宋乃成，王 磊，張 彬，李壽康，鄭志坤△，李勁松△

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院 1胸外科 2腫瘤科，武漢 430022

食管癌是一類較為常見的惡性腫瘤，據(jù)2020年全球癌癥數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，其發(fā)病率在所有癌癥中排名第7(60.4萬例新發(fā)病例)，死亡率排名第6(54.4萬例死亡)，這意味著在2020年每18例癌癥死亡中就有1例是食管癌造成的[1]。近年來，隨著胃鏡的普及和手術(shù)技術(shù)的改進(jìn)，食管癌的生存率有所提高，但是因食管癌有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)移、侵襲能力以及較高的復(fù)發(fā)率，使得食管癌的總體治療效果不甚理想。食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)是食管癌最常見的組織學(xué)亞型，其發(fā)病率和死亡率呈快速上升趨勢(shì)，同時(shí)也是我國(guó)食管癌患者主要的病理類型[2]。因此，研究ESCC的發(fā)病機(jī)制及潛在的分子靶點(diǎn)對(duì)探索新的治療方式及藥物十分重要。

我們?cè)谇捌谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)鋅指蛋白185(zinc finger protein 185，ZNF185)在ESCC細(xì)胞中低表達(dá)，基因數(shù)據(jù)庫的檢索也證明了這一點(diǎn)[3]。而ZNF185也被報(bào)道為一種抑癌基因，與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程相關(guān)。早期的一項(xiàng)研究證實(shí)ZNF185基因表達(dá)的降低與前列腺癌進(jìn)展高度相關(guān)[4]。也有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ZNF185表達(dá)降低是肺原發(fā)腫瘤和肺癌細(xì)胞系的常見特征，說明此蛋白在肺癌發(fā)展中也起到一定作用[5]。近期的研究發(fā)現(xiàn)ZNF185在高級(jí)別的低分化鱗狀細(xì)胞癌中顯著低表達(dá)，并且參與角化細(xì)胞的分化過程[6]。但ZNF185相關(guān)的信號(hào)通路仍然需要進(jìn)一步的研究。

因此，為了探究ZNF185對(duì)ESCC的作用機(jī)制，我們建立了敲低ZNF185表達(dá)的ESCC細(xì)胞系，并通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(transcriptome sequencing，RNA-seq)檢測(cè)敲低ZNF185后ESCC細(xì)胞的mRNA表達(dá)譜變化，再通過生物信息分析篩選出可能的相關(guān)信號(hào)通路，以期為ESCC發(fā)病機(jī)制研究探索新的方向和思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人食管鱗狀細(xì)胞癌Eca-109細(xì)胞株購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫。Eca-109細(xì)胞用含10%胎牛血清(164210-500，武漢普諾賽生命科技有限公司)和1%青霉素/鏈霉素(PB180120，武漢普諾賽生命科技有限公司)的RPMI-1640(PM150110，武漢普諾賽生命科技有限公司)培養(yǎng)液于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 分組及處理

將ESCC細(xì)胞系Eca-109分為2組進(jìn)行培養(yǎng)：①ZNF185干擾組(Eca-109+shRNA-ZNF185)，構(gòu)建含ZNF185 shRNA的慢病毒轉(zhuǎn)染Eca-109細(xì)胞；②干擾對(duì)照組(Eca-109+shRNA-NC)，空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Eca-109細(xì)胞。

1.3 慢病毒轉(zhuǎn)染

含有pVSV-G的慢病毒顆粒與293T細(xì)胞混合培養(yǎng)，通過lipofectamine 2000產(chǎn)生不同的慢病毒顆粒。將含有慢病毒顆粒的細(xì)胞培養(yǎng)液收獲并加入到Eca-109細(xì)胞系的培養(yǎng)液，48 h后更換新鮮培養(yǎng)液，72 h后收集細(xì)胞并采用實(shí)時(shí)定量PCR和蛋白免疫印跡Western blot鑒定轉(zhuǎn)染病毒后ZNF185表達(dá)的效果。

