吳 杉 牛振楠 孟常娟 路 萌 成云云*

（1.邢臺(tái)市第三醫(yī)院健康體檢中心，邢臺(tái) 054000；2.邢臺(tái)市第三醫(yī)院內(nèi)鏡室，邢臺(tái) 054000；3.邢臺(tái)市第三醫(yī)院病理科，邢臺(tái) 054000）

宮頸癌是女性第四大常見(jiàn)的惡性腫瘤，尤其是在發(fā)展中國(guó)家。目前國(guó)際上關(guān)于高級(jí)別宮頸病變的診治沒(méi)有爭(zhēng)議［1］。但是，宮頸病變的患者即使在治療后發(fā)生宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)明顯高于正常人群。因此，為了防止宮頸病變的復(fù)發(fā)和進(jìn)展，對(duì)這部分人群的監(jiān)測(cè)是一項(xiàng)重要的工作。然而，不同的國(guó)家和地區(qū)的隨訪方案差異比較大。目前對(duì)于宮頸病變治療后的女性，術(shù)后需要定期行宮頸細(xì)胞學(xué)和宮頸HPV 檢測(cè)，但由于篩查方法存在高敏感性和低特異性等不足，這部分患者需要頻繁的接受檢查［2，3］。并且檢測(cè)的間隔時(shí)間長(zhǎng)短不一，這不僅為患者帶來(lái)嚴(yán)重的心理負(fù)擔(dān)和壓力，也為國(guó)家?guī)?lái)巨大的負(fù)擔(dān)。因此，目前需要一種方法可以簡(jiǎn)便和有效的預(yù)測(cè)宮頸病變治療后的殘留與復(fù)發(fā)。約99.7%的宮頸癌是由于HPV 感染造成的，HPV 持續(xù)感染與子宮頸癌，肛門生殖器，以及頭頸癌密切相關(guān)［4，5］。國(guó)際認(rèn)可的宮頸癌篩查三步方案包括初次篩查、陰道鏡檢查和組織病理學(xué)。目前，通過(guò)HPV 檢測(cè)和Thinprep 細(xì)胞學(xué)檢測(cè)（TCT）單獨(dú)篩查方案應(yīng)用廣泛，但篩查結(jié)果較局限，仍需尋找可靠的篩查方案。本研究探討TCT 結(jié)合HR?HPV 基因檢測(cè)對(duì)宮頸病變的診斷及HPV 基因型與TCT 結(jié)果、病理分型的關(guān)系。評(píng)價(jià)其對(duì)診斷宮頸病變的價(jià)值，進(jìn)而為宮頸癌的及時(shí)發(fā)現(xiàn)以及后續(xù)療法的選擇提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年1月~2020年10月入邢臺(tái)市第三醫(yī)院的行宮頸病變的426例，<21 歲組80例，21~29歲組98例，30~65 歲組135例，>65 歲組113例，均行TCT 檢測(cè)和HR?HPV 基因型檢測(cè)，患者均知曉并簽署《知情同意書》，本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審查并通過(guò)。

1.2 納入和排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：①參照美國(guó)宮頸病變篩查推薦指南；②患者檢查前3d 未進(jìn)行性行為；③患者可進(jìn)行良好溝通，無(wú)嚴(yán)重的精神病史；④無(wú)其他器官功能障礙；⑤伴有白帶異常、陰道內(nèi)不規(guī)則出血等。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有急性生殖道炎癥，免疫系統(tǒng)疾病以及性傳播疾病等；②已進(jìn)行全子宮切除術(shù)；③篩查的1 周內(nèi)有陰道用藥史；④已接受過(guò)HPV治療者（2 內(nèi)周內(nèi)）；⑤不配合本研究患者。

1.3 方法

1.3.1 TCT 檢測(cè)方法

是一種針對(duì)傳統(tǒng)巴氏涂片缺點(diǎn)改進(jìn)后的宮頸細(xì)胞脫落采集、制片、閱片的方法。利用從宮頸外表面（子宮頸陰道部）和宮頸管（宮頸內(nèi)膜）獲取的細(xì)胞來(lái)評(píng)估移行帶（鱗狀柱狀上皮接合處）發(fā)生宮頸病變的風(fēng)險(xiǎn)。TCT 的采樣工具是一把小毛刷，和傳統(tǒng)的刮板相比，可以刷到更多細(xì)胞，然后經(jīng)過(guò)特殊的制片技術(shù)把細(xì)胞分散成薄層樣本。經(jīng)Thin Prep 2000 全自動(dòng)超薄液基細(xì)胞學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)制備成均勻的薄層細(xì)胞涂片，將玻片進(jìn)行染色固定后進(jìn)行細(xì)胞學(xué)診斷。

