPG比值增加，是導(dǎo)致病理性骨重塑和骨肉瘤生長(zhǎng)之間建立惡性循環(huán)的關(guān)鍵[23]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)RANKL/OPG的比值是骨吸收增加的早期預(yù)測(cè)指標(biāo)，如果比值增高，則破骨細(xì)胞形成活躍，反之，則破骨細(xì)胞形成受到抑制，因此它可能是骨損傷的重要生物標(biāo)志物[24]。

本實(shí)驗(yàn)中BCP組大鼠脛骨RANK、RANKL mRNA表達(dá)升高，OPG mRNA、OPG/RANKL比值降低，提示OPG、RANK、RANKL可通過(guò)調(diào)控破骨細(xì)胞參與骨癌痛。OPG、RANK、RANKL共同構(gòu)成破骨細(xì)胞分化和骨吸收的關(guān)鍵信號(hào)通路[25]。研究表明，在RANK過(guò)表達(dá)細(xì)胞中，金屬蛋白酶基因如MMP-9和MMP-13的表達(dá)水平增加[26]。在腫瘤-骨界面，MMP-13、RANKL基因的表達(dá)上調(diào)已被識(shí)別。MMP-13表達(dá)的敲低顯著減少了腫瘤-骨界面處的骨破壞和活化的破骨細(xì)胞數(shù)量[27]。在本實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)到BCP組大鼠MMP-13蛋白及mRNA表達(dá)升高，提示上調(diào)MMP-13的表達(dá)促進(jìn)了骨癌痛的形成。而通過(guò)給予MMP-13特異性抑制劑后，MMP-13的表達(dá)受抑制，脛骨RANK、RANKL mRNA表達(dá)降低，OPG mRNA、OPG/RANKL比值升高，大鼠的機(jī)械痛閾和熱痛閾明顯升高。據(jù)此我們推測(cè)MMP-13可能通過(guò)下調(diào)OPG、上調(diào)RANK、RANKL表達(dá)，介導(dǎo)破骨細(xì)胞生成活化，從而參與骨癌痛的進(jìn)展。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多刺激物可以誘導(dǎo)MMP的表達(dá)，但具體是哪些信號(hào)分子通路介導(dǎo)MMP-13調(diào)控骨癌痛，尚需進(jìn)一步研究。