1.4 RNA提取和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

應(yīng)用試劑盒提取總RNA，評(píng)估RNA質(zhì)量，由諾禾致源公司完成轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。建庫起始RNA為總RNA，通過Oligo(dT)磁珠富集帶有多聚腺嘌呤尾的mRNA，隨后在裂解緩沖液中用二價(jià)陽離子將得到的mRNA隨機(jī)打斷。以片段化的mRNA為模版，隨機(jī)寡核苷酸為引物，在逆轉(zhuǎn)錄酶體系中合成cDNA第1條鏈，隨后用RNA酶H降解RNA鏈，并在DNA聚合酶Ⅰ體系下，以dNTPs為原料合成cDNA第2條鏈。純化后的雙鏈cDNA經(jīng)過末端修復(fù)、加腺嘌呤尾并連接測(cè)序接頭，用純化磁珠篩選370～420 bp的cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增并再次使用純化磁珠純化PCR產(chǎn)物，最終獲得文庫。由測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序，庫檢合格后，把不同文庫按照有效濃度及目標(biāo)下機(jī)數(shù)據(jù)量的需求集中后進(jìn)行測(cè)序，并產(chǎn)生150 bp配對(duì)末端讀數(shù)。

1.5 測(cè)序數(shù)據(jù)處理及分析

測(cè)序獲得的原始數(shù)據(jù)中包含少量帶有測(cè)序接頭或測(cè)序質(zhì)量較低的reads。為了保證數(shù)據(jù)分析的質(zhì)量及可靠性，需要對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾。使用DESeq2軟件(1.20.0)進(jìn)行兩個(gè)比較組之間的差異表達(dá)分析。通過clusterProfiler(3.4.4)軟件實(shí)現(xiàn)差異表達(dá)基因的基因本體論(the Gene Ontology，GO)富集分析以及京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路中差異表達(dá)基因的統(tǒng)計(jì)富集。

STRING數(shù)據(jù)庫用于分析差異表達(dá)基因的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)。本研究使用STRING在線工具及Cytoscape(3.8.2)軟件將RNA-Seq測(cè)序數(shù)據(jù)中差異表達(dá)的基因進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，尋找ZNF185下游的關(guān)鍵靶基因。

GEPIA是基于交互網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器的RNA測(cè)序數(shù)據(jù)分析工具，能夠從TCGA數(shù)據(jù)庫及GTEx數(shù)據(jù)庫中分析相關(guān)腫瘤及正常組織的表達(dá)差異情況[7]。利用GEPIA分析關(guān)鍵基因在ESCC及正常組織的表達(dá)差異情況，同時(shí)進(jìn)行相關(guān)生存分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Graphpad 7.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料兩組間比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 測(cè)序結(jié)果質(zhì)量控制

為了保證轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性，分析前經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)量控制，對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行了過濾和篩選，去除了低質(zhì)量的數(shù)據(jù)信息。同時(shí)檢測(cè)了測(cè)序錯(cuò)誤率及GC堿基含量分布，數(shù)據(jù)匯總見表1。6組樣品，堿基質(zhì)量值大于20(Q20)和30(Q30)的堿基占總體堿基比例分別大于97%及93%，錯(cuò)誤率在0.03%左右，表明測(cè)序結(jié)果較好。6組數(shù)據(jù)原始序列總計(jì)約有2.74×108個(gè)，最終得到的用于分析的序列有2.61×108個(gè)(95.36%)。

表1 測(cè)序結(jié)果及質(zhì)量控制Table 1 Summary of transcriptome sequencing results and quality control

2.2 分析測(cè)序數(shù)據(jù)篩選出差異基因

為了分析ESCC細(xì)胞中ZNF185所調(diào)控的相關(guān)基因，在轉(zhuǎn)錄組分析中對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行總結(jié)。通過DEseq軟件篩選出樣本中表達(dá)明顯差異的基因，篩選標(biāo)準(zhǔn)按照經(jīng)驗(yàn)選擇│log2(Fold Change)│>0并且P≤0.05。結(jié)果發(fā)現(xiàn)ZNF185干擾組與干擾對(duì)照組的差異基因共有3859個(gè)，其中表達(dá)升高的基因有2112個(gè)，表達(dá)下降的基因有1747個(gè)(圖1)。