1.3.2 HPV 基因型檢測(cè)

采用PCR 反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)，以及HPV 基因分型檢測(cè)試劑盒（深圳市某生物藥械有限公司）進(jìn)行定性檢測(cè)并加以分型，能夠檢測(cè)23種HPV 基因型，直接提示感染HPV 的基因型；包括17種高危型（R?HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82）和6種低危型（L?HPV6、11、42、43、81、83）。采用PCR 儀（BD，美國(guó)）、核酸分子快速雜交儀、基因芯片?微陣列掃描分析儀，PCR 擴(kuò)增待檢測(cè)樣品，并進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系嚴(yán)格按照說(shuō)明書。根據(jù)反應(yīng)的質(zhì)量，每個(gè)擴(kuò)增系統(tǒng)的最終體積為25 μl，由50 mM KCl，10 mM pH 8.3 的Tris?HCl，4 mM MgCl2、200 mM 脫氧核苷酸三磷酸（dNTP），50 pmol 組成每個(gè)引物和2U Easy TAQ DNA Poly?merase。在PCR 儀中對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)，反應(yīng)條件為：94 ℃下45 s 變性，58 ℃下45 s 退火，并于45 ℃延伸。在72 ℃下45 s，在72 ℃下5分鐘；而使用GP5+和GP6+引物進(jìn)行擴(kuò)增的條件包括：在94 ℃初始變性4分鐘，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，其中在94 ℃變性1分鐘，在50 ℃退火1分鐘并在72 ℃下在1分鐘內(nèi)延長(zhǎng)15 s，此外，在1.3%瓊脂糖凝膠中使用電泳分析通過(guò)反應(yīng)獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 不同年齡層次HPV 基因型陽(yáng)性率

分析年齡<21歲、21~29歲、30~65歲以及>65歲的年齡段的HPV 基因型陽(yáng)性率；

1.4.2 TCT 結(jié)果與病理診斷陽(yáng)性率

分析TCT 結(jié)果（ASCUS、LSIL、HSIL、SCC）與病理診斷陽(yáng)性（CINⅠ、CINⅡ、CINIII 、癌、病理陽(yáng)性率（%）；

1.4.3 比較病理分級(jí)與HPV 感染情況

HR?HPV 陽(yáng) 性、HPV 陰 性、HPV16+ 或HPV18+、HPV16 及HPV18 亞型感染率與病例分級(jí)比較。

1.4.4 比較HR‐HPV 感染與TCT 檢測(cè)異常比較

宮頸炎組中HR?HPV 陽(yáng)性、宮頸CIN 組、宮頸浸潤(rùn)癌組。

1.4.5 比較TCT 結(jié)合HR‐HPV 基因檢測(cè)

分析3 種檢測(cè)方式陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值、假陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、假陰性預(yù)測(cè)值

1.4.6 ROC 曲線分析

分析3 種檢測(cè)方式的特異性和靈敏度。

1.4.7 相關(guān)性分析

以16、18、31、35、39、45、51、58、68、73 及82分型，采用Seperman 進(jìn)行相關(guān)性分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，以率［n（%）］表示，ROC 曲線用于靈敏度與特異度分析，采用Seperman 分析檢測(cè)的相關(guān)性，以α=0.05 為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 比較不同年齡層次HPV 基因型陽(yáng)性率

與<21 歲組比較，30~65歲組和>65歲組HR?HPVS 陽(yáng)性率升高（P<0. 05）；與<21 歲組比較，>65歲組L?HPV 陽(yáng)性率降低（P<0. 05）；與21~29歲組比較，30~65 歲組、>65歲組HR?HPV陽(yáng)性率均升高（P<0. 05），而L?HPV 陽(yáng)性率比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0. 05）；而HPV 陰性率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0. 05）。見(jiàn)表1。