圖1 食管鱗癌細(xì)胞中敲低ZNF185后的差異表達(dá)基因火山圖Fig.1 Volcano map of differentially expressed genes after knockdown of ZNF185

2.3 GO功能富集分析結(jié)果

關(guān)于ZNF185在ESCC中參與的生物學(xué)過程，我們運(yùn)用GO功能富集分析，使用cluster Profiler(3.4.4)軟件實(shí)現(xiàn)差異表達(dá)基因的GO富集分析。GO是描述基因功能的綜合性數(shù)據(jù)庫，可分為生物過程(biological process，BP)、細(xì)胞組成(cellular component，CC)和分子功能(molecular function，MF)3個(gè)部分，可以揭示基因及其表達(dá)產(chǎn)物可能的生物學(xué)功能。分析結(jié)果顯示顯著富集的GO項(xiàng)目共有444項(xiàng)，其中生物過程348項(xiàng)，細(xì)胞組成63項(xiàng)，分子功能33項(xiàng)。在分析結(jié)果中，選擇了以上3個(gè)方面中每個(gè)方面最顯著的前10個(gè)項(xiàng)目，包括RNA剪接、核糖核蛋白復(fù)合物的生物生成、細(xì)胞-基質(zhì)連接、局部粘附、細(xì)胞粘附分子的結(jié)合、鈣粘著蛋白的結(jié)合等(圖2)。這說明ZNF185可能通過上述生物學(xué)功能參與調(diào)控ESCC的發(fā)生發(fā)展。

BP：生物過程；CC：細(xì)胞組成；MF：分子功能；圖僅列出中各項(xiàng)排名前10位的GO分析富集條目。圖2 GO功能富集分析Fig.2 Results of GO function enrichment analysis

2.4 KEGG富集分析結(jié)果

同時(shí)為了進(jìn)一步了解ZNF185的生物學(xué)功能，本研究還進(jìn)行了KEGG通路富集分析。KEGG是整合了基因組、化學(xué)和系統(tǒng)功能信息的綜合性數(shù)據(jù)庫。結(jié)果顯示，在ESCC細(xì)胞中敲低ZNF185后差異表達(dá)基因顯著富集的代謝過程有：剪接體、核糖體、癌癥過程中的蛋白多糖和microRNAs、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工過程等。其中也包括一些信號(hào)通路，如：缺氧誘導(dǎo)因子1(hypoxia inducible factor 1,HIF-1)信號(hào)通路、p53信號(hào)通路等(圖3)。

縱坐標(biāo)表示KEGG通路富集分析的條目，橫坐標(biāo)表示顯著差異表達(dá)基因的比例，每個(gè)點(diǎn)的大小表示基因的數(shù)目。圖3 KEGG通路富集分析Fig.3 Results of KEGG pathway enrichment analysis

2.5 差異表達(dá)基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析

為了充分了解ZNF185與其他蛋白之間的相互作用以及潛在機(jī)制，本研究使用STRING 11.0及Cytoscape 3.8.2工具構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，由于差異基因過多，選擇│log2(Fold Change)│>1.6并且P≤0.05的基因?qū)?yīng)的蛋白質(zhì)(圖4A)，并根據(jù)MCODE插件繪制子網(wǎng)絡(luò)圖(圖4B)，利用cytoHubba插件計(jì)算網(wǎng)絡(luò)圖中節(jié)點(diǎn)的度(degree)，即與此節(jié)點(diǎn)相連的邊數(shù)，某個(gè)節(jié)點(diǎn)的度越大，說明其可能在網(wǎng)絡(luò)中處于較為核心的位置。根據(jù)度的大小選擇了蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的中心節(jié)點(diǎn)關(guān)鍵蛋白(圖4C)。

A：│log2(Fold Change)│>1.6并且P≤0.05的基因?qū)?yīng)的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)；B：根據(jù)MCODE插件繪制子網(wǎng)絡(luò)圖；C：度(degree)排名位于前列的基因?qū)?yīng)蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)。圖4 差異表達(dá)基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析Fig.4 Protein-protein interaction network analysis of differentially expressed genes

2.6 關(guān)鍵蛋白的表達(dá)及生存分析

通過GEPIA網(wǎng)絡(luò)工具在TCGA數(shù)據(jù)庫中對(duì)關(guān)鍵蛋白對(duì)應(yīng)的基因在食管癌(ESCA)數(shù)據(jù)集的表達(dá)情況進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)與正常組織相比，關(guān)鍵基因BMP2、OAS2、OAS3、IFI6在食管癌中表達(dá)升高(圖5)。通過GEPIA工具對(duì)上述基因進(jìn)行了生存分析，結(jié)果顯示BMP2的表達(dá)升高與食管癌患者預(yù)后差有關(guān)(P<0.05)。而OAS2、OAS3及IFI6的表達(dá)與食管癌患者的預(yù)后相關(guān)性不高。對(duì)比BMP2低表達(dá)者，BMP2表達(dá)升高的患者總體生存率(overall survival，OS)明顯降低(圖6)。

T：食管癌組織；N：正常組織；*P<0.05圖5 關(guān)鍵基因在食管癌及正常組織的表達(dá)情況Fig.5 Expression of critical genes in esophageal cancer tissues and normal tissues

圖6 關(guān)鍵基因在食管癌患者中的生存分析Fig.6 Survival analysis of critical genes in esophageal cancer

3 討論

ESCC作為一種惡性程度高、易復(fù)發(fā)的疾病，在被診斷時(shí)往往已是疾病的晚期，總體預(yù)后較差[8]，而其發(fā)病機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。ZNF185作為一種含鋅離子并帶有指狀結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)[9]，在多種腫瘤中存在表達(dá)異常的情況，提示該基因可能在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。本研究利用shRNA轉(zhuǎn)染ESCC細(xì)胞系，敲低ESCC細(xì)胞中ZNF185的表達(dá)，再提取RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。結(jié)果顯示敲低ESCC中ZNF185表達(dá)后有2112個(gè)基因表達(dá)升高，1747個(gè)基因表達(dá)下降，同時(shí)通過GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，得到ZNF185可能起到關(guān)鍵作用的生物學(xué)過程及信號(hào)通路。另外利用蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析，篩選出中心節(jié)點(diǎn)的關(guān)鍵蛋白。

ZNF185基因編碼1個(gè)肌動(dòng)蛋白-細(xì)胞骨架相關(guān)的Lin-l1、Isl1和Mec-3(LIM)結(jié)構(gòu)域含鋅指蛋白，最初從染色體Xq28上分離出來。LIM結(jié)構(gòu)域是蛋白-蛋白相互作用結(jié)構(gòu)域，廣泛存在于各種蛋白質(zhì)中，其功能與細(xì)胞骨架動(dòng)力學(xué)、發(fā)育以及癌癥的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[10]。既往研究顯示，ZNF185在前列腺癌、肺部腫瘤及頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)下降[4-6]，提示其可能起到一定的抑制癌癥的作用。另有研究發(fā)現(xiàn)ZNF185為結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的不良預(yù)測(cè)因素，提示其在結(jié)腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移中可能起到促進(jìn)作用[11]。而在乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)ZNF185在轉(zhuǎn)移灶中有明顯突變[12]。同時(shí)也有研究發(fā)現(xiàn)ZNF185與腫瘤的血行轉(zhuǎn)移相關(guān)，其在細(xì)胞膜中的高表達(dá)被認(rèn)為是胰腺癌的不良預(yù)后因素[13]。另外也有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ZNF185與胰腺癌對(duì)吉西他濱的化療敏感性相關(guān)，下調(diào)ZNF185可提高胰腺癌細(xì)胞的化學(xué)敏感性、促進(jìn)凋亡和增殖抑制[14]。我們的既往研究發(fā)現(xiàn)ZNF185在ESCC中表達(dá)明顯較低，且在ESCC細(xì)胞中敲低ZNF185后腫瘤細(xì)胞的增殖能力明顯增強(qiáng)[3]，提示ZNF185能夠抑制ESCC腫瘤的發(fā)生發(fā)展，本次的轉(zhuǎn)錄組分析為研究ZNF185的作用機(jī)制及其下游通路提供了進(jìn)一步的線索和方向。