表1 比較不同年齡范圍HPV 基因型陽(yáng)性率

2.2 比較TCT 結(jié)果與病理診斷陽(yáng)性率

426例異常TCT 患者中病理陽(yáng)性133例，病理陽(yáng)性率31.2%，其中，ASCUS 病理陽(yáng)性45例（4.37%），LSIL 病理陽(yáng)性24例（38.1%），HSIL 病理陽(yáng)性45例（60.81%），SCC 病理陽(yáng)性率為100%，隨著TCT 檢查級(jí)別與病理陽(yáng)性率成正比（P<0.05）。見(jiàn)表2。

表2 比較TCT 結(jié)果與病理診斷陽(yáng)性率

2.3 比較病理分級(jí)與HPV 感染情況

相比于HPV16+或HPV18+，HPV16 及HPV18亞型感染率在不同病例分級(jí)（CNⅠ、CNⅡ、CNⅢ、SCC）中明顯升高（P<0.05）。見(jiàn)表3。

表3 比較病理分級(jí)與HPV 感染情況

2.4 高危型HR‐HPV 感染與TCT 檢測(cè)異常的比較

宮頸炎組中HR?HPV 陽(yáng)性77例，感染率36.15%，宮頸CIN 組中HR?HPV 陽(yáng)性58例，感染率73.41%，宮頸浸潤(rùn)癌組中HR?HPV 陽(yáng)性31例，感染率91.12%，提示宮頸病變病理級(jí)別與高危型HPV 感染率呈正比（P<0.05）。見(jiàn)表4。

表4 高危型HR‐HPV 感染與TCT 檢測(cè)異常的比較

2.5 比較TCT 結(jié)合HR‐HPV 基因檢測(cè)

TCT+HR?HPV 檢測(cè)的陰性預(yù)測(cè)值均高于單獨(dú)的T CT 和HR?HPV 檢測(cè)。見(jiàn)表5。

表5 比較TCT 結(jié)合HR‐HPV 檢測(cè)

2.6 ROC 曲線分析

TCT+HR?HPV 檢測(cè)敏感度及特異度均高于單獨(dú)的TCT 和HR?HPV 檢測(cè)，兩種方法聯(lián)合檢測(cè)敏感度及特異度均最高。見(jiàn)圖1。

圖1 TCT、HR‐HPV 和 TCT+HR‐HPV ROC 曲線分析

2.7 HPV 基因型與宮頸病變的相關(guān)性分析

以16、18、31、35、39、45、51、58、68、73 及82分型，進(jìn)行相關(guān)性分析，其中16、18、31、58、73 及82 密切相關(guān)（P<0.05）。見(jiàn)表6。

表6 HPV 基因型與宮頸病變的相關(guān)性分析

3 討論

宮頸病變是我國(guó)女性中常見(jiàn)的婦科疾病，癌變的可能性極大，長(zhǎng)時(shí)間的HR?HPV 感染在宮頸癌的發(fā)展中起主要作用，高危型HPV 感染累計(jì)一定程度發(fā)展為宮頸原位癌。一些研究已經(jīng)報(bào)道了感染程度與HPV 類型特異性，持續(xù)存在相關(guān)聯(lián)的靈敏度損失，而另一些則未表示出此相關(guān)性。這些差異可能是HPV 檢測(cè)方法差異，因此，早期診斷和及時(shí)治療宮頸癌病變對(duì)于宮頸癌篩查尤為重要。幾種技術(shù)用于篩查宮頸癌，例如視覺(jué)檢查，陰道鏡檢查和宮頸抹片檢查，但是這些技術(shù)在檢測(cè)癌前病變方面具有較低或中等的臨床敏感性［6，7］。相反，基于實(shí)時(shí)PCR 的HPV 基因組檢測(cè)具有很高的靈敏度，而TCT 的明顯優(yōu)勢(shì)在于大大減少了阻礙視線的血液、粘液和炎細(xì)胞數(shù)量，提高篩查的準(zhǔn)確率［8，9］。本研究TTC 分型為SCC 中HR?HPV 感染率較高，采用HR?HPV 篩查可發(fā)現(xiàn)部分宮頸癌患者。然而，宮頸癌HR?HPV 篩查目的不是證實(shí)癌變患者HR?HPV 高感染率，而是在疾病早期發(fā)現(xiàn)更多的癌前病變患者，為后期治療爭(zhēng)取時(shí)間。