在具體信號(hào)通路方面，有研究發(fā)現(xiàn)ZNF185能夠通過抑制AKT/GSK3β途徑抑制肺腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲[15]。在鱗狀細(xì)胞癌中ZNF185能夠通過p63相關(guān)通路影響鱗狀上皮的分化[6]。也有實(shí)驗(yàn)證實(shí)了p53野生型細(xì)胞在DNA損傷時(shí)，能夠轉(zhuǎn)錄激活ZNF185，從而抑制腫瘤細(xì)胞的活性、侵襲性及轉(zhuǎn)移能力[16]。

在GO功能富集分析中顯示，ZNF185在ESCC中可能與RNA剪接、核糖核蛋白復(fù)合物的生物生成、細(xì)胞-基質(zhì)連接、局部粘附、細(xì)胞粘附分子的結(jié)合、鈣粘著蛋白的結(jié)合等生物學(xué)過程相關(guān)。而ZNF185作為肌動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白，具體的功能尚不清楚，但已有研究顯示其能與鈣粘蛋白相互作用[6]，提示ZNF185與細(xì)胞粘附相關(guān)，這與我們的分析結(jié)果一致，提示ZNF185很可能通過調(diào)控ESCC細(xì)胞的局部粘附影響腫瘤的發(fā)生。

KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)在ESCC細(xì)胞中敲低ZNF185后，HIF-1信號(hào)通路和p53信號(hào)通路出現(xiàn)顯著的富集，提示ZNF185可能通過上述通路影響ESCC的發(fā)生發(fā)展。HIF-1由2個(gè)亞基(HIF-1α和HIF-1β)組成，在調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)缺氧的適應(yīng)性反應(yīng)中起著核心作用。在缺氧條件下，HIF-1α變得穩(wěn)定，易位進(jìn)入細(xì)胞核，并與HIF-1β異二聚形成復(fù)雜的HIF-1，再激活一系列下游基因的表達(dá)[17]。其在腫瘤的增殖、遷移、進(jìn)展、代謝重編程、血管生成和腫瘤干細(xì)胞干性維持等方面也發(fā)揮著關(guān)鍵作用[18]。同時(shí)也有研究發(fā)現(xiàn)HIF-1α為ESCC患者的不良預(yù)后因素[19-21]。且有實(shí)驗(yàn)證實(shí)穩(wěn)定敲低HIF-1α可抑制ESCC細(xì)胞的增殖[22]，但具體機(jī)制尚不清楚。另外研究發(fā)現(xiàn)HIF/缺氧信號(hào)能夠誘導(dǎo)p53表達(dá)[23]，而p53的表達(dá)可以負(fù)反饋地降解HIF-1α[24]。我們的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)提示ZNF185可能通過HIF-1/p53信號(hào)通路影響ESCC的發(fā)生發(fā)展，當(dāng)然這還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

在PPI網(wǎng)絡(luò)分析及生存分析中，BMP2作為關(guān)鍵基因在食管癌中表達(dá)升高，并且與患者預(yù)后相關(guān)。BMP2是骨形態(tài)發(fā)生蛋白家族的一員，隸屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1超家族，在調(diào)控生長(zhǎng)發(fā)育過程中扮演重要角色[25]。有研究證實(shí)BMPs過表達(dá)顯著影響ESCC細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[26]，提示ZNF185在ESCC中的作用可能與BMP2有關(guān)。

綜上所述，本研究通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)及生物信息分析技術(shù)，得出食管鱗癌Eca-109細(xì)胞在敲低ZNF185后基因的差異表達(dá)情況，分析結(jié)果顯示ZNF185能夠通過細(xì)胞粘附等生物學(xué)過程影響ESCC的發(fā)生發(fā)展，其調(diào)控機(jī)制可能是通過HIF-1/p53信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)，提示ZNF185可能成為ESCC治療的潛在靶點(diǎn)。