本研究發(fā)現(xiàn)，30~65歲組和>65歲組HR?HPVS陽(yáng)性率升高，>65歲組L?HPV 陽(yáng)性率降低，與21~29歲組比較，30~65 歲組、>65歲組HR?HPV 陽(yáng)性率均升高。TCT 檢查宮頸病變級(jí)別的增高，病理陽(yáng)性率隨之增加。有研究顯示，<20 歲組HR?HPV 感染率較高，但多為單次一過(guò)性HPV 感染陽(yáng)性，無(wú)長(zhǎng)期持續(xù)性感染，其組織學(xué)病理診斷多為陰性［10，11］，相比于HPV16+或HPV18+，HPV16 及HPV18 亞型感染率在不同病例分級(jí)（CNⅠ、CNⅡ、CNⅢ、SCC）中明顯升高，說(shuō)明宮頸病變病理級(jí)別與高危型HPV感染率呈正比趨勢(shì)，TCT+HR?HPV 檢測(cè)的陰性預(yù)測(cè)值均高于單獨(dú)的TCT 和HR?HPV 檢測(cè)，TCT+HR?HPV 檢測(cè)敏感度及特異度均高于單獨(dú)法，而聯(lián)合檢測(cè)的敏感度及特異度均最高。同時(shí)，16、18、31、58、73及82基因型與宮頸病變密切相關(guān)。有結(jié)果顯示［12］，宮頸病變等級(jí)與HPV 感染率以及TCT 陽(yáng)性率呈正比。HPV 感染和宮頸癌的相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)達(dá)到307.5。我們的研究結(jié)果與先前的研究一致。也有研究表明［13］，HR?HPV 檢測(cè)宮頸病變的敏感性和特異性分別為91.91%和84.46%。相比之下，細(xì)胞學(xué)檢查的相應(yīng)結(jié)果為80.51% 和83.12%。同時(shí)，TCT 結(jié)果與宮頸病變等級(jí)之間存在等級(jí)相關(guān)性。根據(jù)這些結(jié)果，HR?HPV 載量在診斷宮頸病變方面具有比TCT 更高的特異性，但敏感性更高［14?16］。此外，一項(xiàng)基于RCT 結(jié)果的薈萃分析發(fā)現(xiàn)，HPV檢測(cè)結(jié)果陰性的女性宮頸癌的發(fā)病率明顯降低。陰道鏡檢查程序與宮頸篩查有關(guān)的潛在不良反應(yīng)包括疼痛，出血，分泌物和焦慮癥。采用HPV 檢測(cè)可提高其特異性和陽(yáng)性預(yù)測(cè)價(jià)值，并減少對(duì)患者的不必要傷害。本結(jié)果顯示TCT 聯(lián)合HPV 分型檢測(cè)對(duì)宮頸病變的假陰性率較低，靈敏度更高，與先前研究結(jié)果相符。HPV 作為分流檢查的依據(jù)是在陰道鏡轉(zhuǎn)診之前根據(jù)細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果異常的人進(jìn)行的，以排除更多低危人群，從而減少了侵入性手術(shù)的機(jī)會(huì)，并為患者節(jié)約了醫(yī)療費(fèi)用。

目前，我國(guó)宮頸篩查計(jì)劃以“三步走”策略實(shí)施，包括TCT，HPV 檢測(cè)和陰道鏡檢查，并且以多種方式進(jìn)行，針對(duì)不同人群采用不同的篩查策略。其旨在以最低的成本篩查異常病例，并根據(jù)當(dāng)?shù)厍闆r選擇最佳的篩查方法，可以在有限的醫(yī)療費(fèi)用下為大多數(shù)女性帶來(lái)最大的收益［17，18］。因此，基層醫(yī)院應(yīng)擴(kuò)大宮頸的篩查范圍，為低成本篩查策略提供更多選擇。本研究也存在一定的局限性，納入的病例數(shù)有限，后期還需多中心、多樣本例數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證，已得到更加可靠的結(jié)果。

綜上所述，聯(lián)合篩查明顯提高診斷的靈敏度，漏診率明顯降低。HPV 在宮頸癌篩查中能夠?yàn)榕R床早期篩查提供理論基礎(chǔ)，并盡早發(fā)現(xiàn)宮頸癌前期誘因。